邢維媚，張銳，楊麗僑，張彩虹，殷慧敏，李麗花，蘆亞君

(海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院1、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院2，海南 海口 571199)

生物染色法在犬復(fù)孔絳蟲蟲種形態(tài)學(xué)鑒別中的應(yīng)用

邢維媚1，張銳1，楊麗僑2，張彩虹1，殷慧敏1，李麗花1，蘆亞君1

(海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院1、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院2，海南 ?？?571199)

目的調(diào)查?？谑腥c道內(nèi)寄生蟲——犬復(fù)孔絳蟲的流行情況，并研究不同生物染色劑對犬復(fù)孔絳蟲蟲體的染色效果，確定最佳染色方法作為蟲種形態(tài)學(xué)鑒別依據(jù)。方法使用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，選擇醋酸卡紅、齊爾石碳酸復(fù)紅、德氏蘇木素、孔雀綠及鹽酸卡紅五種不同的生物染色劑對蟲體節(jié)片在不同時(shí)間、不同濃度分別染色，并對這五種生物染色劑兩兩組合進(jìn)行復(fù)合染色，光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)并鑒別蟲種。二甲苯透明法和冬青油透明法處理蟲體節(jié)片，和染色法進(jìn)行效果比較。結(jié)果20%醋酸卡紅染色12 h、24 h和10%醋酸卡紅染色24 h時(shí)染色成節(jié)效果更佳；齊爾石碳酸復(fù)紅染液在48 h、72 h染色成節(jié)效果最佳；德氏蘇木素染液在8～20 h時(shí)染色孕節(jié)效果最佳；4%的孔雀綠在6 h時(shí)染色孕節(jié)效果最佳；鹽酸卡紅在4～8 h時(shí)染色孕節(jié)效果最佳；復(fù)合染色時(shí)石碳酸首染，孔雀綠復(fù)染效果最佳。透明法處理孕節(jié)片效果佳。結(jié)論選擇合適染色劑及確定最佳染色方案，可清晰觀察到絳蟲節(jié)片的形態(tài)結(jié)構(gòu)，有利于蟲種鑒別和病原學(xué)診斷。

犬復(fù)孔絳蟲；流行；染色

犬復(fù)孔絳蟲(Dipylidium caninum Linnaeus，1758)是一種犬、貓常見寄生蟲[1]，成蟲偶爾寄生于人體引起犬復(fù)孔絳蟲病[2]。人常因誤食含似囊尾蚴的病蚤而感染。該蟲流行廣泛，在很多國家和地區(qū)均有散在的病例報(bào)道[3-5]，我國也有數(shù)例報(bào)道，分散于北京、遼寧、山西等地[6]。人感染犬復(fù)孔絳蟲后，表現(xiàn)為食欲不振、消化不良、腹痛、腹瀉、煩躁不安等癥狀[6-9]，給人類健康尤其是兒童的身心健康帶來極大危害。

犬復(fù)孔絳蟲的病原學(xué)診斷主要依靠在糞便中查到蟲體，并根據(jù)其典型的形態(tài)結(jié)構(gòu)確定蟲種。生物染色法能提供犬復(fù)孔絳蟲蟲體各節(jié)片最直觀的鑒別依據(jù)。若染色效果不佳，則難于做確診的依據(jù)。本文選擇常見生物學(xué)染料，對犬復(fù)孔絳蟲各節(jié)片進(jìn)行染色效果評價(jià)，探索最佳染色效果的染色方法，便于對絳蟲蟲種的形態(tài)學(xué)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 于海南省海口市某狗肉店取犬小腸，洗脫犬腸道獲取全部絳蟲。

1.1.2 試劑 蘇木素精、冬青油、銨明礬、甘油、甲醇、濃鹽酸、濃氨水、二甲苯、無水乙醇、中性樹膠購于西隴化工股份有限公司；卡紅購于西亞試劑；孔雀綠購于天津市天新精細(xì)化工開發(fā)公司；齊爾石碳酸復(fù)紅染液購于福建廈門海標(biāo)科技有限公司。

