張玉祥，吳艷慶，姜海濱，劉立明，杜榮斌

( 1.煙臺(tái)大學(xué) 海洋學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005； 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東 煙臺(tái) 264006 )

催產(chǎn)激素對(duì)半滑舌鰨卵巢生化成分及血漿生殖激素水平的影響

張玉祥1，吳艷慶2，姜海濱3，劉立明1，杜榮斌1

( 1.煙臺(tái)大學(xué) 海洋學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005； 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東 煙臺(tái) 264006 )

在人工蓄養(yǎng)條件下，對(duì)半滑舌鰨注射催產(chǎn)激素(促黃體生成激素釋放激素類似物和絨毛膜促性腺激素)，研究其卵巢生化成分、血漿生殖激素水平及產(chǎn)卵效果的影響。通過(guò)對(duì)親魚(yú)采用不注射、一次性注射、二次注射的3種處理，并采用生化方法和雙抗體放射免疫法分別測(cè)定了卵巢中總蛋白、粗脂肪、總糖、水分含量和血漿中甲狀腺素、促卵泡成熟激素、促黃體生成激素含量的變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，注射催產(chǎn)激素后的親魚(yú)，卵巢迅速發(fā)育并完成物質(zhì)積累，其中粗脂肪和總糖含量均隨卵巢的發(fā)育成熟而顯著增高(P<0.05)，產(chǎn)卵完成后明顯下降；總蛋白的含量為6.13%～7.07%；水分含量最高，隨卵巢發(fā)育成熟，先由78.78%降至64.81%，產(chǎn)后升至72.56%。催產(chǎn)劑注射24 h后可使血漿甲狀腺素含量顯著升高(P<0.05)，有效時(shí)間可持續(xù)24 h以上，且二次注射有利于維持較高的血漿甲狀腺素含量。對(duì)照組促卵泡成熟激素和促黃體生成激素含量均持續(xù)降低，注射組促卵泡成熟激素含量在24～36 h時(shí)上升，此后明顯下降，促黃體生成激素含量變化對(duì)催產(chǎn)激素最為敏感，注射后12 h即明顯上升，二次注射組的促黃體生成激素含量顯著高于其他兩組(P<0.05)。因此，催產(chǎn)激素注射可促進(jìn)血漿生殖激素水平升高，且二次注射的作用更為明顯。催產(chǎn)激素注射還可顯著提高總產(chǎn)卵量、上浮卵量和浮卵率，且二次注射效果亦顯著優(yōu)于一次性注射(P<0.05)。

半滑舌鰨；催產(chǎn)激素；卵巢生化成分；生殖激素；產(chǎn)卵效果

半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)屬鰈形目、舌鰨科、舌鰨屬，俗稱牛舌頭、鰨目、鰨米、龍力等，主要分布于我國(guó)的黃渤海、東海以及朝鮮、日本沿海，是一種名貴海水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。半滑舌鰨雌雄的個(gè)體生長(zhǎng)速度與性腺大小差異均極為懸殊，雌魚(yú)生長(zhǎng)速度快，卵巢發(fā)達(dá)，而雄魚(yú)個(gè)體小，精巢退化，繁殖能力弱，自然資源量較低。自2002年半滑舌鰨人工苗種繁育技術(shù)獲得突破以來(lái)，其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，市場(chǎng)價(jià)格堅(jiān)挺，目前年養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)萬(wàn)噸，年產(chǎn)值達(dá)20多億元，已成為我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類之一[1]。

我國(guó)目前對(duì)半滑舌鰨繁殖生物學(xué)的研究，在親魚(yú)性腺的分化[2]、精巢形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)及生殖細(xì)胞特征[3]、精子發(fā)生[4]和胚胎發(fā)育組織學(xué)[5]、溫度對(duì)性腺組織發(fā)育的影響[6]、卵巢發(fā)育及其產(chǎn)卵類型[7]、卵巢發(fā)育的組織學(xué)和數(shù)量形態(tài)特征[8]等方面已有較多報(bào)道，但對(duì)其生殖內(nèi)分泌生理的研究較少。以往研究表明，魚(yú)類在排卵前血液中促性腺激素含量會(huì)急劇增加，以此調(diào)控性類固醇激素的合成和釋放，促進(jìn)性腺的發(fā)育與成熟[9-12]。另外，甲狀腺素也被認(rèn)為與魚(yú)類的繁殖有密切的關(guān)系[13]。對(duì)半滑舌鰨的研究發(fā)現(xiàn)，在親魚(yú)產(chǎn)卵過(guò)程中，血清促性腺激素水平也表現(xiàn)為產(chǎn)卵前較低，臨產(chǎn)前和產(chǎn)卵時(shí)明顯上升的趨勢(shì)[14]，這與其他魚(yú)類有類似的規(guī)律[15-16]。目前，與魚(yú)體生殖激素生理功能相似的促黃體生成激素釋放激素類似物和絨毛膜促性腺激素已廣泛應(yīng)用于多種魚(yú)類的人工繁殖[17-19]，據(jù)報(bào)道，促黃體生成激素釋放激素類似物+絨毛膜促性腺激素+地歐酮對(duì)尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)有的較好催產(chǎn)效果[18]，地歐酮和促黃體生成激素釋放激素類似物對(duì)奧利亞羅非魚(yú)(O.aurea)的催產(chǎn)效果最佳[19]。但關(guān)于外源催產(chǎn)劑對(duì)半滑舌鰨血漿甲狀腺素、促卵泡成熟激素、促黃體生成激素含量及性腺生化指標(biāo)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本文研究了催產(chǎn)激素注射后半滑舌鰨卵巢主要生化成分和血漿生殖激素水平的變化，及其對(duì)產(chǎn)卵效果的影響，以期豐富魚(yú)類繁殖生理學(xué)內(nèi)容，優(yōu)化人工繁殖技術(shù)，為半滑舌鰨的人工繁育及漁業(yè)資源保護(hù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚(yú)及培育

