韓長志，趙惠誼

(西南林業(yè)大學林學院，云南省森林災害預警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224)

昆明市山茶炭疽病菌生物學特性研究

韓長志，趙惠誼

(西南林業(yè)大學林學院，云南省森林災害預警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224)

對山茶炭疽病菌Gloeosporiumtheae-sinensisMiyaka生物學特性進行研究。該病菌最適生長條件為PDA、28 ℃、pH7；能在多種碳源和氮源條件下生長，碳源以可溶性淀粉最適，氮源以蛋白胨最適。

茶炭疽盤長孢菌；山茶炭疽病；生物學特性；昆明市

炭疽病是山茶CamelliajaponicaL.上最常見和發(fā)生最為嚴重的病害之一，不僅為害其幼嫩葉片和枝梢，而且還可以危害老葉，受害植株出現(xiàn)落葉、落蕾、落花以及枝條枯死等現(xiàn)象，嚴重降低了山茶的觀賞價值。云南山茶原產(chǎn)云南，作為昆明市的市花，具有較高的觀賞價值。2014年7—8月，調(diào)查昆明市曇華寺公園內(nèi)植物病害的發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)山茶炭疽病的發(fā)病率高達96.8%、病情指數(shù)為30.20，對其病原菌分離鑒定，確定是由茶炭疽盤長孢Gloeosporiumtheae-sinensisT.Miyake引起[1]。學術(shù)界多從發(fā)病因素[2-3]、防治方法[4-5]等方面開展山茶炭疽病的研究，也有學者對采自浙江金華職業(yè)技術(shù)學院引起該病的病原菌進行了生物學特性研究[6]。鑒于炭疽病菌在不同地區(qū)具有小種分化等特性[7]，有必要對引起云南山茶炭疽病的病菌開展生物學特性研究，因此，作者對前期所獲得的山茶炭疽病菌的生物學特性進行試驗，以期為進一步開展該病菌遺傳關(guān)系以及防治該病提供重要的理論支撐。

1 材料和方法

1.1 菌種 山茶炭疽病菌(茶炭疽盤長孢)分離于昆明市曇花寺公園的山茶葉片，將獲得的純培養(yǎng)菌株保存在試管斜面，4 ℃冰箱中保存。菌種保藏于云南省森林災害預警與控制重點實驗室，菌種編號SCCG-1。

1.2 病原菌生物學特性研究 生物學特性的研究選擇常規(guī)培養(yǎng)基PDA進行病菌培養(yǎng)。即，用直徑7 mm的打孔器將PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d(28 ℃恒溫培養(yǎng)箱、黑暗條件)的病原菌菌落打成菌絲塊接種PDA培養(yǎng)基上(不同的培養(yǎng)基、碳源和氮源測試分別見1.2.1，1.2.5，1.2.6)，28 ℃恒溫培養(yǎng)(不同溫度測試除外)，每種處理5個重復，培養(yǎng)5 d。觀察和描述病菌的菌落特征，用十字交叉法測量菌落直徑，統(tǒng)計分析病原菌生長差異。

1.2.1 不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響 選擇5種培養(yǎng)基做比較。

①馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL；②馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL；③燕麥培養(yǎng)基(OA)：燕麥片30 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL；④清水洋菜培養(yǎng)基(WA)：瓊脂粉20 g、水1000 mL；⑤玉米粉培養(yǎng)基(CMA)：玉米粉40 g、蔗糖10 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL。

1.2.2 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響 將病原菌分別置于5，11，20，25，28，37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 不同pH值對病原菌菌絲生長的影響 在無菌條件下用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)滅菌的PDA培養(yǎng)基pH值，設pH值為3，4，5，6，7，8，9，10，11等9個梯度。

1.2.4 不同密封條件對病原菌菌絲生長的影響 采用培養(yǎng)皿Parafilm膠帶封口和不封口兩種方法。

1.2.5 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以不加碳源為對照，用含有相當量碳的葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉等多種碳源代替查氏培養(yǎng)基中蔗糖，做成不同碳源的固體培養(yǎng)基。

1.2.6 不同氮源對病原菌菌絲生長的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以不加氮源為對照，用含有相當量氮的硝酸銨、磷酸二氫銨、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸等多種氮源代替查氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉，做成不同氮源的固體培養(yǎng)基。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 用Excel 2007對原始數(shù)據(jù)進行分析、處理和作圖。所有圖形中的正負偏差均表示標準誤(SE)，利用Excel中的程序SE=STDEV(range of values)/SQRT(number)計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響 山茶炭疽病菌在PDA上生長速度最快，且菌絲最密集；其次為PSA、CMA、WA以及OA(表1、圖1)。

表1 不同培養(yǎng)基對山茶炭疽病菌菌絲生長的影響

注：“+”一般；“++”密；“+++”較密；“++++”緊密。

圖1 不同培養(yǎng)基上病原菌生長對比

2.2 不同溫度對病原菌生長的影響 在20，25，28 ℃條件下，山茶炭疽病菌能正常生長，以28 ℃時菌絲生長速率最大(圖2)，而在5，11，37 ℃條件下，病原菌不能生長。將此3種溫度下培養(yǎng)的病原菌轉(zhuǎn)移至28 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)后，菌絲又能恢復生長，該現(xiàn)象表明山茶炭疽病菌可以暫時忍受5，11 ℃的低溫以及37 ℃的高溫，待外界環(huán)境條件恢復后依然可以正常生長。