1.2 染色法

1.2.1 醋酸卡紅染色法 配制5%、10%、15%和20%的醋酸卡紅染液。經(jīng)5%福爾馬林固定的節(jié)片，分別于蒸餾水、30%酒精、50%酒精中漂洗30 min，在70%酒精中固定2～48 h，放于5%～20%醋酸卡紅染液中6～24 h，2%鹽酸酒精以分色和不分色兩種方法處理標(biāo)本，再放入70%、80%、90%、95%、100%、100%梯度酒精中20 min，二甲苯至透明，中性樹膠封片[10]。按照染液的不同濃度、不同染色時(shí)間及是否分色三個(gè)要素進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)。

表1 不同染色時(shí)間對絳蟲節(jié)片染色效果比較

1.2.2 齊爾石碳酸復(fù)紅染色法 經(jīng)5%福爾馬林固定的節(jié)片，分別放入蒸餾水、30%酒精、50%酒精中漂洗30 min，在70%酒精中固定8 h，使用齊爾石碳酸復(fù)紅染液染色24～120 h，2%鹽酸酒精以分色和不分色兩種方法處理標(biāo)本，再放入80%、90%、95%、100%、100%梯度酒精中20 min，二甲苯至透明，中性樹膠封片[11]。按照染液的不同染色時(shí)間及是否分色兩個(gè)要素進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)。

表2 不同染色時(shí)間及是否分色對絳蟲成蟲成節(jié)的染色效果比較

1.2.3 德氏蘇木素染色法 經(jīng)福爾馬林固定的節(jié)片，分別放入蒸餾水、30%酒精、50%酒精中漂洗30 min，在70%酒精中固定2～48 h；放入70%、50%、30%的酒精中30 min，蒸餾水10 min，放入稀釋了15倍的德氏蘇木素染液中8～20 h，蒸餾水沖洗3次，30%、50%、70%酒精中20 min，2%鹽酸酒精以分色和不分色兩種方法處理標(biāo)本，再放入80%、90%、95%、100%、100%梯度酒精中20 min，二甲苯至透明，中性樹膠封片[12]。按照染液的不同染色時(shí)間及是否分色兩個(gè)要素進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表3)。

表3 不同染色時(shí)間對絳蟲成蟲成節(jié)的染色效果比較

1.2.4 孔雀綠染色法(孕節(jié)) 配置2%、4%、6%、8%孔雀綠溶液。經(jīng)5%福爾馬林固定的節(jié)片，分別放入蒸餾水、30%酒精、50%酒精中漂洗30 min，在70%酒精中固定2～48 h；放入70%、50%、30%的酒精中30 min，蒸餾水10 min，放入染液中1～6 h，蒸餾水洗去蟲體表面的浮色，2%鹽酸酒精以分色和不分色兩種方法處理標(biāo)本，再放入30%、50%、70%，80%、90%、95%、100%、100%梯度酒精中20 min，二甲苯至透明，中性樹膠封片[13-15]。按照染液的不同濃度、不同染色時(shí)間及是否分色三個(gè)要素進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表4)。

表4 不同濃度及染色時(shí)間對絳蟲成蟲孕節(jié)的染色效果比較

1.2.5 鹽酸卡紅染色法 配置2%鹽酸卡紅染劑。經(jīng)5%福爾馬林固定的節(jié)片，分別放入蒸餾水、30%、50%酒精中30 min，在70%酒精中固定2～48 h；70%酒精30 min，鹽酸卡紅溶液染色4～16 h，70%酒精沖洗染液2～3次30 min，2%鹽酸酒精以分色和不分色兩種方法處理標(biāo)本，放入80%、90%酒精2 h，95%酒精30 min、15 min，100%酒精10 min、5 min，二甲苯至透明，中性樹膠封片[16]。按照染液的不同染色時(shí)間及是否分色兩個(gè)要素進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表5)。

1.2.6 復(fù)合染色法 絳蟲可能會(huì)與兩種不同染料結(jié)合而使其染色效果明顯。因此，在篩選染液的最佳條件后，使兩種不同染液結(jié)合染色，即第一種染液染完后并除去表面浮色，接著染第二種染液，加入第二種染液時(shí)間段設(shè)計(jì)為：5 s、30 s、1 min、3 min、5 min，按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法使染液兩兩進(jìn)行復(fù)合染色，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下(表6)。

