陶勇 楊關(guān)根 裘建明 徐侃 王東 汪鴻濤

人催乳素受體蛋白在肛周膿腫患者中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

陶勇 楊關(guān)根 裘建明 徐侃 王東 汪鴻濤

目的 探討人催乳素受體蛋白在肛周膿腫組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，預(yù)測可能作為肛周膿腫預(yù)后的一個生物標(biāo)志物。方法 收集2015年08月至2016年08月杭州市第三人民醫(yī)院肛腸外科收治的肛周膿腫行手術(shù)切排并經(jīng)病理證實的60例患者的肛管黏膜組織標(biāo)本（肛周膿腫組）及臨床資料。另取年齡、性別、體重相匹配的8例單純痔病患者的肛管黏膜組織標(biāo)本作為對照（對照組）。運用免疫組織化學(xué)（免疫組化）和Western blot方法檢測兩組標(biāo)本中催乳素受體蛋白表達(dá)水平，并結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計分析。同時采用單因素及多因素Logistic回歸分析探討組織中PRLR表達(dá)水平與肛周膿腫預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，PRLR蛋白陽性的棕色顆粒主要彌漫性分布在細(xì)胞膜中，部分可見于細(xì)胞質(zhì)。其中在膿腫組肛管黏膜中低表達(dá)率為68.33%（41/60）及高表達(dá)率31.67%（19/60），與對照痔病組PRLR蛋白高表達(dá)相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.701，p＜0.05）；同時Western Blot結(jié)果顯示PRLR蛋白在膿腫組中的表達(dá)灰度比值（0.515±0.067）明顯低于對照組灰度比值（0.836±0.035）（t=3.14，p＜0.01）；全組患者未愈為34例，占56.67%。其中PRLR低表達(dá)與高表達(dá)，分別為79.41%（27/41）和20.59%（7/19）。單因素及多因素分析顯示，膿腫性質(zhì)（OR=7.911，95% CI：1.115~20.161，P=0.039）、膿腫切口（OR=3.246，95%CI：0.774~5.742，P=0.042）及 PRLR 低表達(dá)量（OR=9.099，95%CI：1.727~14.426，P=0.016）是肛周膿腫患者預(yù)后不良的獨立危險因素（均p＜0.05）。結(jié)論 PRLR蛋白在肛周膿腫患者肛管黏膜組織中表達(dá)顯著降低，同時低表達(dá)的PRLR對判斷手術(shù)后肛周膿腫患者預(yù)后具有較好的參考價值。

肛管； 預(yù)后； 催乳素受體； 肛周膿腫

肛周膿腫是肛腸外科常見病，每年新發(fā)病例逐漸上升，多見于年輕男性，急性發(fā)作時往往表現(xiàn)為局部紅腫熱痛，嚴(yán)重影響青壯年的生活質(zhì)量［1］。目前，多認(rèn)為系經(jīng)典的肛腺感染學(xué)說，關(guān)于其發(fā)病分子機(jī)制鮮有新的探索［2］。因此，進(jìn)一步研究肛周膿腫形成的相關(guān)分子病理機(jī)制，尋找有助于臨床治療的指標(biāo)或新靶點，是目前研究的熱點與難點。催乳素受體（prolactin receptor，PRLR），是由位于人第五號染色體的短臂（5p13-14）基因表達(dá)的產(chǎn)物，屬于Ⅰ型細(xì)胞因子受體超家族，與激素及細(xì)胞因子等信號傳遞密切相關(guān)［3］。近來研究發(fā)現(xiàn)，PRLR在多種炎性疾病組織中高表達(dá)，提示其可影響局部組織免疫微環(huán)境，在參與刺激免疫細(xì)胞增殖及產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子機(jī)制中可能起到重要作用［4-6］。本研究采用免疫組織化學(xué)（免疫組化）和免疫印跡（Western blot）方法同時檢測肛周膿腫患者的膿腫壁組織和膿腫旁組織中PRLR蛋白的表達(dá)，結(jié)合患者的臨床資料，旨在分析人肛周膿腫壁組織PRLR蛋白的表達(dá)以及與臨床病理機(jī)制的關(guān)系。