試驗(yàn)所用半滑舌鰨為山東東方海洋科技股份有限公司萊州育苗場(chǎng)人工養(yǎng)殖的3齡雌性親魚(yú)，共計(jì)24 尾，全長(zhǎng)61.0～69.8 cm，體質(zhì)量1600.0～2345.0 g；并按1∶1.5的雌雄比例挑選性成熟的3齡雄性親魚(yú)36尾，全長(zhǎng)24.5～32.1 cm，體質(zhì)量275.0～351.0 g。親魚(yú)蓄養(yǎng)于4 m×4 m×1.2 m的室內(nèi)水泥池中，約于產(chǎn)卵前2個(gè)月開(kāi)始進(jìn)行強(qiáng)化培育，采用人工光溫調(diào)控、餌料強(qiáng)化，并結(jié)合催產(chǎn)劑注射的方式以促進(jìn)親魚(yú)性腺發(fā)育與產(chǎn)卵。培育水溫由20 ℃逐漸升至25 ℃，約每10 d增加1 ℃，并使用黑色遮光幕和白熾燈進(jìn)行光照度和光周期的調(diào)節(jié)，控制水面光照度為200～300 lx，光照時(shí)間由8 h/d逐漸增至12 h/d，每10 d增加1 h，日循環(huán)水量400%，并持續(xù)充氣，pH 6.89～7.28。日投喂2次鮮活生物餌料(如沙蠶、貝肉等)，日投餌率為2%～3%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以促黃體生成激素釋放激素類似物和絨毛膜促性腺激素為催產(chǎn)劑，雌魚(yú)注射總劑量為促黃體生成激素釋放激素類似物0.20 μg/kg和絨毛膜促性腺激素 500 IU/kg；雄魚(yú)注射劑量為雌魚(yú)的1/2。

選取15尾雌性親魚(yú)進(jìn)行卵巢主要生化成分的測(cè)定，分A1、B1、C1、C2、C35組，每組3尾親魚(yú)，A1組：不注射催產(chǎn)激素(對(duì)照組)，取樣時(shí)間計(jì)為0 h；B1組：0 h時(shí)注射1次催產(chǎn)激素，注射24 h后取樣；C1組：0、24 h各注射1次，每次注射劑量為總劑量的1/2，36 h時(shí)取樣；C2組：0、24 h各注射1次，每次注射劑量為總劑量的1/2，48 h時(shí)取樣；C3組：0 h、24 h各注射1次，每次注射劑量為總劑量的1/2，60 h時(shí)取樣。取樣時(shí)，剪取部分卵巢組織，用精確度為0.001 g的Lucky LQ-B2003電子秤稱量質(zhì)量后放入聚乙烯密封袋中，于冰柜中-40 ℃冷凍保存。

另取9尾雌性親魚(yú)測(cè)定血漿生殖激素水平的變化，設(shè)置A、B、C 3組，每組3尾雌魚(yú)，其中A組不注射催產(chǎn)劑(對(duì)照組)；B組進(jìn)行一次性注射；C組分兩次注射，每次注射劑量為總劑量的1/2；雄性親魚(yú)僅注射1次。在各組采集第1次血樣后，B、C組立即進(jìn)行第1次注射，24 h后C組進(jìn)行第2次注射。分別在試驗(yàn)開(kāi)始后的0(首次注射前)、12、24、36、48、60 h對(duì)3組親魚(yú)進(jìn)行血樣采集。

自第1次催產(chǎn)劑注射后36 h開(kāi)始至試驗(yàn)結(jié)束期間，對(duì)3組親魚(yú)進(jìn)行人工采卵。期間隨時(shí)檢查卵巢發(fā)育、對(duì)卵巢充盈的親魚(yú)進(jìn)行多次擠卵和人工授精，統(tǒng)計(jì)并記錄每尾親魚(yú)的最終總產(chǎn)卵量與上浮卵量，計(jì)算浮卵率(見(jiàn)1.5)。

1.3 卵巢生化成分測(cè)定

分別采用苯酚—硫酸法測(cè)定卵巢中總糖含量[20]，索氏抽提法測(cè)定卵巢中粗脂肪含量[21]，凱氏定氮法測(cè)定卵巢組織中的總蛋白含量[22]，直接烘干稱量質(zhì)量法測(cè)定卵巢組織中的水分含量[23]。

1.4 血液取樣與激素含量測(cè)定

分別在各取樣時(shí)間點(diǎn)從半滑舌鰨雌魚(yú)的尾靜脈處用2.0 mL注射器抽取血液1～2 mL于2.0 mL離心管中，并加入質(zhì)量濃度2.5×10-3mg/L的肝素鈉溶液0.1 mL，4 ℃下10 000 r/min離心5 min，用移液槍吸取上清液于另一個(gè)2.0 mL離心管中，置于冰柜中-40 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

雌魚(yú)血漿中甲狀腺激素、血漿促卵泡成熟激素、血漿促黃體生成激素含量采用雙抗體放射免疫測(cè)定法測(cè)定[24]。樣品由北京華英生物技術(shù)研究所測(cè)定完成，試驗(yàn)中抗原以放射性同位素(125I)標(biāo)記，采用此3種激素的放射免疫試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所生產(chǎn))和γ-911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀(中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司生產(chǎn))測(cè)量反應(yīng)后反應(yīng)系中的放射免疫強(qiáng)度(cpm)，再經(jīng)過(guò)計(jì)算求得甲狀腺素(ng/mL)、促卵泡成熟激素(mIU/mL)和促黃體生成激素(mIU/mL)的含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

