呂永楠，徐紅新，王京偉，張宗瑋

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科1、檢驗(yàn)科2，湖北 武漢 430060)

湖北地區(qū)一擴(kuò)張型心肌病家系致病基因篩查

呂永楠1，徐紅新1，王京偉2，張宗瑋1

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科1、檢驗(yàn)科2，湖北 武漢 430060)

目的對(duì)湖北地區(qū)一個(gè)擴(kuò)張型心肌病家系成員進(jìn)行致病候選基因篩查，尋求家族性擴(kuò)張型心肌病致病基因，探討基因型和表型關(guān)系。方法先證者及其家族成員來自湖北省大冶市，先證者于2017年4月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院確診為擴(kuò)張型心肌病，已有家族成員死亡。詳細(xì)詢問先證者及其家屬成員病史、家族史，并進(jìn)行體格檢查、血液指標(biāo)、心臟超聲和心電圖檢查。對(duì)患者的病史、家族史及檢查結(jié)果分析。與先證者及其家屬簽訂知情同意書，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院臨床分子診斷中心對(duì)先證者候選致病基因全外顯子高通量測(cè)序，獲得可疑突變后，利用Sanger測(cè)序驗(yàn)證家系成員是否存在可疑突變。結(jié)果家系先證者(Ⅲ3)和妹妹(Ⅲ2)攜帶肌聯(lián)蛋白(TTN)c.100126A＞G（P.Thr33376Ala）錯(cuò)義突變。先證者目前心功能下降并伴有惡性心律失常，而其妹妹無明顯臨床癥狀，心臟超聲檢查無異常。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)湖北地區(qū)一家族性擴(kuò)張型心肌病家系存在TTN基因c.100126A＞G（p.Thr33376Ala）錯(cuò)義突變，TTN與擴(kuò)張型心肌病密切相關(guān)，是家族性擴(kuò)張型心肌病重要致病基因。

擴(kuò)張型心肌病；基因突變；肌聯(lián)蛋白

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一種以左室或雙心室擴(kuò)張伴有收縮功能損害為特點(diǎn)的心肌病，主要臨床癥狀表現(xiàn)為心力衰竭、心律失常和栓塞性中風(fēng)，更嚴(yán)重的是心源性猝死，5年內(nèi)患者病死率達(dá)15%～50%[1]。研究發(fā)現(xiàn)約30%～50%擴(kuò)張型心肌病患者具有家族性遺傳，稱為家族性擴(kuò)張型心肌病(familial dilated cardiomyopathy，F(xiàn)DCM)[2]?；颊甙l(fā)病年齡在20～30歲之間，病情進(jìn)展快，生活質(zhì)量差和預(yù)后不佳，死亡率高。目前除了心臟移植沒有徹底的治療辦法，早期診斷和干預(yù)是延緩患者病情進(jìn)展的有效手段。家族性擴(kuò)張型心肌病顯著的遺傳特征，主要由基因突變所致，其最大的遺傳特征為臨床遺傳異質(zhì)性。已明確與家族性擴(kuò)張型心肌病相關(guān)的致病基因約為65個(gè)，遺傳模式主要表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳[3]。本研究對(duì)一個(gè)擴(kuò)張型心肌病家系成員進(jìn)行了基因篩查，為早期篩查和干預(yù)擴(kuò)張型心肌病提供候選基因。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 先證者及其家族成員來自湖北省大冶市，先證者于2017年4月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院確診為擴(kuò)張型心肌病，已有家族成員死亡。

1.2 臨床資料 詳細(xì)詢問先證者及其家屬成員病史、家族史，根據(jù)患者描述，制作患者家系系譜圖(見圖1)，對(duì)先證者進(jìn)行體格檢查、血液指標(biāo)、心臟超聲和心電圖檢查等檢查，對(duì)家族成員行心臟超聲檢查。

1.3 基因篩查 本研究與先證者及其家屬簽訂知情同意書。由武漢大學(xué)人民醫(yī)院臨床分子診斷中心對(duì)先證者候選致病基因全外顯子高通量測(cè)序，獲得可疑突變后，利用Sanger測(cè)序驗(yàn)證家系成員是否存在可疑突變。

