鄧棋芳，周瑞，王霞，戚懷琬

(深圳市龍華人民醫(yī)院產(chǎn)一科，廣東 深圳 518000)

Toll樣受體在早發(fā)型重度子癇前期患者外周血和胎盤組織中的表達及臨床意義

鄧棋芳，周瑞，王霞，戚懷琬

(深圳市龍華人民醫(yī)院產(chǎn)一科，廣東 深圳 518000)

目的探討子癇前期患者外周血及胎盤組織中Toll樣受體4(TLR4)的表達及其臨床意義。方法選取2015年3月至2016年3月深圳市龍華人民醫(yī)院產(chǎn)一科收治的早發(fā)型重度子癇前期患者47例為觀察組，以及同期入院體檢健康的正常孕婦47例為對照組。采用RT-PCR檢測患者外周血單個核細胞TLR4 mRNA表達，采用免疫組織化學(xué)法檢測患者胎盤組織TLR4蛋白的表達。結(jié)果觀察組和對照組外周血單個核細胞TLR4 mRNA的相對表達量分別為(0.69±0.14)和(0.27±0.05)，觀察組明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；觀察組胎盤組織TLR4蛋白表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論早發(fā)型重度子癇前期患者血清和胎盤組織中TLR4的水平明顯升高，提示TLR4可能參與了早發(fā)型重度子癇前期的發(fā)病。

早發(fā)型重度子癇前期；外周血；胎盤組織；Toll樣受體4

子癇前期是臨床常見妊娠期并發(fā)癥，歸屬于妊娠期高血壓疾病范疇，患者臨床癥狀主要以高血壓和蛋白尿等為主[1]。在我國，有5%～7%的妊娠期婦女會發(fā)生子癇前期，該病是引起圍產(chǎn)期母嬰死亡的重要危險因素[2]。臨床上以孕34周為分界線，將子癇前期劃分為早發(fā)型和晚發(fā)型，多數(shù)學(xué)者均認為早發(fā)型和晚發(fā)型子癇前期的發(fā)病機制不同，對妊娠結(jié)局的影響也不同，其中早發(fā)型子癇前期發(fā)病早、病情進展迅速，出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥的概率要遠遠大于晚發(fā)型，易引起嚴重不良妊娠結(jié)局，已成為國內(nèi)外產(chǎn)科醫(yī)生亟待解決的棘手問題[3-4]。Toll樣受體4(Toll-like receptors 4，TLR4)在妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病等多種妊娠期疾病患者中呈高表達。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，孕期TLR4介導(dǎo)的母體固有免疫系統(tǒng)增強與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān)，在妊娠的各個階段，外源性和內(nèi)源性的配體都能激活TLR4，釋放炎癥因子、損傷血管以及誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞凋亡，與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān)[5-6]。本研究通過分析47例早發(fā)型重度子癇前期患者外周血及胎盤組織中TLR4表達，探討TLR4在早發(fā)型重度子癇前期患者外周血及胎盤組織中的表達及意義，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年3月至2016年3月在深圳市龍華人民醫(yī)院產(chǎn)一科經(jīng)診斷確診為早發(fā)型重度子癇前期的患者47例為觀察組，選取同期體檢健康的正常孕婦為對照組。觀察組患者21～34歲，平均(25.3±4.1)歲；孕期21～33周，平均(30.7±3.1)周。對照組孕婦21～33歲，平均(26.1±4.7)歲，孕期22～33周，平均(31.1±3.4)周。納入標準：符合《婦產(chǎn)科學(xué)(第八版)》對早期重度子癇前期的診斷[7]：①處于妊娠期的第20周到第34周；②24 h蛋白尿≥500 mg；③收縮壓≥160 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)或/和舒張壓≥110 mmHg；④谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高異常；⑤血清肌酐＞106μmol/L；⑥血小板下降；⑦出現(xiàn)頭痛以及上腹部不適等。排除標準：①伴妊娠期糖尿病等其它妊娠期并發(fā)癥；②既往高血壓或(和)糖尿病史；③多胎。所有研究對象均簽署知情同意書，且本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。兩組孕婦的年齡、體質(zhì)量指數(shù)、孕周、初潮年齡、生育史、流產(chǎn)史、血樣采集和胎盤組織留取孕周等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩組產(chǎn)婦的基本資料比較(x-±s)