資料與方法

一、 研究對象

肛周膿腫患者入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）初次確診肛周膿腫［1］，且未經(jīng)任何治療；（2）排除其他感染性疾病比如炎癥性腸炎、肛管炎等；（3）排除合并嚴(yán)重的心肺肝腎疾病及溶血性疾病等。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，收集2015年08月至2016年08月杭州市第三人民醫(yī)院肛腸外科收治的60例肛周膿腫行手術(shù)切排并經(jīng)病理證實的肛管黏膜組織標(biāo)本（肛周膿腫組）及臨床資料；其中男34例，女26例，年齡21~55（35.0±7.4）歲。另取年齡、性別、體重相匹配的8例單純痔病患者的肛管黏膜組織標(biāo)本作為對照（對照組）。

二、 標(biāo)本收集

分別取每例患者術(shù)中標(biāo)本的肛管黏膜組織，其中肛周膿腫患者組織命名為A、單純痔病患者組織命名為B，各2份；一份放入液氮中保存，另一份經(jīng)4%多聚甲醛固定后行石蠟包埋。本研究標(biāo)本的收集均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，患者或其家屬簽署知情同意書。

三、 實驗儀器與試劑

鼠抗人PRLR多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）、鼠抗人α-tubulin多克隆抗體（美國ABclonal公司）、生物素化山羊抗鼠抗體（美國cell signal 公司）、免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒（購于武漢博士德生物工程有限公司）

四、 研究方法

1.免疫組織化學(xué)染色（LP方法）：（1）對肛周膿腫及單純痔病患者肛管黏膜組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚5 um，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化，枸櫞酸緩沖液高溫修復(fù)抗原，PBS漂洗3次后以0.3%過氧化物氫-甲醇孵育10 min，清除內(nèi)源性的過氧化物酶活性，PBS漂洗4次后滴加5% BSA封閉液，室溫孵育60 min，傾去，滴加1：100鼠抗人PRLR多克隆抗體，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS漂洗3次后，再滴加二抗，室溫孵育20 min，PBS漂洗4次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，PBS代替一抗作陰性對照；（2）結(jié)果判斷：陰性為無染色或小于等于5%細(xì)胞胞質(zhì)染色；陽性為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒（弱陽性：淡棕色胞質(zhì)染色或小于25%細(xì)胞棕黃色染色；強(qiáng)陽性：大于或等于25%細(xì)胞胞質(zhì)棕黃色）。

2.Western blot 檢測：從60例配對的肛周膿腫患者中采用隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)抽取挑出8例患者及全部的8例單純痔病患者，并均從標(biāo)本庫中取出相應(yīng)的凍存組織，用細(xì)胞蛋白裂解液提取D0和D5組織的總蛋白，測定蛋白濃度。配制分離及濃縮膠的丙烯酰胺溶液。電泳分離蛋白后濕轉(zhuǎn)法冰浴環(huán)境轉(zhuǎn)移至PVDF膜。轉(zhuǎn)移后的PVDF用5% TBSA脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后加入鼠抗人PRLR多克隆抗體（1:1 000）室溫孵育1 h。洗膜后加入生物素化山羊抗鼠抗體（1:5 000）孵育1 h。洗膜后滴加ECL試劑室溫孵育2~5 min，在暗房中曝光，顯影定影后膠片保存攝片，掃描保存為電腦文件。每例樣品均分別進(jìn)行3次檢測，image J灰度分析軟件將3次獨立實驗的Western blot 結(jié)果圖片上每個特異條帶灰度值數(shù)字化，其中PRLR表達(dá)水平以PRLR和α-tubulin灰度比值表示。

