任曉婧，杜金順，崔建州，暴可心，李會(huì)平

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北 保定 071000; 2.河北省阜平縣林業(yè)局，河北 阜平 073200; 3.河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

聯(lián)峰山油松枯梢病病原菌越冬方式及場(chǎng)所的研究

任曉婧1,3，杜金順2，崔建州1,3，暴可心1,3，李會(huì)平1,3

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北 保定 071000; 2.河北省阜平縣林業(yè)局，河北 阜平 073200; 3.河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

為了明確油松枯梢病病原菌Sphaeropsissapinea的越冬方式及場(chǎng)所，于2015年11月—2016年3月越冬季節(jié)田間采集油松PinustabulaeformisCarr.的松針、松梢、球果等越冬組織及林下的落針、落果等，觀察子實(shí)體著生情況，測(cè)定越冬子實(shí)體內(nèi)孢子萌發(fā)率，發(fā)現(xiàn)油松枯梢病的病原菌可以子實(shí)體的形式在松針和落針上越冬。通過(guò)對(duì)以上組織進(jìn)行室內(nèi)病原菌的分離、分子生物學(xué)檢測(cè)，確定該病菌也可以菌絲體的形式在發(fā)病的針葉、球果、松梢和落針、落果中越冬。

油松枯梢病;球殼孢菌;越冬方式;越冬場(chǎng)所

油松PinustabulaeformisCarr.為松科松屬針葉常綠喬木，廣泛分布于我國(guó)東北、華北、西北及河南、山東、江蘇等地，常用于造林和景觀建設(shè)[1]。但是近些年來(lái)，油松枯梢病在華北一帶發(fā)生，尤其河北省秦皇島市聯(lián)峰山森林公園景區(qū)危害嚴(yán)重。該病害自2004年在聯(lián)峰山發(fā)生以來(lái)，呈現(xiàn)逐年加重趨勢(shì)，目前發(fā)生率70%以上。其癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)病初期枝梢黃色或微紅色枯敗，后期呈灰白色叢狀枯死，下垂且不落，枯死樹(shù)隨處可見(jiàn)，存活樹(shù)幾乎株株布滿(mǎn)枯枝敗葉，嚴(yán)重影響了景區(qū)的景觀效果，給當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)及生態(tài)景觀造成了極大破壞[2]。

該病害的病原為半知菌亞門(mén)腔孢綱球殼孢目球殼孢屬真菌Sphaeropsissapinea[3]。病原物越冬是植物病害侵染循環(huán)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，病原物在越冬期間處于休眠狀態(tài)，而且潛伏場(chǎng)所比較固定，是侵染循環(huán)中的一個(gè)薄弱環(huán)節(jié)，掌握這個(gè)環(huán)節(jié)常常是某些病蟲(chóng)害防治上的關(guān)鍵所在。病原物越冬方式多種，營(yíng)養(yǎng)體、各種孢子、子實(shí)體、菌核、菌索等都可以在一定條件下度過(guò)不良環(huán)境[4]。越冬場(chǎng)所也因病原、發(fā)生部位等不同而不同。有病落葉是許多葉部病害病原物的越冬場(chǎng)所，落葉松早期落葉病、松落針病等的病原物以菌絲體在落葉中越冬[5-8]。金絲小棗漿爛果病的有性世代的子囊殼與子囊孢子只發(fā)現(xiàn)于越冬后的病棗果中[9]。油茶炭疽病可以在地面有病落果中越冬[10]。毛竹枯梢病菌以菌絲體、子囊孢子和分子孢子形態(tài)越冬,以病組織中菌絲體為越冬主要形式[11]。

關(guān)于聯(lián)峰山公園發(fā)生的油松枯梢病病原菌的越冬場(chǎng)所及方式，目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，在一定程度上制約了其有效防治。作者研究油松枯梢病病原菌的越冬方式及其越冬場(chǎng)所，以期為油松枯梢病的監(jiān)測(cè)預(yù)報(bào)提供一定的理論依據(jù)，并為防治該病起到一定的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 采樣 2015年11月至2016年3月，在病害發(fā)生嚴(yán)重的秦皇島市聯(lián)峰山公園采集油松的松針、松梢、球果等越冬組織及林下的落針、落果，裝入無(wú)菌紙袋,做好標(biāo)記帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 越冬病原菌子實(shí)體觀察 對(duì)上述不同時(shí)間采集的不同越冬組織，借助放大鏡觀察是否有油松枯梢病病原子實(shí)體，做好詳細(xì)記錄。根據(jù)以下公式計(jì)算子實(shí)體率。

