吳春太 ，周 珺 ，姚行成 ，陳先紅 ，王 軍 ，林位夫

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所 a.農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室；b.國家橡膠樹育種中心；c.海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室，海南 儋州 571737）

橡膠樹葉片花色素苷的提取與穩(wěn)定性及其品種間含量變化研究

吳春太a，b，c，周 珺a，b，c，姚行成a，b，c，陳先紅a，b，c，王 軍a，b，c，林位夫a，b，c

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所 a.農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室；b.國家橡膠樹育種中心；c.海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室，海南 儋州 571737）

為探討不同橡膠樹品種葉片中花色素苷含量特征，首先通過對不同提取材料、提取液和提取時間的研究，以確定巴西橡膠樹葉片花色素苷的最佳提取條件，然后對影響其穩(wěn)定性的因素進行了測試，并利用最佳的橡膠樹花色素苷提取條件對抗寒性不同的橡膠樹品種的花色素苷含量進行測定。結(jié)果表明，用1%鹽酸乙醇作為橡膠樹古銅期葉片花色素苷提取液的效果最好，最佳的提取時間為6 h；橡膠樹葉片花色素苷的穩(wěn)定性受pH值影響較大，隨著pH升高其穩(wěn)定性明顯下降，其對光強也比較敏感，但對溫度較不敏感，可見，黑暗和酸性條件能較好地保持花色素苷的穩(wěn)定性；不同抗寒性橡膠樹品種的花色素苷含量存在差異。綜上可見，本研究建立的花色素苷提取條件及其穩(wěn)定性保持條件為后續(xù)橡膠樹花色素苷的研究奠定了基礎(chǔ)。

巴西橡膠樹；花色素苷；提?。环€(wěn)定性；含量變化

花色素Anthocyanidin是一類廣泛存在于高等植物中的黃酮類化合物，常以苷類形式，即花色素苷Anthocyanin，存在于植物細胞液泡中的。花色素苷是黃酮類化合物中最重要的一類物質(zhì)，一般產(chǎn)生于植物葉片，除了作為植物芽、葉、花和果實中紫、紅、橙、白等色澤形成的物質(zhì)基礎(chǔ)之外[1-6]，還在植物主動適應和抵御不良環(huán)境中具有多種重要功能[7-9]。目前，有關(guān)植物花色素苷提取及其組分、穩(wěn)定性和抗逆的研究較多[10-17]，但針對橡膠樹不同發(fā)育階段葉片和不同抗寒品種葉片花色素苷含量的變化規(guī)律卻尚未見有相關(guān)報道。

巴西橡膠樹Hevea brasiliensisMuell. Arg.為大戟科Euphorbiaceae橡膠屬落葉喬木，原產(chǎn)巴西，植株高達20 m以上，全株含白色乳狀汁液，是集能源[18-19]、膠用[20]、材用[21]為一體的多用途樹種。橡膠樹季相變化豐富，春葉由古銅變淡，變淡綠及變綠，對確定膠林開割極具參考價值。橡膠樹葉色變化主要受花色素苷的影響，因此，本實驗首先從不同提取溶劑、提取時間對橡膠樹不同提取材料中花色素苷提取效果進行了比較研究，并探討了pH值、光源和溫度對花色素苷穩(wěn)定性的影響，最后分析了抗寒性不同的橡膠樹品種的花色素苷含量變化，從而為研究橡膠樹花色素苷提取和利用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所選育的熱研7-33-97、熱研8-79和從印度尼西亞引種的PR107，后兩個品種僅用于品種間差異性比較分析，取樣地點位于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院(儋州)試驗場九隊增殖苗圃，試驗材料選自3年生橡膠苗鋸桿后的0.5 a齡新生植株上長出的葉片。于2012年7月晴天上午8:00—10:00分別采集其古銅期、淡綠期、穩(wěn)定期的健壯葉片作為供試材料。采后立即放置冰上保存，用冰盒迅速帶回實驗室，去葉柄及葉脈后剪碎混勻葉片，備用。