浮卵率/%=上浮卵量/總產(chǎn)卵量×100%

采用Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan′s法進(jìn)行多重比較，以P<0.05為各組之間差異顯著，使用Origin 9.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 親魚(yú)卵巢主要生化成分的變化

卵巢組織中總蛋白、粗脂肪、總糖和水分含量的變化見(jiàn)圖1。各試驗(yàn)組卵巢中總蛋白含量最為穩(wěn)定，其含量為(6.13±0.05)%～(7.07±0.08)%，各組之間差異不顯著(P>0.05)；注射催產(chǎn)劑之后，總糖的含量出現(xiàn)了最為明顯的變化，C組均顯著高于A1組和B1組，C1和C2組的含量約為注射前A1組的2倍以上，但二者之間差異不顯著(P>0.05)，C1組達(dá)到峰值(4.70±0.08)‰，C3組顯著降至(4.29±0.12)‰ (P<0.05)；各組粗脂肪含量也出現(xiàn)了明顯的變化，C1和C2組粗脂肪含量顯著高于其他組(P<0.05)，C2組達(dá)高峰值(12.28±3.09)%，C3組出現(xiàn)顯著下降，銳減至(7.74±1.87)%的水平，且與激素注射前的含量之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；水分含量自B1組開(kāi)始出現(xiàn)顯著的下降，由(77.58±3.33)%降至C2組的(64.81±2.55)%，直至C3組時(shí)又升至(72.56±5.26)%。

圖1 卵巢主要生化成分的變化

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，不同字母表示差異顯著(P<0.05).

2.2 親魚(yú)血漿生殖激素含量的變化

2.2.1 甲狀腺素含量的變化

雌魚(yú)血漿中甲狀腺素含量的變化見(jiàn)圖2。試驗(yàn)期間，A組的甲狀腺素含量最低且變化最小，僅24 h時(shí)的含量達(dá)到(9.21±1.62) ng/mL，其余5次測(cè)定值為7.83～8.99 ng/mL，相互間差異不顯著(P>0.05)。B組的甲狀腺素含量在第1次注射后24 h時(shí)顯著上升(P<0.05)，達(dá)(9.86±1.51) ng/mL，并且在之后的至少12 h內(nèi)維持了較高水平，48 h時(shí)顯著下降(P<0.05)。與B組相似，C組甲狀腺素含量在首次注射后24 h也出現(xiàn)顯著上升(P<0.05)，而且第2次注射(24 h)后一直維持在較高含量，60 h時(shí)達(dá)最高值(10.45±0.78) ng/mL。試驗(yàn)最初的24 h，3組的甲狀腺素含量差異不顯著(P>0.05)；36 h時(shí)， B、C兩組顯著高于A組；此后，C組顯著高于A、B組(P<0.05)。

圖2 血漿甲狀腺素含量的變化

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)表示，各組不同取樣時(shí)間的顯著性差異用不同大寫(xiě)字母表示(P<0.05)；同一取樣時(shí)間各組的顯著性差異用不同小寫(xiě)字母表示(P<0.05).下同.

2.2.2 促卵泡成熟激素含量的變化

雌魚(yú)血漿中促卵泡成熟激素含量的變化見(jiàn)圖3。試驗(yàn)開(kāi)始后，A組(空白對(duì)照組)促卵泡成熟激素含量持續(xù)降低，由最初的(20.73±2.99) mIU/mL降至60 h時(shí)的(18.24±2.27) mIU/mL，但相互差異并不顯著(P>0.05)。B組在注射后12 h內(nèi)無(wú)明顯變化，24 h時(shí)出現(xiàn)顯著上升，并達(dá)到峰值(21.38±2.30) mIU/mL(P<0.05)，此后持續(xù)下降至與注射前相近的水平。C組的促卵泡成熟激素含量在首次注射后24 h內(nèi)并未出現(xiàn)顯著上升(P>0.05)，但第2次注射后，在36 h時(shí)即顯著升高(P<0.05)，之后持續(xù)下降至最低值(18.38±2.71) mIU/mL(60 h)。3組的促卵泡成熟激素含量?jī)H在24 h和36 h時(shí)出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，其他時(shí)間差異并不顯著(P>0.05)。

圖3 血漿促卵泡成熟激素含量的變化

2.2.3 促黃體生成激素含量的變化

雌魚(yú)血漿中促黃體生成激素含量的變化見(jiàn)圖4。A組促黃體生成激素含量為27.28～29.14 mIU/mL，整體表現(xiàn)出略微下降的趨勢(shì)，但并無(wú)顯著性差異(P>0.05)。B組在注射后12 h時(shí)即出現(xiàn)顯著上升(P<0.05)，且顯著高于對(duì)照組(A組)(P<0.05)，24 h時(shí)便顯著降至與未注射時(shí)相近的水平(P<0.05)，之后持續(xù)降低。C組促黃體生成激素含量分別在二次注射后12 h各出現(xiàn)1次明顯升高，第1次達(dá)到(31.88±1.69) mIU/mL(12 h)，顯著高于對(duì)照組(A組)(P<0.05)；第2次達(dá)到(33.06±2.00) mIU/mL的峰值(36 h)，此后雖明顯下降(P<0.05)，但均顯著高于A、B兩組(P<0.05)。

圖4 血漿促黃體生成激素含量的變化

2.3 親魚(yú)的產(chǎn)卵量與浮卵率

各組親魚(yú)產(chǎn)卵量與浮卵率見(jiàn)表1。3組親魚(yú)的總產(chǎn)卵量之間差異顯著(P<0.05)，由A組到C組的產(chǎn)卵量呈現(xiàn)大幅度增加，增長(zhǎng)率達(dá)到24.88%；3組之間的上浮卵量差異顯著(P<0.05)，C組是A組的逾1.5倍；A、B兩組的浮卵率無(wú)顯著差異，但均顯著低于C組(P<0.05)。

表1 親魚(yú)產(chǎn)卵量與浮卵率

注：表中數(shù)據(jù)為各組親魚(yú)測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，具有相同字母上標(biāo)的同一列數(shù)據(jù)之間無(wú)顯著差異(P>0.05).