五、 隨訪方法

隨訪由專門的隨訪小組通過電話、信函及復(fù)診的方式完成。療效判定標(biāo)準(zhǔn)：（1）痊愈：癥狀消失，膿腫腔和創(chuàng)面愈合；（2）未愈：治療后局部創(chuàng)面未愈，或存在局部膿腔，演變?yōu)楦丿洠换蛘吒刂苣撃[已經(jīng)治愈。但在原部位復(fù)發(fā)。隨訪3月終止。

六、 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，催乳素受體蛋白的表達(dá)量與肛周膿腫患者的臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗。采用單因素二分類Logistic回歸預(yù)測分析影響肛周膿腫預(yù)后相關(guān)的因素，將單因素分析得到的有統(tǒng)計學(xué)意義的變量納入多項Logistic回歸進(jìn)行多因素分析，計算比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（95% CI），以p＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 免疫組化結(jié)果兩組標(biāo)本PRLR表達(dá)比較

免疫組化結(jié)果顯示，PRLR蛋白在肛周膿腫組（A）低表達(dá)（弱陽性）率為68.33%（41/60）及高表達(dá)（強(qiáng)陽性）率31.67%（19/60），與單純痔病對照組（B）PRLR蛋白高表達(dá)（強(qiáng)陽性）相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.701，p＜0.05）。陽性的棕色顆粒主要彌漫性分布在細(xì)胞膜中，部分可見于細(xì)胞質(zhì)。圖1。

圖1 免疫組化檢測PRLR結(jié)果×100（箭頭指示）：1A肛周膿腫患者肛管黏膜標(biāo)本高表達(dá)；1B肛周膿腫患者肛管黏膜標(biāo)本低表達(dá)；1C痔瘡患者肛管黏膜標(biāo)本高表達(dá)；1D痔瘡患者肛管黏膜標(biāo)本低表達(dá)

二、 Western blot結(jié)果兩組標(biāo)本PRLR表達(dá)比較

Western Blot結(jié)果顯示PRLR蛋白在肛周膿腫患者肛管黏膜組織（A）中的表達(dá)灰度比值為（0.515±0.067）明顯低于對應(yīng)的單純痔病對照組（B）灰度比值（0.836±0.035）（t=3.14，P＜0.01）。見圖2。

圖2 A 兩組標(biāo)本W(wǎng)estern blot相對灰度比值 圖2B兩組患者Western blot檢測PRLR蛋白電泳結(jié)果

三、 PRLR表達(dá)與肛周膿腫患者臨床病理特征的關(guān)系

PRLR蛋白表達(dá)與膿腫患者膿腫范圍（χ2=6.406，P=0.011）、膿腫性質(zhì)（χ2=6.782，P=0.009）相關(guān)（均P＜0.05），而與年齡（χ2=0.960，P=0.327）、性別（χ2=0.477，P=0.490）、BMI指數(shù)（χ2=2.330，P=0.127）、藥物治療史（χ2=2.080，P=0.179）及膿腫位置（χ2=0.960，P=0.327）等無相關(guān)（均P＞0.05）（見表1）。

四、 PRLR表達(dá)與肛周膿腫預(yù)后的關(guān)系

60例肛周膿腫隨訪期間，無失訪病例。全組患者未愈為34例，占56.67%。其中PRLR低表達(dá)與高表達(dá)，分別為65.85%（27/41）和36.84%（7/19），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.450，P＜0.05）（見圖3）。單因素二分類Logistic回歸預(yù)測分析結(jié)果顯示，膿腫范圍、膿腫性質(zhì)、膿腫切口及PRLR低表達(dá)量與患者預(yù)后相關(guān)（均P＜0.05）（見表2）。進(jìn)一步多項Logistic回歸進(jìn)行多因素分析結(jié)果顯示，膿腫性質(zhì)（OR=7.911，95%CI：1.115~20.161，P=0.039）、膿腫切口（OR=3.246，95%CI：0.774~5.742，P=0.042） 及 PRLR 低表 達(dá) 量（OR=9.099，95%CI：1.727~14.426，P=0.016）是肛周膿腫患者預(yù)后不良的獨立危險因素（均P＜0.05）（見表3）。