子實(shí)體率(%)=

1.2.2 越冬病原子實(shí)體萌發(fā)測(cè)定 從帶有油松枯梢病病原子實(shí)體的標(biāo)本隨機(jī)抽取200個(gè)樣品，測(cè)定其孢子萌發(fā)情況。方法如下，將子實(shí)體取出、壓碎，獲得分生孢子，制成孢子懸浮液，使每個(gè)視野內(nèi)的孢子數(shù)在80～100個(gè)，用懸滴法測(cè)定孢子萌發(fā)率。每個(gè)處理5次重復(fù)，在25℃恒溫下培養(yǎng)，每2 h觀察1次，每次觀察5個(gè)視野，計(jì)算平均值。孢子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)：以芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子直徑長(zhǎng)度(指直徑最小的一邊)的一半，視為已經(jīng)萌發(fā)的孢子。

1.2.3 越冬病原營(yíng)養(yǎng)體的分離培養(yǎng) 在調(diào)查地點(diǎn)采集已發(fā)病但無(wú)子實(shí)體的油松針葉、松梢、球果及其樹(shù)下的落針、落果。共選擇針葉100枚、松梢50個(gè)、球果100個(gè)、落針和落果各100個(gè)進(jìn)行分離試驗(yàn)。將樣品切成小塊(1～2 cm)，用清水清洗干凈后在超凈工作臺(tái)中參照《植病研究方法》[12]進(jìn)行分離。具體操作如下：將樣品小塊浸泡在75%的酒精中30 s，用0.1%的升汞消毒3 min，無(wú)菌水沖洗3次(為檢測(cè)消毒是否徹底，取第3次洗滌液100 μL，均勻涂抹在PDA培養(yǎng)基表面,觀察是否有微生物長(zhǎng)出)。取PDA培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿接入消毒的樣品小塊，在LRH—250—G光照培養(yǎng)箱中25℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察1次并記錄培養(yǎng)菌落的形狀、色澤等，與該病害病原菌的菌落特征進(jìn)行對(duì)比，排除其他菌類(lèi)，并記錄各分離株的分離率，從而確定油松枯梢病病原菌菌絲體主要的越冬場(chǎng)所。

1.2.4 越冬病原營(yíng)養(yǎng)體的分子檢測(cè) 對(duì)從越冬病原營(yíng)養(yǎng)體中分離的菌株分別提取其DNA，并以其為模板，采用ITS通用引物(ITS1∶5′-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3′和ITS4∶5′-TC-CT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′)對(duì)菌株的rDNA ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)此片段進(jìn)行DNA序列測(cè)定，DNA提取及測(cè)序工作由大連寶生物工程有限公司完成。同時(shí)以該病害病原菌分離菌株的DNA序列作為對(duì)照，將所測(cè)菌株的基因序列和對(duì)照菌株的基因序列用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性比較分析，最后確定菌株的種類(lèi)是否屬于油松枯梢病病原菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 子實(shí)體在松樹(shù)不同部位的越冬 分別于2015年11月、2016年1月和2016年3月3次調(diào)查，在松梢、球果及落果中均未發(fā)現(xiàn)病菌的子實(shí)體。而在樹(shù)上針葉和落地針葉中均有子實(shí)體存在，存在率分別為77.93%～85.00%和75.15%～78.97%(表1)。說(shuō)明油松枯梢病病原菌以子實(shí)體的形式在發(fā)病針葉和落針中越冬。

表1 子實(shí)體越冬在油松各部位的著生率 %

2.2 松樹(shù)不同部位越冬病原子實(shí)體的萌發(fā) 測(cè)定越冬期間不同部位子實(shí)體內(nèi)分生孢子的萌發(fā)情況，以確定越冬病原的活力及侵染能力。越冬針葉和落地針葉上子實(shí)體萌發(fā)情況分別見(jiàn)圖1和圖2。

由圖1和圖2看到，在病針葉和落針上子實(shí)體萌發(fā)規(guī)律基本一致，處理后2 h時(shí)，即有少量孢子萌發(fā)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，萌發(fā)率逐漸上升，至19 h時(shí)萌發(fā)率基本穩(wěn)定。2015年11月、2016年1月和3月3次試驗(yàn)中，病針葉上19 h時(shí)的孢子萌發(fā)率分別為76.5%，75.4%，77.1%，落針中孢子萌發(fā)率分別為77.5%，74.7%，76.3%。說(shuō)明越冬期間的子實(shí)體無(wú)論在病針葉中，還是落針中均保持較高的萌發(fā)率，可以作為第2年的侵染來(lái)源。