表5 鹽酸卡紅染色在不同時(shí)間下的染色效果比較

表6 不同染液復(fù)合染色效果比較

1.3 孕節(jié)片透明法

1.3.1 二甲苯透明法 經(jīng)福爾馬林固定的節(jié)片，放入蒸餾水2次，30%、50%酒精中30 min，在70%酒精中固定2～48 h；再按70%、80%、90%、95%、100%、100%酒精中20 min，二甲苯至透明，中性樹膠封片。

1.3.2 冬青油透明法 自保存液中取出，放入3:1的石碳酸與95%酒精溶液中至節(jié)片完全透明后，放入冬青油中15 min，中性樹膠封片。

2 結(jié) 果

2.1 犬復(fù)孔絳蟲流行病學(xué)調(diào)查 在18條狗的腸道內(nèi)獲取1 021條犬復(fù)孔絳蟲，1條闊節(jié)裂頭絳蟲。

2.2 染色法

2.2.1 醋酸卡紅染色 20%醋酸卡紅染色12 h、24 h和10%醋酸卡紅染色24 h，在分色情況下對犬絳蟲的成節(jié)染色效果更佳，標(biāo)本內(nèi)部的結(jié)構(gòu)清晰，卵巢的分葉及睪丸的個(gè)數(shù)及生殖孔位置都易于觀察(圖1)。20%醋酸卡紅染色6 h，在分色情況下對犬絳蟲頭節(jié)染色效果更佳，能清楚的看到吸盤、頂突及小鉤(圖2)。

2.2.2 齊爾石碳酸復(fù)紅染色 齊爾石碳酸復(fù)紅染液染色48 h、72 h，在分色情況下對犬絳蟲的成節(jié)染色清楚，標(biāo)本透亮，結(jié)構(gòu)清晰可辨，卵巢的分葉及睪丸的個(gè)數(shù)及生殖孔位置都易于觀察(圖3)。

圖1 犬復(fù)孔絳蟲成節(jié)(10%醋酸卡紅染色24 h)10×2倍鏡觀察

圖2 犬復(fù)孔絳蟲頭節(jié)(20%醋酸卡紅染色6 h)10×20倍鏡觀察

圖3 犬復(fù)孔絳蟲成節(jié)(齊爾石碳酸復(fù)紅染色48 h)10×2倍鏡觀察

2.2.3 德氏蘇木素染色法 德氏蘇木素染色法染色時(shí)間8～20 h在分色情況下染色孕節(jié)效果良好。能觀察到孕節(jié)片標(biāo)本中有數(shù)量不一的儲(chǔ)卵囊，囊中能細(xì)數(shù)卵細(xì)胞的個(gè)數(shù)(圖4)。

圖4 犬復(fù)孔絳蟲孕節(jié)(德氏蘇木素染色12 h)10×2倍鏡觀察

2.2.4 孔雀綠 4%的孔雀綠在6 h不分色情況下染色孕節(jié)效果最佳，都能觀察到孕節(jié)片標(biāo)本中有數(shù)量不一的儲(chǔ)卵囊，囊中能細(xì)數(shù)卵細(xì)胞的個(gè)數(shù)。而且耗時(shí)相對較少(圖5)。

圖5 犬復(fù)孔絳蟲孕節(jié)(4%孔雀綠染色6h)10×2倍鏡觀察

2.2.5 鹽酸卡紅 鹽酸卡紅染色時(shí)間4～8 h在分色情況下染色孕節(jié)效果最佳，著色均勻，易于觀察，節(jié)片結(jié)構(gòu)清晰，儲(chǔ)卵囊明顯，卵細(xì)胞顆粒盡數(shù)(圖6)。

2.2.6 復(fù)合染色法 復(fù)合染色法石碳酸首染，孔雀綠復(fù)染效果最佳，能看到孕節(jié)片清晰透亮，并有儲(chǔ)卵囊，內(nèi)有卵細(xì)胞(圖7)。