3 討 論

3.1 注射催產(chǎn)激素對(duì)卵巢主要生化成分變化的影響

已有研究表明，脂類對(duì)卵巢和胚胎的發(fā)育具有十分重要的作用，不僅作為親體重要的能量來(lái)源和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是構(gòu)成卵黃蛋白原和卵黃磷脂蛋白的重要成分[25]；親魚(yú)飼料中的脂肪含量或脂肪酸水平對(duì)其產(chǎn)卵量有明顯影響，通常是在親魚(yú)餌料中添加卵磷脂、高度不飽和脂肪酸(特別是二十二碳六烯酸)等進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化[26-27]。不同魚(yú)類卵巢內(nèi)粗脂肪的含量差異較大，比如鳳鱭(Coiliamystus)成熟卵巢的脂肪含量為20.96%[28]，異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)Ⅳ期卵巢內(nèi)脂肪的平均含量?jī)H為2.62%[29]，這種差異不僅與產(chǎn)卵類型和主要供能物質(zhì)有關(guān)，還與卵巢發(fā)育階段有關(guān)。據(jù)報(bào)道，在魚(yú)類卵巢發(fā)育、成熟過(guò)程中，脂肪能夠不斷積累，含量持續(xù)升高，為卵母細(xì)胞的發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)和能量來(lái)源[30]。本試驗(yàn)中，通過(guò)催產(chǎn)劑的注射可以顯著促進(jìn)粗脂肪的積累，二次注射效果優(yōu)于一次性注射，卵巢中粗脂肪含量可由注射前的(6.97±0.67)%升至最高(12.28±1.09)%(圖1)，進(jìn)而促進(jìn)卵巢的發(fā)育成熟。自然條件下，半滑舌鰨雌魚(yú)卵巢發(fā)育過(guò)程中粗脂肪的積累需要至少1個(gè)月的時(shí)間[8]，而通過(guò)催產(chǎn)劑的注射可縮短卵巢中粗脂肪積累的時(shí)間，催產(chǎn)劑注射后36～48 h內(nèi)便可完成脂肪的最終積累，這對(duì)于促進(jìn)卵巢營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的快速積累和卵母細(xì)胞的最終發(fā)育成熟具有重要的意義。到采卵結(jié)束時(shí)，粗脂肪含量已大幅下降(圖1 C3組)，這是由卵巢中脂質(zhì)含量較高的成熟卵子已基本排空所造成的。有研究表明，魚(yú)類卵巢成熟過(guò)程中脂肪的積累直接來(lái)源于食物，或者由體內(nèi)肝臟、腸系膜等組織器官中的脂肪間接轉(zhuǎn)移而來(lái)[31]。由于催產(chǎn)期間并未投餌，因此卵巢中的脂肪主要來(lái)自體內(nèi)的轉(zhuǎn)移，因此可以認(rèn)為催產(chǎn)劑在脂肪轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演重要的角色，這與解競(jìng)靜[32]的研究結(jié)果相一致。

蛋白質(zhì)是卵巢中的又一重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，試驗(yàn)期間測(cè)得的各組親魚(yú)卵巢總蛋白的含量為(6.13±0.03)%～(7.07±0.05)%，變化并不明顯。這可能是由于半滑舌鰨卵巢中的蛋白質(zhì)在注射催產(chǎn)劑之前的Ⅳ期末已完成積累，外源激素并不能對(duì)卵巢中蛋白的積累產(chǎn)生明顯的作用。對(duì)鰱魚(yú)(Hypophthalmichthysmolitrix)的研究證實(shí)，卵巢中的蛋白質(zhì)主要來(lái)源于食物，而不是體內(nèi)的轉(zhuǎn)移[33]，因而催產(chǎn)劑并不能發(fā)揮類似于對(duì)脂肪積累的作用。其他魚(yú)類則表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，例如長(zhǎng)薄鰍(Leptobotiaelongata)卵母細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)出先下降后逐漸上升的規(guī)律[42]，黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)則是隨卵巢發(fā)育迅速增加，Ⅴ期達(dá)到最高值，產(chǎn)卵后下降[34]。不同魚(yú)類卵巢內(nèi)蛋白質(zhì)變化規(guī)律的差異可能與魚(yú)類卵巢發(fā)育過(guò)程中主要供能物質(zhì)和卵黃生成方式的不同有關(guān)[35]。

卵巢中總糖的含量較低，最高值為(4.70±0.08)‰，其變化規(guī)律與脂類類似，催產(chǎn)劑可促進(jìn)其含量的顯著升高，在采卵結(jié)束后明顯下降。在卵巢的發(fā)育過(guò)程中總糖是代謝的主要能量來(lái)源，尤其產(chǎn)卵時(shí)會(huì)消耗大量能量，由于催產(chǎn)激素可以促進(jìn)甲狀腺素的分泌(圖2)，進(jìn)而促進(jìn)魚(yú)體代謝，導(dǎo)致總糖含量的升高，而產(chǎn)卵結(jié)束后(C3組)，估計(jì)代謝強(qiáng)度的下降是造成總糖含量降低的直接原因。