1.2 標本采集 入院時，采用檸檬酸鈉抗凝采血管采集產(chǎn)婦肘靜脈血4 mL，-20℃冷柜保存待測。正常娩出胎盤后，取近臍帶3 cm處胎盤組織1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm，無菌磷酸緩沖鹽溶液洗凈后，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，切片4 μm，37℃干燥，4℃保存待檢。

1.3 RT-PCR檢測外周血單個核細胞TLR4 mRNA表達 取出4℃保存的外周抗凝血，采用Ficoll法提取外周血單個核細胞。采用Trizol法提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進行RT-PCR擴增。參照文獻[8]，設(shè)計TLR4及β-actin引物，委托上海生工生物有限公司合成。TLR4引物上游：5'-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3'，引物下游：5'-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3'；β-actin 引 物 上游：5'-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3'，引物下游：5'-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATC-3'。RT-PCR 擴增條件：94℃/5 min，(94℃/30 s、60℃/40 s、72℃/90 s，共 35 個 循 環(huán))，最 后 72℃/10 min。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用Bio-Rad軟件分析條帶灰度值，TLR4 mRNA相對表達量=TLR4灰度值/β-actin灰度值。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測胎盤組織TLR4蛋白表達 檢測操作步驟按照人TLR4免疫組化檢測試劑盒(Santa Cruz Bicycles公司，美國)的說明進行：取出4℃保存的4 μm胎盤組織切片，60℃烤片2 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；37℃的3%H2O2溶液孵育10 min，檸檬酸高壓抗原修復(fù)法修復(fù)；磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，加入鼠抗人TLR4一抗工作液，4℃孵育24 h；PBS洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗工作液，37℃孵育0.5 h；顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇水化，二甲苯透明，最后封片。采用綜合評分法進行評估，染色強度評分：強染色3分，中度染色2分，弱染色1分。陽性細胞比例評分：11%～50%比例2分，51%～75%比例3分，＞75%比例4分。綜合染色強度和陽性細胞比例進行分析：2～3分弱陽性，4～5分中等陽性，6～7分強陽性。此外，無論染色的強度如何，只要細胞陽性比例＜10%，都認為是陰性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，組間比較采用t檢驗，兩組患者胎盤組織TLR4蛋白表達采用非參數(shù)秩和檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組產(chǎn)婦外周血單個核細胞TLR4 mRNA表達比較 觀察組和對照組外周血單個核細胞TLR4 mRNA相對表達量分別為(0.69±0.14)和(0.27±0.05)，觀察組明顯大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.369，P＜0.05)，見圖1。

圖1 RT-PCR檢測兩組產(chǎn)婦外周血單個核細胞TLR4 mRNA表達

2.2 兩組產(chǎn)婦胎盤組織TLR4蛋白表達比較 觀察組胎盤組織TLR4蛋白強陽性23例，中等陽性13例，弱陽性8例，陰性3例；對照組胎盤組織LTR4蛋白強陽性7例，中等陽性9例，弱陽性12例，陰性19例。經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗顯示，觀察組胎盤組織TLR4的表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=4.635，P＜0.05)，見表2和圖2。

表2 兩組產(chǎn)婦胎盤組織TLR4蛋白表達情況（例）

圖2 免疫組化檢測兩組產(chǎn)婦胎盤組織中TLR4蛋白表達(×400)

3 討 論

現(xiàn)代生殖免疫學(xué)認為胚胎是攜帶父方抗原的同種異體物，妊娠從受精卵著床開始，母體的固有免疫系統(tǒng)識別其為“異己”，即啟動了母體內(nèi)免疫應(yīng)答。母體通過多種途徑建立和維持母胎免疫耐受，當免疫耐受失衡時，機體釋放大量炎癥因子，損傷血管內(nèi)皮細胞，引起全身小動脈痙攣，最終導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生[9]。TLR4屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要表達于樹突狀細胞和巨噬細胞等免疫細胞，是母體固有免疫系統(tǒng)的重要組成，在人類天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用[10]。