表1 PRLR表達(dá)與肛周膿腫患者臨床病理特征的關(guān)系

圖3 PRLR高表達(dá)與低表達(dá)總體治愈率的比較

表2 PRLR表達(dá)與肛周膿腫預(yù)后的單因素關(guān)系

表3 PRLR表達(dá)與肛周膿腫預(yù)后的多因素關(guān)系

討 論

盡管對于肛周膿腫的感染機(jī)制及手術(shù)方式的研究已經(jīng)取得了較好的進(jìn)展，但要闡明其分子機(jī)制仍有大量的工作需要完成，而分析肛周膿腫組織與正常組織中的蛋白差異性表達(dá)是研究其發(fā)病機(jī)制的重要途徑之一。催乳素受體（PRLR）屬于Ⅰ型細(xì)胞因子受體超家族成員，由三種不同的短型、中間型和長型結(jié)構(gòu)域蛋白串聯(lián)而組成的一種模體。其中通過結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用，使得配體/受體結(jié)合，傳遞生物信號，調(diào)控基因表達(dá)，實現(xiàn)復(fù)雜的生物功能［7-8］。

據(jù)文獻(xiàn)報道，在關(guān)節(jié)炎、自身免疫性炎癥、動脈硬化、心肌炎等多種組織中，PRLR在炎性組織中表達(dá)具有特異性變化［9-12］。本研究從臨床表型入手，60例肛周膿腫肛管黏膜標(biāo)本通過免疫組化和Western blot兩種實驗方法分析PRLR的表達(dá)情況。免疫組化實驗結(jié)果顯示，陽性棕色顆粒彌漫分布在細(xì)胞各處，主要以胞膜為主，也有部分分布在細(xì)胞質(zhì)中，提示PRLR可能起到胞膜上的受體信號傳遞作用。而肛周膿腫組織PRLR多數(shù)成低表達(dá)，推測PRLR低表達(dá)量可能促進(jìn)了肛周炎性的發(fā)展變化。相關(guān)病理亦證實［13］，PRLR受體蛋白低表達(dá)于巨噬細(xì)胞膜表面，傳遞第二信號，增強(qiáng)炎癥因子的表達(dá)。近年來，巨噬細(xì)胞在炎癥組織中高表達(dá)，可預(yù)測疾病的預(yù)后情況［14］。Feuerstein等［15］人研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞高度存在皮膚黏膜感染組織中。因此，本研究嘗試對比肛周膿腫患者的臨床病理資料，解釋PRLR蛋白表達(dá)與肛周膿腫的關(guān)系。結(jié)果顯示，PRLR低表達(dá)與患者的肛周膿腫范圍及膿腫復(fù)雜程度相關(guān)，進(jìn)一步提示PRLR蛋白低表達(dá)與肛周膿腫形成及進(jìn)展機(jī)制關(guān)系密切。Soto等［16］在研究細(xì)菌感染機(jī)制時，發(fā)現(xiàn)PRLR低表達(dá)可通過抑制對SHK-1細(xì)胞TLR1和TLR5M的免疫刺激，參與感染形成，與本實驗結(jié)果一致。而同時，Vicent Goff i n等［17］人提出PRLR表達(dá)情況可作為疾病預(yù)后的獨立指標(biāo)。因此，為了進(jìn)一步研究PRLR低表達(dá)情況與肛周膿腫預(yù)后關(guān)系，本研究通過建立在隨訪臨床資料與PRLR表達(dá)量的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，進(jìn)行了單因素及多因素的Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，膿腫復(fù)雜程度、膿腫單切口及PRLR低表達(dá)量是肛周膿腫患者預(yù)后的獨立危險因素?？蛇M(jìn)一步分析得出，PRLR低表達(dá)量與肛周膿腫患者未俞關(guān)系密切。已有研究表明［18］，長期未愈/復(fù)發(fā)炎癥病灶存在刺激局部組織免疫微環(huán)境，通過調(diào)節(jié)PRLR低表達(dá)量，減少誘導(dǎo)內(nèi)源性TNF-α、IL-6和IL-β等細(xì)胞因子釋放，進(jìn)而促使炎癥惡化。因此，我們推測低表達(dá)量PRLR可減少誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞釋放炎性因子，進(jìn)而參與肛周膿腫感染機(jī)制的形成及預(yù)后不良密切相關(guān)。雖然本研究的實驗結(jié)果也從臨床角度分析了上述基礎(chǔ)實驗的結(jié)論，但PRLR低表達(dá)受多種調(diào)節(jié)因素影響，可能需要聯(lián)合其他指標(biāo)提高預(yù)測復(fù)發(fā)的敏感性和特異性。

