余智 顧蘇兵 于民 邵曉莉 洪小琴 姜慧華 吳燕飛

[Gly14]-Humanin對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的影響

余智 顧蘇兵 于民 邵曉莉 洪小琴 姜慧華 吳燕飛

目的 探討Humanin衍生物（[Gly14]-Humanin，HNG）預(yù)處理對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。方法 將96只健康雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為HNG組、生理鹽水組、模型組及假手術(shù)組，每組24只。采用改良的Zea-longa線栓法制備大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型，HNG組大鼠術(shù)前5 d給予HNG（2 μl/kg），生理鹽水組與假手術(shù)組大鼠予0.9%氯化鈉溶液（2 ml/kg）,均為股靜脈注射，1次/d；模型組不作處理。各組大鼠在再灌注24 h后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分（NDS），采用ELISA法測(cè)定大鼠腦組織核因子-κB p65（NF-κB p65）及干擾素-γ（IFN-γ）水平，原位末端標(biāo)記染色觀察凋亡細(xì)胞數(shù)及尼氏染色檢測(cè)健存神經(jīng)細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 HNG組、生理鹽水組、模型組及假手術(shù)組NDS分別為1.5（1.0,2.0）分、3.0（2.0,3.0）分、3.0（2.0,3.0）分和0.0（0.0,0.0）分，假手術(shù)組NDS低于另外3組，HNG組NDS低于模型組和生理鹽水組（均P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，HNG組、生理鹽水組及模型組大鼠的NF-κB p65水平[（13.48±0.85）、（22.15±0.96）、（22.62±0.64）pg/mg]，IFN-γ水平[（5.17±0.67）、（10.83±0.34）、（10.81±0.19）pg/mg]及凋亡細(xì)胞的百分率[（48.09±7.62）%、(70.19±8.33）%、（69.02±9.07）%]均較高，不重疊高倍鏡視野中尼氏小體的數(shù)量[（10.57±0.51）、（5.16±0.56）和（5.65±0.98）個(gè)]較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HNG組大鼠的NDS、NF-κB p65和IFN-γ水平及細(xì)胞凋亡率均低于生理鹽水組及模型組，尼氏小體數(shù)多于生理鹽水組及模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HNG組大鼠IFN-γ與NF-κB p65水平呈正相關(guān)（r=0.873，P＜0.01）。結(jié)論 [Gly14]-Humanin可抑制腦缺血再灌注損傷過程中的局部炎癥反應(yīng)、減少細(xì)胞的凋亡，從而減輕臨床神經(jīng)功能的缺損。其機(jī)制可能與下調(diào)腦組織NF-κB p65的釋放，進(jìn)一步減少IFN-γ的表達(dá)有關(guān)。

[Gly14]-Humanin 腦缺血再灌注 核因子-κB p65 干擾素-γ 細(xì)胞凋亡

缺血性腦血管病具有較高的發(fā)病率、病死率、致殘率及復(fù)發(fā)率，是目前臨床重點(diǎn)防治的一種疾病。提高患者的療效及改善預(yù)后是臨床實(shí)踐中迫切需要解決的難題。近年來，炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷機(jī)制中的地位越來越受到關(guān)注[1]，既往的實(shí)驗(yàn)研究也已證實(shí)，核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和炎性細(xì)胞的浸潤均參與了腦缺血再灌注損傷過程[2]。新近研究表明，Humanin衍生物（[Gly14]-Humanin，HNG）可通過受體的介導(dǎo)及抗凋亡這兩條途徑發(fā)揮對(duì)腦外傷神經(jīng)保護(hù)作用，但目前鮮有HNG對(duì)腦缺血再灌注影響的報(bào)道。本研究通過觀察HNG對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損、炎性因子及細(xì)胞凋亡的影響，初步探討HNG對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，為缺血性腦血管病的藥物治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 大鼠與分組 健康雄性SD大鼠（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF級(jí)）96只，體重250~300（279.75±18.71）g，按隨機(jī)數(shù)字法分為 HNG 組、生理鹽水組、模型組及假手術(shù)組，每組24只。HNG組、生理鹽水組、模型組大鼠均完成大腦中動(dòng)脈阻塞造模，假手術(shù)組大鼠在術(shù)中不插入尼龍線，僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈。HNG組大鼠造模前5d給予HNG（2μl/kg），假手術(shù)組與生理鹽水組給予0.9%氯化鈉溶液（2 ml/kg），連續(xù) 5d股靜脈注射，1次/d；模型組術(shù)前不作藥物處理。

