宮永勝，苑志宇，張 濤，呂文發(fā)*，王 軍,3*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林省科技創(chuàng)新平臺(tái)管理中心，吉林長春 130012；3. 錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001）

初情期啟動(dòng)過程中MeCP2和GnRH在母羊下丘腦的分布定位

宮永勝1，苑志宇1，張 濤2，呂文發(fā)1*，王 軍1,3*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林省科技創(chuàng)新平臺(tái)管理中心，吉林長春 130012；3. 錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001）

本實(shí)驗(yàn)旨在研究甲基化CpG結(jié)合蛋白（MeCP2）和促性腺激素釋放激素（GnRH）初情期啟動(dòng)過程中在母羊下丘腦的分布及二者關(guān)系。選取初情期前、臨近初情期和初情期階段雌性小尾寒羊各3只，采集下丘腦，利用免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)研究MeCP2和GnRH在母羊下丘腦視前區(qū)（POA）和弓狀核（ARC）中的分布。結(jié)果表明：MeCP2和GnRH在下丘腦ARC和POA均有分布，且呈現(xiàn)共表達(dá)模式，ARC中共表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)在初情期顯著高于初情期前期和臨近初情期（P<0.05），POA中共表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)初情期顯著低于初情期前期和臨近初情期（P<0.05）。結(jié)果提示，MeCP2可能通過調(diào)控下丘腦GnRH的表達(dá)而參與母羊初情期啟動(dòng)的調(diào)控。

初情期；下丘腦；MeCP2；GnRH；免疫熒光

初情期是動(dòng)物從幼年向獲得繁殖能力過渡的重要階段，其啟動(dòng)時(shí)間關(guān)系到動(dòng)物的繁殖性能和相關(guān)疾病的發(fā)生，初情期啟動(dòng)過程極其復(fù)雜，其機(jī)制尚未完全闡明[1]。現(xiàn)已明確，下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamic-Pituitary-Gonadal Axis，HPG）的激活能夠引起母畜的初情期啟動(dòng)[2]。研究表明，HPG軸活化受DNA甲基化的調(diào)控，激活相關(guān)基因的表達(dá)，從而參與初情期啟動(dòng)過程[3-4]。甲基化CpG結(jié)合蛋白（Methyl-CpG-Binding Protein 2，MeCP2）可協(xié)同DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA Methyltransferase 1，Dnmt1）維持甲基化水平，參與調(diào)控甲基化模式。MeCP2是下丘腦中一個(gè)關(guān)鍵的蛋白[5-6]，其在神經(jīng)細(xì)胞中作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子并調(diào)控基因活性[7]。

下丘腦中的視前區(qū)（Preoptic Area，POA）和弓狀核（Arcuate Nucleus，ARC）分布有大量的促性腺激素釋放激素（Gonadotropin Releasing Hormone，GnRH）神經(jīng)元胞體，MeCP2能夠調(diào)控基因的表達(dá)，參與初情期啟動(dòng)，但初情期啟動(dòng)過程中下丘腦MeCP2與GnRH的關(guān)系尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)研究初情期啟動(dòng)過程中MeCP2和GnRH在母羊下丘腦POA和ARC核團(tuán)的分布及二者的關(guān)系，為闡明母羊初情啟動(dòng)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 組織冰凍切片包埋劑、冰凍切片快速抗原修復(fù)液、免疫染色封閉液和含抗熒光淬滅封片液等試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司。GnRH（ab5617）和MeCP2（ab5005）抗體均購自Abcam公司；相應(yīng)免疫熒光二抗均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)樣品 采集初情期啟動(dòng)不同階段（初情期前，臨近初情期，初情期）母羊的下丘腦組織，下丘腦前端止于視交叉，后端止于乳頭體，置于4%多聚甲醛中固定48 h，首先轉(zhuǎn)入20%蔗糖PBS溶液，后轉(zhuǎn)入30%蔗糖PBS溶液中脫水，待其組織完全沉浸于溶液中，用組織冰凍切片包埋劑對(duì)組織進(jìn)行包埋，制作下丘腦組織冰凍切片，切片厚度25 μm，用于后續(xù)免疫熒光雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。

1.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 利用冰凍切片快速抗原修復(fù)液對(duì)組織切片進(jìn)行修復(fù)，TBST洗片5 min，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定、洗片，組織上滴加免疫染色封閉液，濕盒中37℃封閉1 h，以減少非特異性染色；棄去封閉液滴加GnRH一抗（稀釋比例為1:500），濕盒中4℃孵育過夜，擦干后滴加相對(duì)應(yīng)的熒光二抗（稀釋比例為1:60），37℃孵育1 h；洗凈后滴加MeCP2一抗（稀釋比例為1:100），4℃孵育過夜后，滴加對(duì)應(yīng)的熒光二抗（稀釋比例為1:60），同時(shí)對(duì)組織進(jìn)行復(fù)核染，滴加DAPI室溫孵育5 min，用含抗熒光淬滅劑的封片液進(jìn)行封片，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 通過Olympus激光共聚焦顯微鏡配套ZEN軟件分析免疫熒光圖片并統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)量。應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan′s法進(jìn)行多重比較確定各組之間的差異顯著性，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeCP2和GnRH在下丘腦POA的分布 如圖1所示，在母羊下丘腦中POA均有MeCP2和GnRH分布，且二者呈現(xiàn)共表達(dá)模式。如圖2所示，初情期前期和臨近初情期下丘腦陽性細(xì)胞數(shù)差異不顯著（P>0.05）,初情期陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于初情期前期和臨近初情期（P<0.05）。