2.3 不同pH對病原菌菌絲生長的影響 以PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH3條件下山茶炭疽病菌不能生長，pH4～10時病原菌均能生長，尤以pH為7時菌絲生長速率最大，其次為pH 6，8(圖3)。

圖2 不同溫度對病原菌生長速率的影響

圖3 不同pH培養(yǎng)基上病原菌生長速率

2.4 不同密封條件對病原菌的生長影響 使用parafilm封口膜對培養(yǎng)皿封口條件下，山茶炭疽病菌的生長較不封口好、生長速度更快，平均生長速率為10.44 mm/d。這個結(jié)果表明，不通氣條件更加適宜山茶炭疽病菌的生長。

2.5 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響 山茶炭疽病菌在6種供試碳源的培養(yǎng)基上均能快速生長，尤以可溶性淀粉作為碳源的條件下生長最快，其次是葡萄糖；值得關(guān)注的是，在不加碳源的對照培養(yǎng)基上，盡管該菌菌絲生長速率與添加乳糖、果糖等碳源的培養(yǎng)基的生長速率差別不大，但其所形成的菌落較為稀疏、菌絲顏色較淺(圖4)。

圖4 不同碳源對病原菌生長速率的影響

2.6 不同氮源對病原菌菌絲生長的影響 山茶炭疽病菌在不同的氮源培養(yǎng)基上生長速率不盡相同，在6種所供試的氮源培養(yǎng)基上，蛋白胨作為氮源的培養(yǎng)基上病原菌生長最快，且菌絲白色、密集，菌落較厚；其次是甘氨酸和酵母膏；硫酸銨和磷酸二氫銨作為氮源不適宜該病原菌生長，出現(xiàn)抑制生長現(xiàn)象(圖5)。與缺乏碳源相似，病原菌在缺乏氮源的培養(yǎng)基上所形成的菌落稀疏，顏色也較淺。

3 結(jié)論與討論

本研究從不同培養(yǎng)基、溫度、pH、密封情況、碳源以及氮源等方面對山茶炭疽病菌的菌絲生長影響進行了研究，明確該病原菌生長適宜溫度為28 ℃，溫度低至5 ℃或達到37 ℃時不能生長；最適pH為7，適合較寬的酸堿度范圍；密封有利于該病原菌生長；能在多種碳源和氮源情況下生長，碳源以可溶性淀粉最適，氮源以蛋白胨最適。該結(jié)果除溫度與前人研究結(jié)果較相似外[6]，其他指標均具有較大的差異性，即菌絲生長的最適溫度為25～30 ℃，最適pH為5～6，最適碳源則為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖。

圖5 不同氮源對病原菌生長速率的影響

上述研究結(jié)果為進一步開展山茶炭疽病菌的致病基因功能研究提供了重要的培養(yǎng)條件，也為該病菌可危害多種植物提供了重要的理論解釋。盡管如此，尚缺乏開展上述不同條件對山茶炭疽病菌孢子的影響情況分析，有待于今后進一步開展相關(guān)研究。

[1] 韓長志，趙惠誼.昆明市山茶炭疽病病原菌鑒定初報[J].中國森林病蟲，2016，35(5)：5-6.

[2] 何美仙,羅軍,賈春蕾,等.山茶炭疽病發(fā)病的影響因素研究[J].林業(yè)實用技術(shù)，2006(12):22-23.

[3] 何美仙，羅軍，賈春蕾，等.山茶炭疽病發(fā)病因素的研究[J].安徽農(nóng)學通報，2006(10):137-138.

[4] 李景蕻.山茶炭疽病的發(fā)生和防治[J].農(nóng)村實用技術(shù)，2004,(1):21.

[5] 趙東,徐進才.山茶炭疽病發(fā)生及防治技術(shù)[J].安徽農(nóng)業(yè)，2003(6):24.

[6] 何美仙.山茶炭疽病菌生物學特性研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學，2005(4):316-318.

[7] 韓長志.炭疽菌屬真菌分類研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].中國植保導刊，2015(6):24-30.

BiologicalcharacteristicsofthepathogenofGloeosporiumtheae-sinensisinCamelliajaponica/

HAN Changzhi,et al.

(Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province;College of Forestry,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

The biological characteristics ofGloeosporiumtheae-sinensis，the pathogen of camellia anthracnose were studied.The results showed that the optimal conditions for the growth of the pathogen was PDA media,28 ℃,pH 7,with carbon source as soluble starch,nitrogen source as peptone.

Gloeosporiumtheae-sinensis;camellia anthracnose;biological characteristics;Kunming city

2015-10-27

國家自然科學基金項目(31560211)，云南省優(yōu)勢特色重點學科生物學一級學科建設項目(50097505)，云南省高校林下生物資源保護及利用科技創(chuàng)新團隊(2014015)，云南省森林災害預警與控制重點實驗室開放基金項目(ZK150004)，云南省教育廳科學研究基金項目(2014Y330)

韓長志(1981—)，男，博士，講師，河北省石家莊人，從事經(jīng)濟林木病害生物防治與真菌分子生物學的科研工作，E-mail:hanchangzhi2010@163.com。

S763.15

A

1671-0886(2017)02-0026-03

(責任編輯 楊靜莉)