2 結(jié) 果

2.1 一般臨床情況 患者，男，46歲。近一周上樓或活動(dòng)量大時(shí)感胸悶、喘氣不適，伴乏力，經(jīng)休息后可減輕，不伴咳嗽、咳血，無胸痛、頭昏等不適，未予以特殊處理，近2 d來患者感上述癥狀加重，活動(dòng)耐量下降，伴夜間不能平臥入睡。查體：血壓(BP)130/80 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，呼吸(R)26次/min，心率(P)88次/min，體溫(T)36.3℃，神清，精神可，全身皮膚黏膜未見出血點(diǎn)、黃染，全身淺表淋巴結(jié)未及腫大，頸靜脈無怒張，頸軟，雙肺呼吸音清，左下肺可聞及細(xì)濕啰音，心界向左下擴(kuò)大，P 88次/min，律齊，未聞及明顯雜音。腹平軟，無壓痛及反跳痛，肝脾肋下未及，雙腎區(qū)無叩痛，雙下肢無水腫。輔助檢查：心臟超聲—左房內(nèi)徑(LAD)=50 mm，左心室舒張期內(nèi)徑(LVDd)=62 mm，右房內(nèi)徑(RAD)=41 mm，右心室直徑(RVD)=21 mm，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF%)=35%。長程心電圖：竇性心律，平均心率72次/min，室性早搏2 357個(gè)，短陣室速32陣。N端前腦鈉肽(NT-proBNP)8 734 ng/L。

2.2 發(fā)病家族成員情況 Ⅰ1和Ⅰ2死亡原因不明，Ⅱ1和Ⅱ2診斷為擴(kuò)張型心肌病，已死亡。Ⅲ5是先證者弟弟，于26歲死亡。Ⅲ7是先證者姐姐，于33歲死亡。Ⅲ2是先證者妹妹，年齡43歲，目前未發(fā)病。心臟超聲檢：LAD=26 mm，LVDd=41 mm，RAD=31 mm，RVD=18 mm，LVEF%=60%。Ⅳ1～Ⅳ7目前未發(fā)病，心臟超聲檢查無明顯異常(見圖1)。

圖1 擴(kuò)張型心肌病患者家系系譜圖

2.3 候選基因篩查結(jié)果 實(shí)驗(yàn)室對(duì)受檢者外周血提取基因組DNA采用Life Technologies公司Ion PGM高通量測(cè)序儀檢測(cè)ACTC1、ACTN2等65個(gè)擴(kuò)張性心肌病病相關(guān)基因，并使用Ion Reporter數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，受檢者共發(fā)現(xiàn)583個(gè)變異，通過分析ClinVar數(shù)據(jù)庫、UCSC數(shù)據(jù)庫Common SNPs、dbSNP 數(shù)據(jù)庫及 1000-genome-project MAF≥1%的常見突變，濾除無功能的同義突變和內(nèi)含子突變，得到候選有害或可能有害突變5個(gè)(見表1)。通過SIFT和PROVEAN預(yù)測(cè)變異的有害性，其中c.100126A＞G(p.Thr33376Ala)變 異 為 Del eterious/Damaging，c.49762G＞A(p.Val16588Met)變異為 Neutral/Damaging；c.17456G＞A(p.Arg5819Gln)變 異 為Neutral/Tolerated；c.15758C＞T(p.Thr5253Ile)變 異 為Deleterious/Tolerated。根據(jù)已知的家族發(fā)病史，初步認(rèn)定c.100126A＞G(p.Thr33376Ala)變異可能為致病變異，該位點(diǎn)致病可能表現(xiàn)常染色體顯性遺傳(見圖2)。

圖2 Sanger法序列驗(yàn)證先證者結(jié)果

表1 先證者基因突變結(jié)果

2.4 家系成員Sanger測(cè)序結(jié)果 根據(jù)先證者候選基因篩查結(jié)果，對(duì)獲取的家族人員血液標(biāo)本進(jìn)行c.100126A＞G(p.Thr33376Ala)基因Sanger測(cè)序，結(jié)果提示Ⅲ2是突變基因攜帶者(見圖3)。

圖3 Sanger法序列驗(yàn)證Ⅲ2結(jié)果

3 討 論

擴(kuò)張型心肌病的遺傳模式主要表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，但少部分也存在其他遺傳模式：常染色體隱性遺傳、X連鎖遺傳和線粒體DNA遺傳。本研究檢測(cè)涵蓋擴(kuò)張型心肌病發(fā)病相關(guān)的致病基因有65個(gè)，但約75%的擴(kuò)張型心肌病患者都集中在以下幾個(gè)基因上：肌聯(lián)蛋白(TTN)、心臟β-肌球蛋白重鏈(MYH7)、心肌肌球蛋白結(jié)合蛋白C(MYBPC3)、核纖層蛋白A/C(LMNA)、電壓門控-鈉通道α亞基(SCN5A)、心臟肌鈣蛋白T 2(TNNT2)、心臟肌鈣蛋白I 3(TNNI3)、心臟α-肌球蛋白重鏈(MYH6)、mtDNA和受磷蛋白(PLN)[4-6]。