魚(yú)類卵巢中水分的含量最高，而卵子的含水量是決定魚(yú)類卵子沉性或浮性的最關(guān)鍵因素，浮性卵的含水量明顯高于黏性卵[36]。試驗(yàn)中對(duì)照組(A1組)親魚(yú)卵巢的含水量最高，達(dá)(78.78±1.46)%，而C2組達(dá)最低值(64.81±2.55)%，這可能是由于注射催產(chǎn)劑后，卵巢內(nèi)粗脂肪、總糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的迅速積累和卵母細(xì)胞的快速發(fā)育、成熟，導(dǎo)致其中水分含量的相對(duì)下降。產(chǎn)卵完成后(C3組)水分含量上升，這可能是因?yàn)楫a(chǎn)卵使卵巢中的總蛋白、粗脂肪和總糖等有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物大量減少，從而使得水分的含量相對(duì)升高。

3.2 注射催產(chǎn)激素對(duì)血漿生殖激素水平變化的影響

甲狀腺激素存在于所有的脊椎動(dòng)物中，包括三碘甲狀腺原氨酸和甲狀腺素。已有研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺素不僅在魚(yú)類(尤其是鲆鰈類)的早期變態(tài)過(guò)程中發(fā)揮生理效能[37]，在魚(yú)類生活史的各個(gè)時(shí)期均有重要的調(diào)節(jié)作用[38]，甲狀腺激素往往作用于性腺發(fā)育的全部過(guò)程，不僅可以誘導(dǎo)卵母細(xì)胞的發(fā)育，還能促進(jìn)卵母細(xì)胞的最后成熟及排卵[39]。有研究表明，甲狀腺激素含量在魚(yú)類性腺發(fā)育的早期和繁殖前期均較高，它不僅參與誘導(dǎo)肝臟內(nèi)卵黃蛋白原的生成和物質(zhì)積累，還可以促進(jìn)卵巢內(nèi)卵黃蛋白原受體的表達(dá)，而在繁殖過(guò)程中又會(huì)降至基礎(chǔ)水平[40-41]。不僅如此，甲狀腺素還會(huì)對(duì)促黃體生成激素釋放激素類似物產(chǎn)生影響，甲狀腺素含量的升高可以增加其排卵作用[42]。本試驗(yàn)表明，催產(chǎn)劑注射24 h之內(nèi)即可發(fā)揮作用，促使半滑舌鰨雌魚(yú)血漿甲狀腺素含量顯著升高，首次注射有效時(shí)間可持續(xù)24 h以上，二次注射則有利于延長(zhǎng)有效時(shí)間并維持較高的血漿甲狀腺素含量(圖2)。這種生理效能不僅可以促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，對(duì)提高親魚(yú)肝臟的生理活性，促進(jìn)肝臟內(nèi)卵黃原的發(fā)生，加快物質(zhì)的積累和能量?jī)?chǔ)存也有重要意義[43-44]。

促卵泡成熟激素不僅能促進(jìn)魚(yú)類卵泡生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟，還能促使卵巢產(chǎn)生性類固醇激素來(lái)調(diào)節(jié)早期卵子、精子的發(fā)生和卵黃的生成，進(jìn)而直接促進(jìn)卵巢的生長(zhǎng)，增加卵巢的質(zhì)量[45]，而促黃體生成激素釋放激素類似物和絨毛膜促性腺激素等催產(chǎn)劑則可以促進(jìn)促卵泡成熟激素的分泌。本試驗(yàn)中，催產(chǎn)劑注射24 h之內(nèi)便可發(fā)揮作用，促進(jìn)半滑舌鰨雌魚(yú)血漿促卵泡成熟激素含量顯著升高，首次注射的有效時(shí)間至多維持12 h，二次注射則可顯著延長(zhǎng)有效時(shí)間(36 h以上)并維持較高的血漿含量，直至48 h后開(kāi)始下降(圖3)。關(guān)于促卵泡成熟激素對(duì)卵巢的作用，已有學(xué)者提出了閾值(促使卵泡發(fā)育的最低激素含量)和閾值窗(激素含量持續(xù)在閾值以上的時(shí)間)的概念[46]。因?yàn)殚撝荡暗拈L(zhǎng)短決定了成熟卵泡的數(shù)量，所以延長(zhǎng)閾值窗對(duì)促進(jìn)單個(gè)卵泡發(fā)育成熟和誘發(fā)多個(gè)卵泡同時(shí)成熟均具有重要作用[47]。半滑舌鰨在產(chǎn)卵過(guò)程中，對(duì)照組促卵泡成熟激素含量持續(xù)下降，這可能是由卵細(xì)胞發(fā)育成熟對(duì)其不斷地消耗造成的，因?yàn)榧に匦枰c卵巢內(nèi)的受體結(jié)合才能發(fā)揮生理作用[48-49]。目前關(guān)于硬骨魚(yú)類促卵泡成熟激素閾值大小的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，由對(duì)照組親魚(yú)也能夠產(chǎn)卵的情況推測(cè)，產(chǎn)卵時(shí)血漿中激素含量肯定在閾值水平以上，而注射催產(chǎn)劑則可提高其水平，并能延長(zhǎng)其高含量的持續(xù)時(shí)間(36 h以上)，也就延長(zhǎng)了閾值窗，尤其是二次注射時(shí)效果更佳。