圖1 不同處理時(shí)間病針葉上越冬分生孢子萌發(fā)率

圖2 不同處理時(shí)間落針上越冬分生孢子萌發(fā)率

2.3 病原菌營(yíng)養(yǎng)體在不同部位的分離 在越冬期間分3次在不同越冬部位分離到的出現(xiàn)頻次較高的真菌有8種，病原菌的分離率最高。

從圖3可以看出，不同時(shí)間在各個(gè)越冬部位均能分離到病原菌，且分離率差異不顯著。說(shuō)明油松枯梢病病原菌可以菌絲體的形式在發(fā)病的針葉、球果、松梢和落針、落果中越冬。

圖3 在油松不同部位越冬的病原菌分離率

2.4 不同部位越冬病原營(yíng)養(yǎng)體的分子檢測(cè) 對(duì)2.3中分離到的所有真菌進(jìn)行ITS序列分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，進(jìn)行鑒定(表2)。在所有分離到的真菌中，除病原菌分離率最高外，還有7種出現(xiàn)頻率較高，在不同部位均能分離到，分別為植物內(nèi)生菌Paraphaeosphaeriasp.、哈茨木霉Trichodermaharzianum、鏈格孢Alternariaarborescens、互隔交鏈孢霉Alternariaalternata、木霉Trichodermalixii、鉤狀木霉Trichodermahamatum、類(lèi)臘腸莖點(diǎn)霉Allantophomopsislycopodina。在這7種真菌中，分離率亦不相同，其中Paraphaeosphaeriasp.在不同時(shí)間不同部位的分離率均明顯高于其他真菌，為常駐菌群[17-18]。

表2 在油松不同部位越冬的8種真菌的分離率 %

3 小結(jié)與討論

通過(guò)對(duì)油松上發(fā)病的針葉、球果、松梢和落針、落果進(jìn)行子實(shí)體分離、孢子萌發(fā)試驗(yàn)確定油松枯梢病病原菌以子實(shí)體形式在冬季發(fā)病油松的針葉和落針上越冬，室內(nèi)組織分離試驗(yàn)確定了油松枯梢病病原菌也以菌絲體的形式越冬，越冬場(chǎng)所為油松發(fā)病的松針、松梢、球果和落針、落果。

確定病原菌的越冬方式對(duì)病害的控制有重要的指導(dǎo)意義，根據(jù)上述研究結(jié)果，冬春季節(jié)及時(shí)清除落葉、落果，并結(jié)合撫育、間伐等工作，對(duì)病弱枝和球果等進(jìn)行疏枝、修剪，可有效降低越冬病原菌基數(shù)，減少初侵染源，對(duì)控制油松枯梢病的擴(kuò)展蔓延具有重要意義。

分離試驗(yàn)中從油松發(fā)病的松針、松梢、球果和落針、落果中除分離到病原菌外，Paraphaeosphaeriasp.的分離率在各個(gè)部位也較高。對(duì)Paraphaeosphaeriasp.進(jìn)行接種試驗(yàn)，其不能使油松致病。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，該菌為一種常見(jiàn)的植物內(nèi)生菌[13-14]，分離率很高，推測(cè)該內(nèi)生菌在油松的生長(zhǎng)及抗逆等方面有一定的作用，具體還有待進(jìn)一步研究。

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StudyontheoverwinteringformsandsitesofthepathogenoftipblightofPinustabulaeformisinLianfengMountain/

REN Xiaojing,et al.

(College of Forestry,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China)

To manifest the overwintering forms and sites of pathogen of tip blight ofPinustabulaeformis,from Novenmber of 2015 to March of 2016,the needles,shoots,cones,fallen needles and fallen cones were collected to observe the fruiting body of the pathogen,and determined the conidia germination.The results showed that the pathogen could overwinter on needles and fallen needles in the form of fruiting body.By means of isolation and molecular analysis of the pathogen,we found that the pathogen could also overwinter in the needles,shoots,cones,fallen needles and fallen cones in the form of mycelium.

tip blight ofPinustabulaeformis;sphaeropsis sapinea;overwintering forms;overwintering sites

2016-07-28

林業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201504306) “油松林枝梢叢狀枯死的成因及防控技術(shù)研究”

任曉婧(1990—)，女，黑龍江省伊春市人，在讀研究生，主要研究方向?yàn)樯钟泻ι锞C合治理，E-mail：814625011@qq.com

李會(huì)平，教授，主要從事森林病蟲(chóng)害防治研究，E-mail：805737255@qq.com。

S763.15

A

1671-0886(2017)02-0035-03

(責(zé)任編輯 楊靜莉)