綜上所述，人PRLR在肛周膿腫患者組織中表達(dá)顯著降低，同時低表達(dá)的PRLR對判斷術(shù)后肛周膿腫患者預(yù)后具有較好的參考價值。但是因為PRLR調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，其是否可以作為臨床上可應(yīng)用的肛瘺復(fù)發(fā)的預(yù)測指標(biāo)，尚需要進(jìn)一步的深入研究。

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Association of prolactin receptor experssion in human perianal abscess with postoperative prognosis

Tao Yong, Yang Guangen, Qiu Jianming, Xu Kan, Wang Dong, Wang Hongtao.
Department of Colorectal Surgery, Zhejiang Chinese Medicine University Aff i liated No.3 Hangzhou Hospital, Hangzhou 310009, China

Xu Kan, Email: 15168427344@qq.com

Objective To investigate the association of prolactin receptor (PRLR) expression in human perianal abscess with its prognosis,which may be a new prognosis biomarker of perianal abscess-related.Methods Clinical data and resection samples of 60 patients with perianal abscess identif i ed by pathology undergoing resection in our department from August 2015 to August 2016 were collected as well as 8 patients receiving only hemorroidectomy (control group), matching with perianal abscess group in age, gender and body weight. The PRLR expression in perianal abscess tissues and matched nonabscess tissues collected was detected by immunohistochemical staining and Western blotting. The associations of PRLR level with overall prognosis,clinicopathological features were analyzed, univariate and multivariate logistic regression analysis. Results Immunohistochemical staining showed that the positive brown granules were mainly distributed on the cell membrane,and also in cytoplasm partially. And the low expression of PRLR protein in perianal abscess group was 81.67% (41/60) and high espression wsa 31.67% (19/60), which was significantlyhigher than that of control group (p＜0.05). The relative gray value of Western blotting in perianal abscess tissues were 0.515±0.067, which were significantly lower than those of matched nonabscess tissues(0.836±0.035 andp＜0.05). Patients with low expression of PRLR protein had poor prognosis than those with low expression (68.85% vs. 36.84%,p＜ 0.05). Univariate and Multivariate logistic regression analysis showed that the complexity of abscess (OR=7.911, 95%CI: 1.115~20.161, P=0.039), the number of surgical incision (OR=3.246, 95%CI: 0.774~5.742, P=0.042) and the expression of PRLR protein (OR=9.099,95%CI: 1.727~14.426, P=0.016) were independent risk factors for poor prognosis of patients with perianal abscess (allp＜0.05). Conclusions PRLP expression in perianal abscess patient was low, which may be a valuable in predicting prognosis.

Anal canal; Prognosis; Prolactin receptor; Perianal abscess

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2017.06.009

杭州市科技局重點專科專病項目（No.20160533B27；No.20150733Q28）；浙江省自然科學(xué)基金項目（No.LY15H030001；LY15H160001）

310009 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州第三人民醫(yī)院肛腸科

徐侃，Email：15168427344@qq.com

2017-05-22）

楊明）

陶勇, 楊關(guān)根, 裘建明, 等. 人催乳素受體蛋白在肛周膿腫患者中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系 [J/CD]. 中華結(jié)直腸疾病電子雜志, 2017, 6(6): 488-493.