圖6 犬復(fù)孔絳蟲孕節(jié)(鹽酸卡紅染色8 h)10×2倍鏡觀察

圖7 犬復(fù)孔絳蟲孕節(jié)(石碳酸首染，孔雀綠復(fù)染)10×2倍鏡觀察

2.3 透明法

2.3.1 二甲苯透明法 透明法用來制作孕節(jié)片效果佳，結(jié)構(gòu)清晰，節(jié)片中的儲(chǔ)卵囊清晰可見，內(nèi)有卵細(xì)胞，而且耗材少(圖8)。

圖8 犬復(fù)孔絳蟲孕節(jié)(二甲苯透明法)10×2倍鏡觀察

2.3.2 冬青油透明法 冬青油透明法用來制作孕節(jié)片效果佳，結(jié)構(gòu)清晰節(jié)片中的儲(chǔ)卵囊清晰可見，內(nèi)有卵細(xì)胞，而且相對染色法較簡單、省時(shí)(圖9)。

圖9 犬復(fù)孔絳蟲孕節(jié)(冬青油透明法)10×2倍鏡觀察

3 討 論

犬絳蟲頭節(jié)有無頂突和小鉤、成節(jié)的子宮位置及分葉情況和睪丸數(shù)量的多少、孕節(jié)是否有儲(chǔ)卵囊及囊中卵細(xì)胞數(shù)量的多少或子宮分支情況等是犬絳蟲蟲種鑒別的重要依據(jù)。因此制作結(jié)構(gòu)清晰、易于觀察的永久玻片標(biāo)本是犬絳蟲蟲種鑒定的前提保證，本文圖中結(jié)果是犬復(fù)孔絳蟲[6，17]。絳蟲染色過程很復(fù)雜，一份絳蟲染色標(biāo)本是由染液和被染標(biāo)本發(fā)生復(fù)雜的物理和化學(xué)反應(yīng)，才能使其各個(gè)組織結(jié)構(gòu)染上了不同的色彩[18]。在制作標(biāo)本過程中，染色時(shí)間的長短、染液濃度、是否分色和分色程度[19]及脫水過程的控制等對標(biāo)本的順利完成起著舉足輕重的作用，缺一不可；絳蟲背腹的厚薄程度也決定染液的濃度及染色時(shí)間，需據(jù)絳蟲的大小及厚薄等來設(shè)計(jì)時(shí)間及染液濃度。

絳蟲的形態(tài)學(xué)染色方法操作簡單，易掌握，適用于臨床、科研及教學(xué)，值得推廣。

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Application of biological staining method in morphological identification of Dipylidium caninum.

XING Wei-mei1,ZHANG Rui1,YANG Li-qiao2,ZHANG Cai-hong1,YIN Hui-min1,LI Li-hua1,LU Ya-jun1.School of Tropical and Laboratory1,School of Basic Medicine and Life Science2,Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the prevalence of canine intestinal parasites,Dipylidium caninum,in Haikou.The staining effects of different biological stains on Dipylidium caninum was studied and the best staining method was determined as the basis of morphologic identification.MethodsThe orthogonal design was used to design an experimental matrix to study the staining effects of five different biological stains(such as acetate carmine,carbol fuchsin,delafields hematoxylin,malachite green and hydrochloride carmine)on different parts of the body,at different time and different concentrations.Moreover,these five biological stains were combined in pairwise to stain specimens.The morphological structure was observed and identified under optical microscope,compared with Xylene transparent method and Holly oil transparent method to process proglottids.ResultsThe staining effects of mature proglottids were better when specimens were treated by 20%acetate carmine for 12 h,24 h,10%acetate carmine for 24 h and carbol fuchsin for 48 h,72 h.The best staining effects of gravid proglottids were observed when they were stained with delafields hematoxylin for 8～20 h,4%malachite green for 6 h and hydrochloride carmine for 4～8 h.If using combined staining method,the best staining result was obtained from carbol fuchsin-malachite green pairwise staining method.Optimal staining method for gravid proglottid is transparent method.ConclusionChoosing the suitable staining agent and optimal staining method is helpful to clearly observe the structures of tapeworms and is useful for species identification and pathogen diagnosis.

Dipylidium caninum;Prevalence;Staining

R383.3

A

1003—6350（2017）22—3691—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.22.025

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號：201611810074）；海南醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號：HYCX2015019）

蘆亞君。E-mail：luyajuncc@163.com

2017-04-11)