1.1.2 藥物、主要試劑與儀器 HNG購自美國R&D Systems公司；核因子-κB p65（NF-κB p65）及干擾素-γ（IFN-γ）ELISA試劑盒購自美國Promega公司；甲苯胺藍(lán)、原位末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒購自美國Sigma公司；酶標(biāo)儀購自德國Heraeus公司，電子顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，Labo fuge 400R高速低溫離心機(jī)購自美國BioTek公司等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的制備 采用改良的Zea-longa法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注損傷模型[3]。采用10%水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔注射麻醉成功后，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，頸部左旁正中切開皮膚約2~3cm，鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，避免損傷迷走神經(jīng)。結(jié)扎并游離頸外動(dòng)脈主干一段，予蛙心夾關(guān)閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈后在頸外動(dòng)脈游離段上剪一小口將進(jìn)口尼龍魚線栓經(jīng)頸總動(dòng)脈分支處通過頸內(nèi)動(dòng)脈入顱，深度為（18.0±0.5）mm，使大腦中動(dòng)脈栓塞并留置1cm左右的線栓頭于體外；缺血4.5h后無需再次麻醉直接外拉尼龍線抽出頸內(nèi)動(dòng)脈約20 mm。模型成功判斷標(biāo)準(zhǔn)：大鼠蘇醒后出現(xiàn)左側(cè)Horner征，爬行時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈或跌倒；提尾懸拉后出現(xiàn)右前肢蜷縮屈曲。剔除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后4.5h之內(nèi)未蘇醒者；并發(fā)蛛網(wǎng)膜下腔出血者；鏡下觀察無缺血病理改變者（觀察的是大鼠缺血側(cè)的腦組織，在鏡下未發(fā)現(xiàn)明顯凋亡細(xì)胞者則說明造模不成功，予以剔除）。造模過程中大鼠死亡或不符合模型要求，予以剔除并隨機(jī)補(bǔ)充，模型制備方法同上述，以保證每組樣本量保持在24只。1.2.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分（NDS） 再灌注24h后，采用單盲法行Zea-longa 5分制法對(duì)4組大鼠進(jìn)行計(jì)分；（1）0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀，活動(dòng)正常者；（2）1分：不能完全伸展右前肢；（3）2分：左側(cè)Horner征，爬行時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；（4）3分：爬行時(shí)身體向右側(cè)傾倒；（5）4分：不能自發(fā)爬行或意識(shí)障礙。

1.2.3 測(cè)定腦組織勻漿液NF-κBp65及IFN-γ水平每組分別抽取12只大鼠，于麻醉成功后立即斷頭取腦，切除枕部和額部，于冰上距額葉前端4mm和8mm處進(jìn)行冠狀分離，取中間4mm厚的腦組織塊，沿矢狀縫兩側(cè)約2mm處，從上至下切除兩側(cè)半球的正中結(jié)構(gòu)，將左側(cè)部分的勻漿液，按照檢測(cè)試劑盒說明，采用ELISA檢測(cè)勻漿液中NF-κB p65及IFN-γ的含量水平。