1.2 花色素苷提取與測定

根據(jù)張冬梅等[22]和楊科家等[23]的方法，略有改動。

1.2.1 浸提劑選擇

稱取不同發(fā)育時期的葉片各1 g，均分別加10 mL的0.1 mol/L鹽酸、1%鹽酸甲醇、1%鹽酸乙醇3種不同浸提劑，置于32 ℃恒溫160轉(zhuǎn)速的振蕩培養(yǎng)箱中浸提5 h，過濾后各取1 mL濾液并用各自的浸提液稀釋至25 mL，即刻用紫外可見分光光度計掃描，波長為400～700 nm，每處理設(shè)3次重復。

1.2.2 提取時間的測定

稱取1 g古銅期葉片，加10 mL 1%鹽酸乙醇，置于32 ℃恒溫160轉(zhuǎn)速的振蕩培養(yǎng)箱中浸提，提取時間在1～10 h內(nèi)設(shè)10個梯度，間隔時間均為1 h，過濾后取1 mL濾液并用浸提液稀釋至25 mL，迅速檢測稀釋液530 nm和657 nm處的吸光值。

1.3 花色素苷穩(wěn)定性的測定

根據(jù)張冬梅等[22]和劉曉東等[24]的方法，略有改動。稱取10 g葉片，加1%鹽酸乙醇100 mL，置于32 ℃恒溫160轉(zhuǎn)速的振蕩培養(yǎng)箱中浸提6 h，過濾后置于4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 不同光源處理

取3份1 mL提取液，分別用1%鹽酸乙醇稀釋至25 mL，并置于黑暗、日光燈(光照培養(yǎng)箱)、自然光條件下，每隔1 h取1次樣，測定不同光照條件和不同光照時間下花色素苷的含量。

1.3.2 不同pH值緩沖液處理

取8份1 mL花色素苷提取液，分別用pH值0～8間隔均為1的9個梯度的緩沖液稀釋至25 mL，搖勻后于黑暗中平衡3 h，取樣于400～700 nm波長測定不同pH值下的花色素苷的吸光值。pH值0，1，2緩沖液分別為1.0，0.1，0.01 mol/L的鹽酸，pH值3～8溶液用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制。

1.3.3 不同溫度處理

取7份1 mL提取液，分別用1%鹽酸乙醇稀釋至 25 mL，并置于 4、25、35、45、55、65、75 ℃ 7個不同溫度的恒溫水浴中避光保溫，每隔1 h取1次樣，用自來水平衡至室溫，測定不同溫度處理下花色素苷的含量。以上每種處理均設(shè)3個重復組，花色素苷均以鮮重A530-0.25A657/g表示其含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 8.0對測定數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和多重比較，采用Excel 2003進行統(tǒng)計分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同橡膠樹葉片與溶劑對花色素苷提取效果的影響

從圖1A可以看出，采用1%鹽酸甲醇和1%鹽酸乙醇從古銅期葉中所提取的花色素苷的吸收光譜大致相同，均在420、654 nm處有2個吸收峰，另有1個吸收峰位于530/534 nm處，0.1 mol·L-1鹽酸所提取的花色素苷的吸收光譜為單一吸收峰，此峰波長為511 nm；從圖1B可見，用1%鹽酸甲醇和1%鹽酸乙醇從淡綠期葉中所提取的花色素苷的吸收光譜分布僅有2個吸收峰，兩種提取液所提產(chǎn)物的峰波長大致相同，各有2個吸收峰在419/420、653/654 nm 處出現(xiàn)，0.1 mol·L-1鹽酸的吸收峰不明顯；由圖1C可見，用1%鹽酸甲醇和1%鹽酸乙醇從穩(wěn)定期葉中所提取的花色素苷的吸收光譜只有2個吸收峰，兩種溶劑所提產(chǎn)物的峰波長大致相同，均有1個吸收峰分布在654 nm處，另有1個吸收峰出現(xiàn)在419/420 nm處，0.1 mol·L-1鹽酸的吸收峰不明顯。因此，1%鹽酸甲醇和1%鹽酸乙醇均可作為提取橡膠樹葉片中花色素苷的提取溶劑，且結(jié)果可靠。但前者作為提取溶劑效果理想，后者安全性高，研究者可根據(jù)試驗需要選擇。

