林孝坤 王永飚 趙一鳴 姚賢明 蔡祖仁 吳大洲

雷帕霉素對(duì)睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響

林孝坤 王永飚 趙一鳴 姚賢明 蔡祖仁 吳大洲

目的 研究雷帕霉素對(duì)睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。方法 用不同濃度的雷帕霉素(1、10、50、100nmol/L)處理睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞，設(shè)空白組和陰性對(duì)照組。采用CCK-8法測(cè)定不同濃度雷帕霉素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度雷帕霉素對(duì)細(xì)胞周期及凋亡的影響。結(jié)果 雷帕霉素可以抑制睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性，除1nmol/L濃度組外，其余濃度組各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與陰性對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。雷帕霉素可以誘導(dǎo)睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞停留在G0/G1期，除1nmol/L濃度組外，其余濃度組G0/G1期細(xì)胞比例及細(xì)胞凋亡率顯著高于陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論 雷帕霉素能夠抑制睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

卵黃囊瘤 雷帕霉素 細(xì)胞生長(zhǎng) 細(xì)胞凋亡

卵黃囊瘤是由胚胎外系生殖細(xì)胞異常分化而形成的，又稱為內(nèi)胚竇瘤，是最常見且高度惡性的兒童生殖細(xì)胞腫瘤，約占兒童睪丸腫瘤發(fā)病率的50%[1-2]。目前臨床上睪丸卵黃囊瘤的治療方法主要是手術(shù)治療，同時(shí)輔以化療或放療，但聯(lián)合化療不良反應(yīng)大，使化療的作用受到限制，總療效還欠理想[3]。深入探討睪丸卵黃囊瘤發(fā)病的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)早期診斷的指標(biāo)以及潛在的治療靶點(diǎn)，是當(dāng)前睪丸卵黃囊瘤研究的一項(xiàng)重要內(nèi)容。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,不僅在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯等生物學(xué)功能中發(fā)揮著重要作用，而且參與調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡等過程[4]。雷帕霉素是一種mTOR特異性抑制劑，對(duì)多種惡性腫瘤如胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌瘤[5]、胃癌[6]、前列腺癌[7]、頭頸部鱗癌[8]等具有一定的抑制作用，但對(duì)睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的影響鮮有報(bào)道。本研究旨在探討雷帕霉素對(duì)睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，為睪丸卵黃囊瘤的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑 睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞由復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究中心經(jīng)原代培養(yǎng)建立,生長(zhǎng)穩(wěn)定,其生物學(xué)特性經(jīng)過鑒定。雷帕霉素為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，青鏈霉素雙抗為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；FBS為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品；EDTA為美國(guó)Amersco公司產(chǎn)品；CCK-8試劑盒、流式凋亡試劑盒為日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品；二甲基亞砜為上海華舜生物工程公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS、100U/ml青霉素及 100μg/ml鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。1.2.2 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)率 以1×104/孔的密度將睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后，采用不同濃度（1nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L）的雷帕霉素溶于DMSO中處理細(xì)胞，設(shè)空白組（無細(xì)胞僅有培養(yǎng)液）和陰性對(duì)照組（有細(xì)胞但不加藥），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。分別于加藥后24、48、72h每孔加入10μl CCK-8試劑，培養(yǎng)箱孵育2h，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照組吸光度值-實(shí)驗(yàn)組吸光度值）/（對(duì)照組吸光度值-空白組吸光度值）。實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)3次。

1.2.3 PI染色法測(cè)定細(xì)胞周期 以1×105/孔的密度將睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞接種于6孔板，用不同濃度（1、10、50、100nmol/L）的雷帕霉素溶于DMSO中處理細(xì)胞，設(shè)立陰性對(duì)照組（有細(xì)胞但不加藥）。處理24h后，胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌2次，70%冷乙醇固定細(xì)胞2h，用含RNA酶的PI溶液染色，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量,實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)3次。

1.2.4 Annexin V/PI雙染色法測(cè)定細(xì)胞凋亡 以1×105/孔的密度將睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞接種于6孔板，用不同濃度（1、10、50、100nmol/L）的雷帕霉素溶于 DMSO 中處理細(xì)胞，設(shè)立陰性對(duì)照組（有細(xì)胞但不加藥）。處理24h后，采用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作：胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌2次，用1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。加入Annexin V-FITC，室溫下在暗室孵育10min；PI溶液共染色細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析。實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較方差齊性采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度雷帕霉素對(duì)睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較 見表1。

由表1可見，除1nmol/L濃度組外，其余3個(gè)濃度組各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與陰性對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。隨藥物濃度的提高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，雷帕霉素對(duì)睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，呈濃度和時(shí)間依賴性。

表1 不同濃度雷帕霉素對(duì)睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較（%）

2.2 不同濃度雷帕霉素對(duì)睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞周期及凋亡的影響 見圖1、表2。