1.2.4 觀察凋亡細(xì)胞及尼氏小體染色 缺血4.5h再灌注24h后，4組分別取另外12只大鼠行腹腔麻醉，之后以4℃肝素化0.9%氯化鈉溶液對(duì)大鼠進(jìn)行快速心臟灌洗，直到右心房流出的液體變清即可斷頭。然后續(xù)用4℃4%多聚甲醛溶液快速灌注固定直到全身僵硬，斷頭取腦固定于10%的甲醛溶液中，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，于視交叉處從前至后連續(xù)冠狀切片（厚約 2μm），置37℃溫箱內(nèi)過夜烤干分別進(jìn)行TUNEL染色和尼氏染色，按照試劑盒檢測(cè)步驟進(jìn)行嚴(yán)格操作。TUNEL染色切片在光鏡下（×400）觀察凋亡細(xì)胞（胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒），取5個(gè)不重復(fù)高倍鏡視野（×400），計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞率（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%）。尼氏染色切片在光鏡（×400）下以缺血皮層區(qū)隨機(jī)取5個(gè)不重疊高倍鏡視野對(duì)尼氏小體的數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算尼氏小體的數(shù)目/相應(yīng)面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，首先對(duì)各組計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Nemenyi檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠NDS的比較 HNG組NDS計(jì)1.5（1.0，2.0）分；假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能缺損，計(jì)0.0（0.0，0.0）分；生理鹽水組及模型組均為3.0（2.0，3.0）分。假手術(shù)組NDS低于其它3組，HNG組NDS低于生理鹽水組和模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.2 4組大鼠腦組織NF-κB p65及IFN-γ水平、凋亡細(xì)胞率及尼氏小體的比較 見表1。

表1 4組大鼠腦組織NF-κB p65及IFN-γ水平、凋亡細(xì)胞率及尼氏小體的比較

由表1可見，與假手術(shù)組大鼠比較，HNG組、生理鹽水組及模型組腦組織NF-κB p65及IFN-γ水平、細(xì)胞凋亡率均較高，而尼氏小體數(shù)較少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與生理鹽水組及模型組比較，HNG組大鼠的NF-κB p65和IFN-γ水平、細(xì)胞凋亡率較低，尼氏小體數(shù)較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；生理鹽水組與模型組NF-κB p65及IFN-γ含量水平、細(xì)胞凋亡率及尼氏小體數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

此外，光鏡下顯示假手術(shù)組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞很少表達(dá)（圖1a），且尼氏小體數(shù)目多且體積大，呈紫色均勻分布于核周圍（圖2a）；生理鹽水組和模型組凋亡細(xì)胞較多表達(dá)（圖1b、c）、體積形態(tài)不一，而尼氏小體數(shù)目減少，即使存在的尼氏小體亦發(fā)生變形或變?。▓D2b、c）。HNG組凋亡細(xì)胞較生理鹽水組和模型組大鼠減少（圖1d），體積形態(tài)亦基本一致，而尼氏小體數(shù)目較上述2組均增多且變形較少（圖2d）。

圖1 原位末端標(biāo)記染色結(jié)果（a：HNG組見少量凋亡細(xì)胞表達(dá)；b、c：生理鹽水組和模型組凋亡細(xì)胞明顯增多；d：假手術(shù)組未見明顯的凋亡細(xì)胞；TUNEL 法，×400）

2.3 HNG組大鼠腦組織NF-κB p65與IFN-γ水平的相關(guān)性 HNG組大鼠腦組織IFN-γ與NF-κB p65含量水平呈顯著正相關(guān)（r=0.873，P＜0.01）。

3 討論

圖2 尼氏染色結(jié)果（a：HNG組尼氏小體較多；b、c：生理鹽水組和模型組尼氏小體數(shù)量明顯減少；d：假手術(shù)組大鼠腦組織尼氏小體多；Nissl法，×400）

臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，急性腦缺血后在4.5h內(nèi)應(yīng)用重組人組織型纖溶酶原激活物（rt-PA）靜脈溶栓恢復(fù)血液灌流時(shí)發(fā)生再灌注損傷而使神經(jīng)功能缺損加重，認(rèn)為再灌注時(shí)受血液流變學(xué)和缺血缺氧的改變引起神經(jīng)細(xì)胞釋放大量的炎癥介質(zhì)，促進(jìn)炎性細(xì)胞的聚集和炎性因子的釋放[4]，導(dǎo)致腦缺血損傷區(qū)炎性細(xì)胞浸潤，加速神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。其中炎性細(xì)胞的激活和多種炎性因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)均參與其中。炎癥反應(yīng)的要素包括轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)傳導(dǎo)分子、黏附分子和炎癥細(xì)胞[5]。目前已知，NF-κB存在于神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等幾乎所有細(xì)胞中，由NF-κB p65與NF-κB p50組成二聚體，而前者亞單位中含有激活轉(zhuǎn)錄的處理區(qū)并能與其他細(xì)胞基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列發(fā)生特異性結(jié)合而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)以及細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等密切相關(guān)[6]。其中小膠質(zhì)細(xì)胞被缺血激活后，轉(zhuǎn)變?yōu)橥淌杉?xì)胞，釋放蛋白水解酶、一氧化氮、氧自由基及細(xì)胞因子（如 IFN-γ、TNF-α、IFN-α、IL-1及IL-6）的等細(xì)胞毒性物質(zhì)。而IFN-γ作為一種重要的細(xì)胞因子，介導(dǎo)周圍組織的細(xì)胞毒效應(yīng)，產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)，加重腦缺血損傷。有研究表明，IFN-γ通過活化p38激酶，誘導(dǎo)Ⅱ類組織相容性復(fù)合體和細(xì)胞因子的表達(dá)[7]。

近期大量的體外實(shí)驗(yàn)表明，HNG不僅能有效地抑制多種阿爾茨海默病相關(guān)致病因子（如黃素腺嘌呤二核苷酸基因突變及胸膜肺炎放線桿菌抗體等）誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，還能保護(hù)各種應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的各類損傷，包括I/R誘導(dǎo)的小鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、脂多糖誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)等[8]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明HNG不僅能改善東莨菪堿[9]，二苯乙醇酸及β-淀粉樣肽相關(guān)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)記憶功能的損害，還能改善AD轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[10-11]。此外，研究還進(jìn)一步證實(shí)HNG除能抵御外傷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜完整性的破壞抑制顱腦損傷誘導(dǎo)的自噬激活和凋亡，減少腦缺損體積，改善記憶和運(yùn)動(dòng)障礙之外[12]，還能改善小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞誘導(dǎo)的急性腦卒中的運(yùn)動(dòng)功能并減少損傷側(cè)大腦半球的梗死體積[13]。

人們發(fā)現(xiàn)通過藥物模擬缺血預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值，故備受關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血4.5h再灌注24h后，發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能缺損；生理鹽水組及模型組神經(jīng)功能缺損癥狀較重，而經(jīng)HNG預(yù)處理的大鼠NDS明顯輕于生理鹽水組及模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明HNG預(yù)處理對(duì)改善腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能缺損具有積極意義。

本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)HNG預(yù)處理的大鼠腦組織NF-κB p65及IFN-γ水平低于生理鹽水組及模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，生理鹽水組及模型組NF-κB p65及IFN-γ水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；有研究報(bào)道，NF-κB可以通過激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，釋放IFN-γ，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[14]。本研究行相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)，HNG組大鼠腦組織NF-κB p65與IFN-γ水平呈正相關(guān)。上述結(jié)果表明HNG可降低誘發(fā)NF-κB p65的釋放，進(jìn)而減少IFN-γ的水平，從而改善臨床神經(jīng)功能缺損癥狀。細(xì)胞凋亡是由于細(xì)胞內(nèi)外因素激活細(xì)胞本身自殺性程序而引起的一種細(xì)胞死亡形式，也是一個(gè)復(fù)雜的生理性調(diào)節(jié)機(jī)制，受到細(xì)胞外因子和細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控，同時(shí)也參與正常細(xì)胞的更新及調(diào)節(jié)細(xì)胞分化。從本研究的TUNEL染色和尼氏小體染色結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組及模型組大鼠凋亡細(xì)胞較多表達(dá)，且尼氏小體數(shù)目減少，即使存在的尼氏小體亦發(fā)生變形或變小，而經(jīng)HNG預(yù)處理的大鼠缺血半暗帶中細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少而尼氏小體數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明HNG具有延緩或阻止缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，相應(yīng)的健存的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增多，這對(duì)腦缺血再灌注損傷的防治具有重要的意義。