由圖1D可以看出，利用1%鹽酸甲醇從古銅期、淡綠期和穩(wěn)定期葉中所提取的花色素苷的吸收光譜大致相同，但峰數(shù)目不同，古銅期葉在420、530、654 nm處有3個吸收峰，穩(wěn)定期葉在419、654 nm處有2個吸收峰，淡綠期葉僅在419 nm有1個吸收峰；由圖1E可見，用1%鹽酸乙醇從古銅期、淡綠期和穩(wěn)定期葉中所提取的花色素苷的吸收光譜大致相同，但峰數(shù)目不同，古銅期、穩(wěn)定期葉在420、654 nm處均有2個吸收峰，前者在530 nm處另有1個吸收峰，淡綠期葉僅在420 nm有1個吸收峰；從圖1F可見，用0.1 mol·L-1鹽酸從古銅期、淡綠期和穩(wěn)定期葉中所提取的花色素苷的吸收光譜僅古銅期葉在511 nm有1個吸收峰。因此，古銅期葉為橡膠樹花色素苷提取的最佳材料，效果理想，安全可靠。經(jīng)綜合分析，以下實驗皆選用古銅期葉作為提取材料和1%鹽酸乙醇為提取溶劑，以充分提取橡膠樹幼嫩葉片組織中的花色素苷。

圖1 不同提取溶劑下不同發(fā)育階段葉片的花色素苷吸收光譜Fig. 1 The absorption spectrum of the anthocyanin obtained from leaves in different developmental stages with different extraction solvents

2.2 提取時間對橡膠樹葉片花色素苷含量變化的影響

如圖2所示，采用1%鹽酸甲醇溶劑提取的古銅期葉中的花色素苷含量隨著提取時間的延長有所增加。浸提滿4 h前，隨著浸提的時間增長花色素苷含量逐漸增加；浸提到6～8 h時，花色素苷得率較高，而標準差最小，且花色素苷含量維持在一個較穩(wěn)的水平，說明提取效果較好；以后隨著時間的延長花色素苷含量逐漸上升，當浸提10 h左右時，花色素苷含量為最高值。因此，提取時間選定在6 h左右可得到較高較穩(wěn)的產(chǎn)率。

圖2 提取時間不同的花色素苷含量變化Fig. 2 Content changes of anthocyanin at different extraction time

2.3 不同理化因子對橡膠樹葉片花色素苷穩(wěn)定性的影響

2.3.1 光照條件

由圖3可以看出，橡膠樹葉片花色素苷在不同光照條件下均會發(fā)生降解，其含量下降，但不同光源的花色素苷含量變化不一。日光燈作用8 h后花色素苷含量變化較大，從開始的0.328下降到0.287，損失了12.43%，而在自然光和避光下花色素苷最高損失率僅分別為4.03%和5.05%。由此表明，花色素苷類色素光穩(wěn)定性較好，僅日光燈的降解作用較明顯，自然光和避光降解緩慢。由圖3還可看出，花色素苷在自然光、日光燈、黑暗作用4 h時均分別比初始值超出4.59%、0.05%、3.02%，自然光作用5 h時超出2.86%。其原因可能是本試驗中的花色素苷混合溶液中所含具有增色效應的有機酸等其它物質(zhì)與花色素苷發(fā)生共輔色作用而使花色苷溶液的吸光度增加，還有待于進一步研究。

圖3 光照對橡膠樹花色素苷穩(wěn)定性的影響Fig. 3 The effect of light on stability of anthocyanin

2.3.2 不同pH值

由圖4可以看出，不同pH值對橡膠樹葉片中花色素苷含量影響很大?；ㄉ杖芤航?jīng)pH=0、pH=1、pH=2酸性緩沖液處理后均呈現(xiàn)其特征吸收峰，最大吸收波長為510 nm，且隨著pH值的升高，510 nm處的吸光度值依次遞增。隨著緩沖液的酸性減弱，當pH值增至3～8時，則無明顯的吸收峰出現(xiàn)。這說明橡膠樹葉片花色素苷是一種酸性依賴性化合物，其在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性得到提高。

圖4 不同pH值下花色素苷吸收光譜Fig. 4 The absorption spectrum of the anthocyanin at different pH values