子癇前期患者TLR4處于高反應(yīng)性狀態(tài)，當受到外界刺激而活化時，TLR4下游的蛋白轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B通過其胞漿作用域與髓樣分化因子88(MyD88)的羧基末端作用形成復(fù)合物。該復(fù)合物通過MyD88的死亡結(jié)構(gòu)閾與IL-1R相關(guān)激酶(IRAK)相互作用并使其磷酸化。磷酸化的IRAK與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNAF6)相結(jié)合并使其活化?；罨腡NAF6與NF-κB抑制蛋白(IκB)相互作用使其磷酸化降解。如此，NF-κB得以激活并轉(zhuǎn)入細胞核中，誘導(dǎo)其下游TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-12等炎癥因子表達，從而引起劇烈的炎癥反應(yīng)[11-12]。趙先蘭等[13]以及Kim等[14]學(xué)者研究證實子癇前期患者胎盤組織中TLR4的表達明顯高于正常妊娠孕婦。Xie等[15]研究表明子癇前期患者外周血白細胞中TLR4的表達明顯上調(diào)。武孟香等[16]證實，子癇前期患者外周血單個核細胞中TLR4的表達明顯上調(diào)，而且重度子癇前期患者TLR4表達水平明顯高于輕度子癇前期患者。子癇前期患者血清TNF-α等炎癥因子水平明顯高于正常妊娠孕婦，且重度子癇前期患者TNF-α水平明顯高于輕度子癇前期患者。以上研究提示，TLR4介導(dǎo)的母體固有免疫系統(tǒng)增強，不僅在子癇前期的發(fā)病機制中扮演重要角色，而且與疾病的進展和嚴重程度有關(guān)?；谝陨涎芯?，本課題小組分析了子癇前期患者外周血以及胎盤組織中TLR4的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者外周血單個核細胞中TLR4表達水平明顯高于對照組，胎盤組織中TLR4蛋白的表達也明顯高于對照組。說明子癇前期患者TLR4表達明顯上調(diào)，進而激活其下游NF-κB，誘導(dǎo)炎癥因子表達，并最終導(dǎo)致子癇前期發(fā)病。

綜上所述，子癇前期患者外周血單個核細胞，以及胎盤組織中TLR4表達明顯增強，說明TLR4與子癇前期的發(fā)病有關(guān)，推測可能與TLR4介導(dǎo)的母體固有免疫反應(yīng)中NF-κB的激活及其下游炎癥因子的表達有關(guān)。由于條件所限，本研究并未對此種猜測進行驗證，深入探討TLR4與子癇前期發(fā)病的關(guān)系尚需更多、更全面的研究，這也是本課題小組下一步研究的方向。

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Expression of Toll-like receptors in peripheral blood and placental tissue of preeclampsia patients and its clinical significance.

DENG Qi-fang,ZHOU Rui,WANG Xia,QI Huai-wan.The First Department of Obstetrics,Longhua People's Hospital of Shenzhen City,Shenzhen 518000,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of Toll-like receptors-4 in peripheral blood and placental tissue in preeclampsia patients and its clinical significance.MethodsFrom March 2015 to March 2016,a total of 47 cases of patients with early onset severe preeclampsia,who admitted to The First Department of Obstetrics of Longhua People's Hospital of Shenzhen City,were selected as the observation group,while 47 cases of normal pregnant people were selected as the control group.The peripheral blood and placental tissue of two groups were collected.The expression of TLR4 mRNA in peripheral blood mononuclear cells was detected by RT-PCR,and the expression of TLR4 protein in placenta tissue was detected by immunohistochemistry.ResultsThe expression of TLR4 mRNA in peripheral blood mononuclear cells of the observation group was(0.69±0.14),which was significantly higher than(0.27±0.05)in the control group(P＜0.05).The expression of TLR4 protein in placental tissue of observation group was significantly higher than that in the control group(P＜0.05).ConclusionThe expression of TLR4 in in peripheral blood and placental tissue in preeclampsia patients was significantly enhanced,suggesting that TLR4 may be related to the early onset of severe preeclampsia.

Early onset severe preeclampsia;Peripheral blood;Placental tissue;Toll-like receptors-4(TLR4)

R714.24+5

A

1003—6350（2017）22—3642—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.22.009

鄧棋芳。E-mail：caixichao2015@163.com

2017-06-08)