圖1 MeCP2和GnRH在下丘腦中POA的分布

圖2 母羊初情期啟動(dòng)過程MeCP2與GnRH在下丘腦POA的共表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)

2.2 MeCP2和GnRH在下丘腦ARC的分布 如圖3所示，在下丘腦ARC核團(tuán)中均有MeCP2和GnRH分布，且二者呈現(xiàn)共表達(dá)模式。如圖4所示，初情期前期和臨近初情期陽性細(xì)胞數(shù)差異不顯著（P>0.05），初情期陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于初情期前期和臨近初情期（P<0.05）。

圖3 MeCP2和GnRH在下丘腦中ARC的分布

3 討 論

圖4 母羊初情期啟動(dòng)過程中MeCP2與GnRH在下丘腦ARC的共表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)

初情期啟動(dòng)受HPG軸的調(diào)控，垂體前葉分泌促性腺激素刺激卵泡發(fā)育，與此同時(shí)，性腺類固醇激素也對(duì)下丘腦起到反饋調(diào)節(jié)作用，調(diào)控GnRH分泌[8]。下丘腦中POA和ARC是GnRH神經(jīng)元主要分布的核團(tuán)，也是GnRH神經(jīng)元接受性腺類固醇激素反饋的關(guān)鍵位[9]。最近，有證據(jù)顯示，DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)重要的方式之一，其可調(diào)節(jié)初情期啟動(dòng)關(guān)鍵基因的表達(dá)[10]。MeCP2作為一種重要的表觀遺傳因子，不僅具備轉(zhuǎn)錄抑制功能，而且還能夠協(xié)同Dnmt1維持基因組的甲基化模式[6]，其在初情期啟動(dòng)過程中的作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MeCP2在下丘腦POA和ARC均有分布，主要分布于母羊下丘腦ARC，其與GnRH存在明顯的共表達(dá)，且初情期啟動(dòng)時(shí)ARC共表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多。

GnRH脈沖水平是初情期啟動(dòng)的關(guān)鍵，初情期啟動(dòng)時(shí)下丘腦ARC的GnRH表達(dá)水平顯著上升。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，母羊初情期時(shí)下丘腦GnRH水平顯著高于初情期前和臨近初情期。目前，有關(guān)MeCP2在哺乳類動(dòng)物下丘腦中分布報(bào)道甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著初情期啟動(dòng)，MeCP2和GnRH在ARC和POA呈現(xiàn)共表達(dá)模式，且在初情期時(shí)ARC核團(tuán)共表達(dá)水平最高。上述證據(jù)表明，MeCP2可能通過調(diào)節(jié)下丘腦GnRH表達(dá)水平而參與母羊初情期啟動(dòng)，但要明確MeCP2對(duì)母羊初情期啟動(dòng)的作用及機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，初情期啟動(dòng)過程中MeCP2在母羊下丘腦POA和ARC核團(tuán)均有分布，其與GnRH存在共表達(dá)模式；隨著初情期的到來，MeCP2與GnRH在ARC共表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)顯著上升。

[1]Rzeczkowska P A, Hou H, Wilson M D,et al. Epigenetics:a new player in the regulation of mammalian puberty[J].Neuroendocrinology, 2014, 99(3-4): 139-155.

[2]Plant T M. Neuroendocrine control of the onset of puberty[J]. Front Neurondocrin, 2015, 38(7): 73-88.

[3]Kurian J R, Terasawa E. Epigenetic control of gonadotropin releasing hormone neurons[J]. Front Endocrinol, 2013,4(4): 61.

[4]韓威, 李慧芳, 朱云芬, 等. GnRH依賴型性早熟遺傳調(diào)控系統(tǒng)研究進(jìn)展[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào), 2013, (1): 1-5.

[5]Chahrour M, Jung S Y, Shaw C,et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription[J]. Science, 2008, 320(5880): 1224-1229.

[6]Kimura H, Shiota K. Methyl-CpG-binding protein,MeCP2, is a target molecule for maintenance DNA methyltransferase, Dnmt1[J]. J Biol Chem, 2003, 278(7):4806-4812.

[7]Zhao Y T, Goffin D, Johnson B S,et al. Loss of MeCP2 function is associated with distinct gene expression changes in the striatum[J]. Neurobiol Dis, 2013, 59(11):257-266.

[8]Ojeda S R, Lomniczi A, Sandau U,et al. New concepts on the control of the onset of puberty[J]. Endocr Res, 2010,17: 44-51.

[9]Wankowska M, Polkowska J. Gonadotrophin-releasing hormone and GnRH-associated peptide neurobiology from the rearing period until puberty in the female sheep[J]. J Chem Neuroanat, 2009, 38(1): 9-19.

[10]Zielske S P. Epigenetic DNA methylation in radiation biology: on the field or on the sidelines? [J]. J Cell Biochem, 2014, 116(2): 212-217.

S826.3

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-053

2017-10-09；

2017-10-30

國家自然科學(xué)基金（31402073）；遼寧省科技廳自然科學(xué)基金（2014022050）；吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（JJKH20170319KJ）

宮永勝（1992-），男，吉林長春人，碩士，主要從事動(dòng)物生殖調(diào)控研究，E-mail：380728795@qq.com

*通訊作者：呂文發(fā)，教授，E-mail：wenfa2004@163.com；王軍，副教授，E-mail：junwang2004@126.com