促黃體生成激素是誘發(fā)魚(yú)類排卵的主要因素之一， 其主要作用為與促卵泡成熟激素協(xié)同促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)成熟，調(diào)節(jié)類固醇激素分泌和精卵的發(fā)生[45]。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組促黃體生成激素含量持續(xù)降低，其含量變化對(duì)催產(chǎn)激素最為敏感，注射后12 h即顯著升高(圖4)，這說(shuō)明注射催產(chǎn)激素對(duì)魚(yú)體促黃體生成激素的分泌具有顯著的促進(jìn)作用。促黃體生成激素主要作用于性腺發(fā)育的中后期，在親魚(yú)性腺發(fā)育到第Ⅳ期時(shí)，提高親魚(yú)血液中促黃體生成激素的含量對(duì)促進(jìn)卵巢的進(jìn)一步發(fā)育、卵母細(xì)胞的成熟和排卵都有較大的促進(jìn)作用[11-12]。B組親魚(yú)在激素注射后，血漿促黃體生成激素維持較高水平的時(shí)間不超過(guò)24 h，而C組親魚(yú)在第2次注射后血漿的激素含量達(dá)到峰值，并一直顯著高于A、B兩組，這表明二次注射對(duì)其分泌的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于1次注射，進(jìn)而對(duì)卵巢發(fā)育的促進(jìn)效果也是最好的。

3.3 催產(chǎn)激素注射對(duì)親魚(yú)產(chǎn)卵效果的影響

已有研究表明，注射多種類型的催產(chǎn)激素都可以顯著提高親魚(yú)的產(chǎn)卵率、卵子受精率和孵化率等[50-53]。試驗(yàn)中的3組親魚(yú)雖然都有產(chǎn)卵反應(yīng)，但是注射催產(chǎn)激素可顯著提高親魚(yú)的產(chǎn)卵量，且二次注射對(duì)于提高浮卵率、改善卵質(zhì)的效果更好。這是由于催產(chǎn)劑可以促進(jìn)粗脂肪、總糖等卵巢營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的快速積累和生殖相關(guān)激素的分泌，從而對(duì)卵子的成熟度、卵質(zhì)、受精率等產(chǎn)生積極的影響。C組首次產(chǎn)卵時(shí)間比A、B兩組更早，在36 h時(shí)即可人工擠卵，且擠卵過(guò)程順暢，每次產(chǎn)卵量較高，產(chǎn)卵時(shí)間也較為同步，這是由于在催產(chǎn)劑注射后，C組親魚(yú)血漿中的甲狀腺素、促卵泡成熟激素和促黃體生成激素等生殖激素均在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持了較高的含量，延長(zhǎng)了激素作用的閾值窗時(shí)間，卵巢發(fā)育受到更為持久的激素刺激，因而有更多卵母細(xì)胞同步成熟和更多的成熟卵子同時(shí)排放；而A組親魚(yú)因?yàn)槁殉舶l(fā)育不同步，導(dǎo)致個(gè)體間產(chǎn)卵量差異懸殊，還存在首次產(chǎn)卵時(shí)間推遲(36～48 h時(shí)產(chǎn)卵)、產(chǎn)卵次數(shù)多、每次產(chǎn)卵量少、產(chǎn)卵不同步等情況，甚至數(shù)次出現(xiàn)卵中帶血、擠卵困難的現(xiàn)象。另外，A組多次反復(fù)擠卵也對(duì)親魚(yú)的性腺、內(nèi)臟器官等造成了較大的物理?yè)p傷，部分親魚(yú)甚至出現(xiàn)擠卵后體表黏液層受損，皮膚顏色變淡、甚至腸道脫出等嚴(yán)重受傷情況，這就需要對(duì)親魚(yú)仔細(xì)操作并及時(shí)進(jìn)行產(chǎn)后護(hù)理(如藥浴等)，否則會(huì)導(dǎo)致親魚(yú)死亡，造成損失。所以對(duì)半滑舌鰨進(jìn)行二次催產(chǎn)激素注射可獲得較佳的產(chǎn)卵效果，不僅提高了工作效率，節(jié)約了時(shí)間成本，還顯著提高了上浮卵量，能夠帶來(lái)更高的經(jīng)濟(jì)效益。

[1] 陳松林，杜民，楊景峰，等.半滑舌鰨家系建立及其生長(zhǎng)和抗病性能測(cè)定[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2010，34(12)：1789-1794.

[2] 馬學(xué)坤，柳學(xué)周，溫海深，等.半滑舌鰨性腺分化的組織學(xué)觀察[J].海洋水產(chǎn)研究，2006，27(2)：55-61.

[3] 梁春光，康現(xiàn)江，李鳳超，等.半滑舌鰨性腺的組織學(xué)研究[J].河北漁業(yè)，2007(11)：22-28.

[4] 康現(xiàn)江，梁春光，郭明申，等.半滑舌鰨精子發(fā)生和精子形成的超微結(jié)構(gòu)[J].動(dòng)物學(xué)報(bào)，2008，54(2)：356-365.

[5] 劉美，李鳳超，穆淑梅，等.半滑舌鰨胚胎發(fā)育組織學(xué)觀察[J].四川動(dòng)物，2008，27(5)：737-739.

[6] 汪娣，田永勝，陳松林.水溫對(duì)半滑舌鰨性腺組織發(fā)育的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2012，36(2)：262-271.

[7] 陳彩芳，溫海深，陳曉燕，等.人工養(yǎng)殖半滑舌鰨卵巢發(fā)育及其產(chǎn)卵類型研究[J].海洋科學(xué)，2010，34(8)：29-34.

[8] 柳學(xué)周，徐永江，劉乃真，等.半滑舌鰨卵巢發(fā)育的組織學(xué)和形態(tài)數(shù)量特征研究[J].漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2009，30(6)：25-35.

[9] 林浩然.激素和人工誘導(dǎo)魚(yú)類繁殖[J].生物學(xué)通報(bào),1999，34(8)：4-6.