由圖1、表2可見，除1nmol/L濃度組外，其余3個(gè)濃度組G0/G1期細(xì)胞比例及細(xì)胞凋亡率顯著高于陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

睪丸卵黃囊瘤是小兒外科最常見的惡性腫瘤之一,好發(fā)于3歲以內(nèi)的嬰幼兒，不僅惡性程度較高，而且病情進(jìn)展快，病死率高[9]?；谀[瘤分期的靜脈化療是當(dāng)前手術(shù)治療睪丸卵黃囊瘤之外最重要的手段之一。雖然這兩者的結(jié)合提高了患兒的生存率，但是由于化療藥物的不良反應(yīng)及腫瘤的耐藥性使得其在治療上受到了嚴(yán)重的限制[10]。而mTOR抑制劑不僅可以通過抑制mTOR信號(hào)通路從而起到腫瘤抑制作用，同時(shí)與傳統(tǒng)的化療藥物相比其毒副反應(yīng)較低，特異性較強(qiáng)。

雷帕霉素是一種從大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，最初用作抗真菌藥物，隨后由于發(fā)現(xiàn)其免疫抑制功能而在臨床上主要用于器官移植后的抗排異作用。目前已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以通過抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等發(fā)揮其抗腫瘤作用[11-13]。本研究結(jié)果表明，1、10、50、100nmol/L 的雷帕霉素作用睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞24、48和72h后，對(duì)睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，且這種抑制效應(yīng)與藥物濃度和作用時(shí)間密切相關(guān)。這也表明雷帕霉素作為mTOR的抑制劑，可以通過抑制睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過程中mTOR信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子mTOR活性，從而起到一定的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用。因此，深入研究mTOR抑制劑的機(jī)制及作用，有望為睪丸卵黃囊瘤的靜脈化療提供新的治療方案，也有望成為睪丸卵黃囊瘤治療的新靶點(diǎn)。

圖1 不同濃度雷帕霉素對(duì)睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞凋亡影響的流式細(xì)胞圖（a：陰性對(duì)照組；b：1nmol/L濃度組；c：10nmol/L濃度組；d：50nmol/L濃度組；e：100nmol/L濃度組；Annexin-fitc：異硫氰酸工熒光素標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V；PI：碘化丙啶）

表2 不同濃度雷帕霉素對(duì)睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞周期及凋亡的影響（%）

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的過程主要有DNA合成前期（G0/G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2/M期）3個(gè)時(shí)期。如果將腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過程的任一周期阻斷，則可以阻滯腫瘤細(xì)胞的增殖和抑制腫瘤的生長(zhǎng)。本研究流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組相比，10、50、100nmol/L的雷帕霉素作用于睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞24h后，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，而S期與G2/M期細(xì)胞則減少，同時(shí)睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞的凋亡率則明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且具有藥物濃度依賴性。這也進(jìn)一步表明雷帕霉素將睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過程中細(xì)胞周期阻滯在了G0/G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制了睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞的增殖。

綜上所述，本次研究所采用mTOR靶向抑制劑雷帕霉素作用于體外培養(yǎng)的小兒睪丸卵黃囊瘤細(xì)胞，可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，并且導(dǎo)致細(xì)胞凋亡明顯增加，為下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，亦為探討mTOR能否作為小兒卵黃囊瘤治療分子靶點(diǎn)提供可行性，但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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Effect of rapamycin on growth and apoptosis of testicular yolk sac tumor cells

LIN Xiaokun，WANG Yongbiao,ZHAO Yiming，et al.Department of Pediatric Surgery，the Second Affiliated Hospital and Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027，China

Objective To investigate the effect of rapamycin on the growth and apoptosis in testicular yolk sac tumor(YST)cells. Methods The testicular YST cells were treated with rapamycin of different concentrations(1nmol/L,10nmol/L,50nmol/L and 100nmol/L).The growth rate for testicular YST cells was evaluated by CCK-8 method,the cell cycle and apoptosis rate were determined by flow cytometry. Results Rapamycin inhibited the growth of testicular YST cells in a concentration and time-dependent manner(P＜0.05).Rapamycin at all concentrations except 1nmol/L induced the apoptosis of testicular YST cells,and also induced cell cycle arrest at G0/G1 phase(P＜0.05). Conclusion Rapamycin can significantly inhibit the cell growth and induce the apoptosis of testicular YST cells.

Yolk sac tumor Rapamycin Cell growth Cell apoptosis

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.22.2016-172

溫州市科技局資助項(xiàng)目（Y20140243）；國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委資助項(xiàng)目（2011C1-80）

325027 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、溫州醫(yī)科大學(xué)附屬育英兒童醫(yī)院小兒外科（林孝坤、王永飚、趙一鳴、蔡祖仁、吳大洲）；杭州市兒童醫(yī)院小兒外科（姚賢明）

王永飚，E-mail：qtwyb@163.com

2016-10-13）（本文編輯：馬雯娜）