綜合上述研究結(jié)果，HNG預(yù)處理可減少腦缺血再灌注損傷過程中的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而改善神經(jīng)功能缺損程度，其機(jī)制可能與HNG下調(diào)腦組織中NF-κB p65的水平，進(jìn)一步減少促炎介質(zhì)的釋放有關(guān)，這為其在缺血性腦血管疾病治療中的應(yīng)用提供一定的理論參考。本研究未對(duì)不同劑量的HNG療效進(jìn)行觀察，有待在今后作進(jìn)一步比較。

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Effect of [Gly14]-Humanin on inflammation and cell apoptotic in brain tissue after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats

YU Zhi,GU Subing,YU Min,et al.Department of Rehabilitation Medicine,the First People's Hospital of Chun'an County,Hangzhou 311700,China

Objective To investigate the effect of[Gly14]-Humanin(HNG)on inflammation and cell apoptosis in brain tissue after focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Ninety-six male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operation group,model group,normal saline (NS)group and HNG group with 24 rats in each group.The ischemia-reperfusion model was induced by middle cerebral artery occlusion(MCAO)with Zea-longa suture embolism method in rats.HNG (2μl/kg)or normal saline (2ml/kg)were given to rats in HNG and NS group 5 days before operation (i.v.qd x5),respectively.After 4.5h of cerebral ischemia and 24h of reperfusion,neurological deficit score(NDS)was assessed,the NF-κB p65 and IFN-γ levels in cerebral tissue were measured by ELISA,neuron apoptosis was detected by Nissl and TUNEL staining;the correlation between IFN-γ and NF-κB p65 levels in cerebral tissue was analyzed. Results The median NDS values in HNG,NS,model and sham-operation groups were 1.5(1.0,2.0),3.0(2.0,3.0),3.0(2.0,3.0)and 0.0(0.0,0.0),respectively;the NDS of sham-operation group was significantly lower than those of other three groups,the NDS of HNG group was significantly lower than that of model group and normal saline group(all P＜0.05).Compared with sham-operation group,the levels of NF-κB p65in HNG group,normal saline group and model group (13.48±0.85,22.15±0.96 and 22.62±0.64pg/mg),the levels of IFN-γ（5.17±0.67,10.83±0.34 and10.81±0.19pg/mg),the ratio of apoptotic neurocyte(48.09±7.62,70.19±8.33 and 69.02±9.07)were significantly increased,and the number of neurons(10.57±0.51,5.16±0.56 and 5.65±0.98)was significantly decreased(all P＜0.05).The NDS,NF-κB p65 and IFN-γ levels,ratio of apoptotic neurocytes in HNG group were significantly lower than those in NS group and model group;while the number of neurons was significantly higher than that in normal saline group and model group(all P＜0.05).The levels of IFN-γ was positively correlated with NF-κB p65 in HNG group (r=0.873,P＜0.01).Conclusion [Gly14]-Humanin can alleviate the inflammation and neuron apoptosis in brain tissue and mitigate the neurologic deficit after focal cerebral ischemia reperfusion injury,which may be associated with down-regulating NF-κB p65 and reducing IFN-γ levels.

[Gly14]-Humanin Cerebral ischemia/reperfusion NF-κB p65 IFN-γ Cell apoptosis

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.20.2016-1561

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（201482575）；杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20140633B66）

311700 淳安縣第一人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科（余智），神經(jīng)內(nèi)科（邵曉莉、洪小琴、姜慧華、吳燕飛）；浙江省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（顧蘇兵、于民）

余智，E-mail：wjy001982@163.com

2016-10-05）

楊麗）