[10] 謝啟文.神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)[J].醫(yī)學(xué)研究通訊，1999，28(3)：7.

[11] 姜仁良，黃世蕉，趙維信，等.促黃體生成素釋放激素類似物對(duì)團(tuán)頭魴血清中促性腺激素和17β-雌二醇含量變動(dòng)的研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1986，10(2)：185-193.

[12] 王德壽，林浩然.誘導(dǎo)大鰭鳠和長(zhǎng)吻排卵過(guò)程中血清GTH水平的變化[J].水生生物學(xué)報(bào)，2001，25(2)：185-190.

[13] Daniel G,Eales J G. Interrelationships between thyroidal and reproductive endocrine systems in fish[J].Reviews in Fish Biology and Fisheries， 1996，6(2)：165-200.

[14] 王珊珊.促性腺激素在雌性半滑舌鰨繁殖周期的生理功能研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2013.

[15] De Leeuw R, Resink J W, Rooyakkers E J, et al. Pimozide modulates the luteinizing hormone-releasing hormone effect on gonadotrophin release in the African catfishClariaslazera[J]. Gen Comp Endocrinol, 1985，58(1)：120-127.

[16] 趙維信，黃世蕉，姜仁良.鯉魚(yú)產(chǎn)卵前后血清中促性腺激素含量的動(dòng)態(tài)變化[J].動(dòng)物學(xué)雜志，1979，10(2)：3-5.

[17] Li J L, Liu L P. Experiments on complete artificial propagation ofOreochromisaureus[J].Journal of Aquaculture,2006，27(5)：25-27.

[18] 魏繼海，趙永華，王燕，等.催產(chǎn)激素對(duì)尼羅羅非魚(yú)人工繁殖效果的研究[J].漁業(yè)研究，2016，38(1)：36-40.

[19] 李政潮，王指楠，于延正，等.生殖激素對(duì)泥鰍催產(chǎn)效果的研究[J].吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，22(4)：7-9，47.

[20] 姜瓊，謝妤.苯酚—硫酸法測(cè)定多糖方法的改進(jìn)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(12)：316-318.

[21] 全國(guó)食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)肉禽蛋制品分技術(shù)委員會(huì). GB/T 9695.7—2008，肉與肉制品總脂肪含量測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[22] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB 5009.5—2010, 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[23] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB 5009.3—2010. 食品中水分的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[24] 陳名聲，楊開(kāi)祺，劉明.血清生長(zhǎng)激素雙抗體放射免疫測(cè)定[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，10(5)：327.

[25] 于智勇，吳旭干，常國(guó)亮，等.中華絨螯蟹第二次卵巢發(fā)育期間卵巢和肝胰腺中主要生化成分的變化[J].水生生物學(xué)報(bào)，2007，31(6)：799-806.

[26] Li Y Y，Chen W Z，Sun Z W，et al. Effects of n-3 HUFA content in brood stock diet on spawning performance and fatty acid composition of eggs and larvae inPlectorhynchuscinctus[J].Aquaculture，2005，245(1/4)：263-272.

[27] Aby-ayad S M E A，Melard C，Kestemont P. Effects of fatty acids in Eurasian perch brood stock diet on egg fatty acid composition and larvae stress resistance[J].Aquaculture international，1997，5(2)：161-168.

[28] 劉凱，徐東坡，段金榮，等.長(zhǎng)江口鳳鱭產(chǎn)卵群體肌肉及卵巢生化組成和能量密度[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，18(3)：302-307.

[29] 嚴(yán)安生，黃峰，熊傳喜，等.異育銀鯽卵巢、肌肉的生化成分和氨基酸組成特點(diǎn)[J].水利漁業(yè)，1997，89(2)：10-12.

[30] Bell M V，Henderson R J，Sargent J R. The role of polyunsaturated fatty acids in fish[J].Comp Biochem Physio，1986，83(4)：711-719.

[31] 于曉，唐文喬，王磊.長(zhǎng)江口鳳鱭繁殖群體卵巢發(fā)育過(guò)程中的體內(nèi)脂肪轉(zhuǎn)移[J].動(dòng)物學(xué)雜志，2014，49(6)：867-874.

[32] 解競(jìng)靜.大黃魚(yú)肌纖維生長(zhǎng)和脂肪沉積規(guī)律以及甲狀腺激素的作用[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[33] 鄭斯涌，馬志章，江希明.白鰱卵巢發(fā)育過(guò)程中的磷化合物含量變化的研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1965，2(1)：21-32.

[34] 殷江霞.長(zhǎng)薄鰍的性腺發(fā)育和生殖細(xì)胞的發(fā)生[D].重慶：西南大學(xué)，2006.

[35] 姚俊杰，姜海波，胡先成，等.黃顙魚(yú)繁殖期主要組織器官中氨基酸和脂肪酸的組成[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(5)：115-118.

[36] 劉筠.中國(guó)養(yǎng)殖魚(yú)類繁殖生理學(xué)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1993：29-46，53-55.

[37] Einarsdóttir I E，Silva N，Power D M，et al. Thyroid and pituitary gland development from hatching through metamorphosis of a teleost flatfish, the Atlantic halibut[J].Anatomy & Embryology，2006，211(1)：47-60.

[38] Orozco A，Valverde-R C.Thyroid hormone deiodination in fish[J].Thyroid，2005，15(8)：799-813.

[39] Cyr D G，Eales J G. Interrelationships between thyroidal and reproductive endocrine systems in fish[J].Reviews in Fish Biology and Fisheries，1996，6(2)：165-200.

[40] Biswas A. Thyroid hormone profile during annual reproductive cycle of diploid and triploid catfish,Heteropneustesfossilis(Bloch)[J].General and Comparative Endocrinology，2006，147(2)：126-132.