本研究發(fā)現(xiàn)這一擴(kuò)張型心肌病家系存在TTN基因突變，突變位點(diǎn)為c.100126A＞G(p.Thr33376Ala)。TTN編碼巨蛋白肌聯(lián)蛋白，肌聯(lián)蛋白是肌小節(jié)的重要組成單元，由大約33 000個(gè)氨基酸組成，在心臟功能中起著重要作用[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)，25%的家族性擴(kuò)張型心肌病是由TTN基因突變引起，TTN是擴(kuò)張型心肌病的主要致病基因[8]。25%的擴(kuò)張型心肌病患者可通過二代基因檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)TTN截?cái)嗤蛔?，特別是雜合子的TTN截?cái)嗤蛔円呀?jīng)被報(bào)道是擴(kuò)張型心肌病的最常見遺傳因素[9]。此外，Herman等[8]還發(fā)現(xiàn)TTN突變還包括錯(cuò)義突變、無義突變、框移突變和重復(fù)數(shù)突變，這些突變都可以改變氨基酸序列，并將他們歸類為TTN截?cái)嗤蛔?。通過對(duì)湖北地區(qū)這一擴(kuò)張型心肌病家系基因篩查研究結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)TTN基因c.100126A＞G(p.Thr33376Ala)位點(diǎn)突變?yōu)殄e(cuò)義突變，先證者和Ⅲ2均是此基因攜帶者，先證者已發(fā)病，但Ⅲ2目前無癥狀及心臟超聲檢查結(jié)果無異常，可能為遺傳異質(zhì)性導(dǎo)致，修飾基因可能在其中起到了重要作用。

遺傳因素在家族性擴(kuò)張型心肌病病理發(fā)展過程中起到了重要的作用，從基因水平尋找家族性擴(kuò)張型心肌病發(fā)病機(jī)制具有意義，能夠早期輔助臨床診斷疾病，并預(yù)測(cè)患者疾病風(fēng)險(xiǎn)，制定個(gè)體化治療方案，將為家族性擴(kuò)張型心肌病的診斷和治療開辟新的途徑。但是臨床實(shí)踐中，基因檢測(cè)仍然面臨著許多問題和挑戰(zhàn)，例如基因型和表型之間的差異，但是隨著新一代基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，分子遺傳的研究將有助于明確基因型和表型之間的關(guān)系。

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Mutation screening for the causative gene in a dilated cardiomyopathy pedigree of Hubei province.

LV Yong-nan1,XU Hong-xin1,WANG Jing-wei2,ZHANG Zong-wei1.Department of Cardiology1,Department of Clinical Laboratory2,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo screen the candidate pathogenic gene among family members of a dilated cardiomyopathy(DCM),and find the relationship between the genotype and the phenotype.MethodsThe proband and family members came from Daye City,Hubei Province.The proband was diagnosed with dilated cardiomyopathy at Renmin Hospital of Wuhan University in April 2017,and some of his family member were dead then.The inheritance atlas was drawn,and analysis of genetic characteristics and clinical phenotype was performed.The candidated gene exon of the proband was sequenced by high-throughput sequencing,and ultimately the target area of the exon and mutations of candidate genes were screened.Then bidirectional sequencing of Sanger was used to sequence other family members which were matching with gender and age to testify whether there are the above mutations.ResultsIn this family,the proband and his sister carry one missense mutations,with TTN c.100126A＞G(p.Thr33376Ala).The heart function of proband was declined and accompanied by malignant arrhythmia.But his sister has no obvious clinical symptoms.ConclusionThe patient of this family carries the genetic mutation of TTN.TTN truncating mutations are a common cause of dilated cardiomyopathy,which maybe improve our understanding of the pathophysiology of dilated cardiomyopathy.

Dilated cardiomyopathy(DCM);Gene mutation;TTN

R542.2

A

1003—6350（2017）22—3627—03

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81170307）

徐紅新。E-mail：303876340@qq.com

2017-05-29)