2.3.3 不同溫度

橡膠樹葉片花色素苷提取液經(jīng)不同溫度處理后，其花色素苷含量見圖5。7種溫度處理1 h 的花色素苷平均含量最低，處理2 h的均值次之，二者的花色素苷平均含量均低于其它處理時間的平均值，但差異無統(tǒng)計學意義。4 ℃的花色素苷含量在任一時間內(nèi)均出現(xiàn)下降，8 h后的降幅為13.47%；25 ℃時花色素苷降解減慢，8 h后的降幅僅為5.41%；而35、45、55、65、75 ℃處理時間當各自達到5、3、2、1、1 h時，其花色素苷含量由下降轉(zhuǎn)為增長，8 h后的增幅分別為24.05%、52.01%、85.34%、124.91%、191.72%。而且，由表1知，4、25、35、45、55、65、75 ℃各處理8個時間點的花色素苷平均含量存在顯著差異，其中，75 ℃下的平均含量最大，65 ℃下的均值次之，但前者的變異系數(shù)比后者的超出9.82%。相關(guān)分析表明，7個處理的花色素苷含量1、2、3、4、5、6、7、8 h后的變幅與所設(shè)溫度均呈顯著或極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)依次為0.814、0.860、0.907、0.938、0.943、0.953、0.911、0.944 (R0.05=0.755，R0.01=0.875)。這說明橡膠樹葉片的花色素苷對溫度未表現(xiàn)出敏感性，在65 ℃恒溫放置3 h以上條件下有利于該花色苷顯色。

2.4 不同抗寒品種橡膠樹葉片中花色素苷含量分析

圖5 不同溫度和處理時間對花色素苷穩(wěn)定性的影響Fig. 5 The effect of different temperature and treatment time on stability of anthocyanin

3個不同抗寒性橡膠品種不同發(fā)育期葉片中花色素苷總含量的變化較大，大、小葉古銅期葉片中花色素苷總含量均極顯著高于(P＜ 0.01)變色期、淡綠期、穩(wěn)定期的量；且不同品種間花色素苷總含量差異較大，變色、淡綠、穩(wěn)定期葉片花色素苷總含量在3品種間的差異達到顯著或極顯著水平，而大小葉古銅期葉片的差異均無統(tǒng)計學意義。而橡膠樹幼苗葉片花色素苷各發(fā)育期之間相關(guān)性則不顯著，且各發(fā)育期葉片的花色素苷含量也未與1～3齡幼苗2008年春的寒害程度呈現(xiàn)很好的相關(guān)性。

表1 不同溫度對花色素苷穩(wěn)定性影響的顯著性測驗Table 1 Significance test for the effect of different temperatures on stability of anthocyanin

圖6 3個橡膠樹品種葉片花色素苷含量變化與比較Fig. 6 The changes and comparison of content of anthocyanin from H. brasiliensis leaves of three varieties

3 結(jié)論與討論

不同植物的葉片花色素苷的最佳提取條件不同。橡膠樹葉片花色素苷的不同提取溶劑中，1%鹽酸甲醇、1%鹽酸乙醇的提取效果較0.1 mol·L-1鹽酸的提取效果好，前二者的提取效果與挪威槭葉片中的吻合[22]，而與紅葉黃櫨葉片中的效果相反[25]，且1%鹽酸甲醇的提取效果較1%鹽酸乙醇的好，但二者之間無顯著差異，這與紫葉風箱果葉片中的效果一致[24]。因此，在進行橡膠樹花色素苷提取時，選用1%鹽酸甲醇或者1%鹽酸乙醇為提取溶劑，提取時間在6 h，可以充分提取葉片中的花色素苷。這與張冬梅等[22]提取挪威槭花色素苷和楊科家等[23]提取元寶楓花色素苷所選時間相同，但比劉曉東等[24]提取紫葉風箱果葉片花色素苷的時間略長。葉片不同發(fā)育階段中，古銅期的葉在3種提取溶劑下的提取效果均好于淡綠期和穩(wěn)定期葉的提取效果。但不同提取材料的選擇還取決于橡膠樹的生育期。花色素苷提取溶劑的選擇除取決于花色素苷本身的性質(zhì)外，也取決于提取的目的。