[41] Wallace R A. Developmental Biology[M].New York:Plenum Press，1985：117-127.

[42] Ng N K，Tsi D，Munro A D. Induced final maturation and ovulation in a small anabantoid teleost, the dwarf gourami,Colisalalia. Ⅰ. The effects of gonadotrophic preparations, LHRHa, steroids and thyroid hormones[J].Aquarium Sciences and Conservation，1997，1(3)：169-188.

[43] Yamano K. The role of thyroid hormone in fish development with reference to aquaculture[J].Japan Agricultural Research Quarterly，2005，39(3)：161-168.

[44] Epler P，Bieniarz K. Effects of triiodothyronine and of some gonadotropic and steroid hormones on the maturation of carp (CyprinuscarpioL.) oocytes in vitro[J].Reproduction Nutrition Development，1983，23(1)：101-107.

[45] Rocha M J，Arukwe A，Kapoor B G. Fish Reproduction[M]. Enfield: Science Pub Inc，2008：37-66.

[46] Schoemaker J，Weissenbruch M M,Scheele F，et al.The FSH threshold concept in clinical ovulation induction[J].Baillière′s Clinical Obstetrics and Gynaecology，1993，7(2)：297-308.

[47] Koning C H，Schoemaker J，Lambalk C B. Estimation of the follicle-stimulating hormone (FSH) threshold for initiating the final stages of follicular development in women with elevated FSH levels in the early follicular phase[J].Fertility and Sterility，2004，82(3)：650-653.

[48] Gen K，Kazeto Y. Gonadotropins and their receptors in fish reproduction[J].Nippon Suisan Gakkaishi (Japan)，2009，75(5)：858-859.

[49] Levavi-Sivan B，Bogerd J，Maanós E L，et al. Perspectives on fish gonadotropins and their receptors[J].General and Comparative Endocrinology，2009，165(3)：412-437.

[50] 朱華，胡紅霞，董穎，等.不同催產(chǎn)劑對(duì)俄羅斯鱘人工繁殖效果的影響[J].水產(chǎn)科學(xué)，2014，33(1)：1-7.

[51] 盧國(guó)興.不同激素及性比對(duì)泥鰍繁殖效果的研究[D].舟山：浙江海洋學(xué)院，2013.

[52] 姜海峰，耿龍武，佟廣香，等.池養(yǎng)鏡泊湖蒙古鲌的人工繁殖及胚胎發(fā)育和胚后發(fā)育觀察[J].水產(chǎn)科學(xué),2016,35(2):130-135.

[53] 陳睿毅，樓寶，詹煒，等.小黃魚(yú)親魚(yú)培育和催產(chǎn)技術(shù)的初步試驗(yàn)[J].水產(chǎn)科學(xué),2016,35(3):250-254.

EffectsofSpawningInducingHormonesonBiochemicalCompositionofOvaryandReproductiveHormoneLevelsinPlasmainHalf-smoothTongue-soleCynoglossussemilaevis

ZHANG Yuxiang1，WU Yanqing2，JIANG Haibin3，LIU Liming1，DU Rongbin1

( 1.Ocean School, Yantai University, Yantai 264005, China; 2.East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China;3.Shandong Marine Environment and Resource Research Institute, Yantai 264006, China )

Under the artificial breeding conditions, the effects of luteinizing hormone-releasing hormone analogue (LRH-A3) and human chorionic gonadotropin (HCG) injection on biochemical composition of ovary and reproductive hormone levels in plasma and spawning were investigated in half-smooth tongue-soleCynoglossussemilaevisbroodstocks in 3 groups including no injection, single injection and twice injections. The contents of total protein, total carbohydrate and crude lipid and water in ovary were determined using biochemistry methods, and the varieties of the level of thyroxine (T4), follicle-stimulating hormone (FSH), and luteinizing hormone (LH) in plasma were detected using double antibody radioimmunoassay. The results showed that ovary developed and completed the nutrition accumulation rapidly just in the broodstocks injected with exogenous hormone. The contents of total carbohydrate and crude lipid were increased significantly with the development of ovary (P<0.05), and decreased significantly after spawning; the content of total protein remained stable from 6.13% to 7.07%; moisture, the one with the maximal level, decreased from 78.78% to 64.81% with development of ovary, and increased significantly to 72.56% after spawning. The content of T4 was shown to be increased significantly at 24 hours after injection (P<0.05) and then kept a higher level for more than 24 hours, and twice injection helped to maintain a higher level of T4 in plasma. FSH and LH in control group kept decreasing while the content of FSH in group of hormone injection just increased between 24 and 36 hours and decreased later. The content of LH was most sensitive to hormone injection and increased at 12 hours after injection, significantly higher in twice injection group than that in the other two groups (P<0.05). The findings indicate that exogenous hormone injection can promote the levels of reproductive hormones in plasma, especially twice injection (P<0.05). Spawning inducing hormone injection can also lead to significantly increase in total amount of eggs, and amount and rate of floating eggs, twice injection being significantly effective than single injection (P<0.05).

Cynoglossussemilaevis; spawning inducing hormone; biochemical composition of ovary; reproductive hormone; spawning

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.05.001

2016-08-19；

2016-12-06.

農(nóng)業(yè)部國(guó)家鲆鰈類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-50-Z09)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(SDAIT-12-03).

張玉祥(1991-)，男，碩士研究生；研究方向：水生生物學(xué)、繁殖生物學(xué).E-mail：ytuzhangyuxiang@163.com. 通訊作者：杜榮斌(1962-)，男，教授；研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)、海洋生物學(xué).E-mail：rbdu62@163.com.

S965.399

A

1003-1111(2017)05-0543-08