不同植物的花色素苷的光、熱和PH穩(wěn)定性不同。巴西橡膠花色素苷對光、熱穩(wěn)定性較好，這與五味子色素、鴨血糯色素、黑甜玉米色素和鵝掌柴綠色素的光、熱穩(wěn)定性表現(xiàn)相似[26-29]，而挪威槭、元寶楓和紫葉風箱果的葉片花色素苷光、熱穩(wěn)定性較差，盡管后三者與巴西橡膠的花色素苷均采用醇提方法獲取。然而由于巴西橡膠花色素苷提取時間需6 h，因此提取花色素苷整個過程及保存提取液要盡量避光；若長時間保存花色素苷應選擇低溫條件。巴西橡膠在pH值≤2條件下花色素苷結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，元寶楓和紅葉臭椿在pH值1～3的環(huán)境下花色苷顏色較為穩(wěn)定[23,30]，黑甜玉米色素在pH值＜5條件下時穩(wěn)定[28]，紅花檵木葉片花色素提取在低pH值時較穩(wěn)定[31]，可見這些植物的花色素苷在酸性條件下穩(wěn)定，在應用過程中應避免中堿性條件。而籽粒莧花穗色素在pH值4～8范圍內(nèi)穩(wěn)定，在運用過程中應避免酸堿性環(huán)境[32]。

通過測定熱研7-33-97、熱研8-79和PR107 3個品種橡膠樹幼苗5個發(fā)育時期葉片花色素苷，研究發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育時期橡膠樹葉片花色素苷含量變幅差異較大，變色前花色素苷含量依次下降23.31%、83.01%，變色后花色素苷含量依次下降90.12%、75.81%，從而認為橡膠樹葉片發(fā)育與花色素苷的含量變化有關(guān)。但對這3個橡膠樹品種幼苗葉片花色素苷含量各發(fā)育期之間的關(guān)系及其與2008年春的抗寒力的關(guān)系進行了進一步的研究發(fā)現(xiàn)，橡膠樹葉片花色素苷含量各發(fā)育期之間的相關(guān)性較差，說明葉片不同發(fā)育期花色素苷含量的動態(tài)變化存在基因型差異，而橡膠樹花色素苷含量與樹體的抗寒力的相關(guān)性較差，其原因可能是寒害發(fā)生與花色素苷含量測定用葉樣采集的季節(jié)不同以及樣本容量太小，此外，橡膠樹寒害的發(fā)生及其危害程度不僅與其物候有關(guān)，還與低溫的類型關(guān)系密切，如平流型低溫、輻射型低溫和混合型低溫[33-34]。

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Study on the extraction and stability of anthocyanin from leaves ofHevea brasiliensisand its content change between three different cultivars

WU Chuntaia,b,c, ZHOU Juna,b,c, YAO Xingchenga,b,c, CHEN Xianhonga,b,c, WANG Juna,b,c, LIN Weifua,b,c
(a.Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture; b. State Center for Rubber Breeding;c. Hainan Provincial Key Laboratory of Physiology for Tropical Crops; Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737, Hainan, China)

This study was aimed to explore the characteristics of contents of anthocyanin in the leaf of rubber tree (Hevea brasiliensis)from different cultivars and provide a wealth of material for future breeding ofH. brasiliensis.The extraction materials, extraction solvents and extraction time were studied to de fi ne the optimal extracting conditions of anthocyanin fromH. brasiliensis.The stability of anthocyanin which was extracted under the optimal extraction conditions was investigated. The optimized extraction conditions were used for determination of anthocyanin contents in three cultivars ofH. brasiliensiswith different cold resistance. The results showed that the optimal extraction conditions for anthocyanin in bronze leaves were obtained as alcohol containing 1% HCl and 6 h extraction time.The stability of anthocyanin fromH. brasiliensiswas obviously affected by pH value of solution since its stability decreased signi fi cantly with the increasing of pH value. Moreover, it was sensitive to light but was not sensitive to temperature. Therefore, darkness and acidic condition are required to maintain its stablility. There were differences in anthocyanin contents of three differentH. brasiliensiscultivars with different cold resistance. In summary, the established extraction conditions of anthocyanin and maintain conditions of its stablility would lay a foundation for the research on anthocyanin from rubber tree.

Hevea brasiliensis; anthocyanin; extraction; stability; content change

10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.12.003

http: //qks.csuft.edu.cn

S794.1

A

1673-923X(2017)12-0015-06

2017-05-31

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項“國家天然橡膠產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系種苗繁育崗位科學家經(jīng)費”（No.CARS-34-GW4）

吳春太，博士，副研究員

王 軍，碩士，副研究員；E-mail：wangjuncatas@163.com

吳春太，周 珺，姚行成，等. 橡膠樹葉片花色素苷的提取與穩(wěn)定性及其品種間含量變化研究[J].中南林業(yè)科技大學學報，2017, 37(12): 15-20, 45.

[本文編校：文鳳鳴]