王趙偉 厲芳 吳承龍 肖桂榮 鐘芳芳

沙利度胺抑制實驗性自身免疫性腦脊髓炎與促進Treg細胞中樞募集有關

王趙偉 厲芳 吳承龍 肖桂榮 鐘芳芳

目的 研究沙利度胺對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的治療作用及神經(jīng)免疫機制。 方法 采用豚鼠脊髓勻漿免疫誘導SD大鼠制作EAE模型。在免疫誘導當天開始，分別給予15、30、60mg/kg沙利度胺，溶劑組給予無菌溶劑，空白對照組不予給藥，每日監(jiān)測行為學評分，至免疫誘導的第20天統(tǒng)一處死。常規(guī)病理染色檢測中樞炎癥水平，流式細胞術檢測中樞CD4+T細胞浸潤水平以及CD4+CD25+Treg細胞比例，Elisa檢測血清INF-γ與TNF-α蛋白濃度。 結果 與溶劑組比較，給予15mg/kg沙利度胺大鼠EAE行為學評分、中樞炎癥程度、CD4+T淋巴細胞浸潤水平，血清INF-γ濃度均有下降趨勢但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而TNF-α濃度下降差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。給予30、60mg/kg沙利度胺均可使行為學評分下降，中樞炎癥減輕，中樞CD4+T細胞浸潤減少，血清INF-γ，TNF-α濃度降低。流式細胞術還發(fā)現(xiàn)沙利度胺可促進中樞Treg比例上調，差異有統(tǒng)計學意義。 結論 沙利度胺對大鼠EAE的治療作用可能與促進Treg細胞向中樞募集有關。

沙利度胺 多發(fā)性硬化 實驗性自身免疫性腦脊髓炎 調節(jié)性T細胞

多發(fā)性硬化是臨床常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病[1]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）是多發(fā)性硬化的經(jīng)典動物模型。多發(fā)性硬化與EAE的炎癥病灶均被發(fā)現(xiàn)存在致病性CD4+T細胞和調節(jié)性T細胞（Treg）[2-3]。調節(jié)性T細胞對于疾病恢復起關鍵作用。盡管已有多個修飾性治療新藥上市，但是療效不夠理想[4]。沙利度胺作為免疫調節(jié)作用的經(jīng)典藥物，近來發(fā)現(xiàn)對多種惡性腫瘤及自身免疫性疾病有效[5-7]。盡管確切藥理作用機制還不明[8]，但不良反應小且價格低廉，將其開發(fā)為治療藥物具有重要意義。本研究主要探討沙利度胺對于EAE的療效及相關神經(jīng)免疫機制，為后續(xù)臨床研究提供動物實驗基礎和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性 SD大鼠45只，11～12周齡，體重（448.5±24.3）g；豚鼠 14 只，雌雄不拘，10～12 周齡，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司；沙利度胺（批號：T144-1G）、完全弗氏佐劑（批號：F5881-6X10ml）、Percoll液（批號：P4937-500ml）均購自美國 Sigma-Aldrich公司；INF-γ（批號：RIF00）與 TNF-α（批號：RTA00）Elisa試劑盒購自上海安迪生物科技有限公司；別藻青蛋白（APC）標記的CD4抗體（批號：17-0040-82）、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的CD3抗體（批號：11-0030-82）、藻紅蛋白（PE）標記的CD25抗體（批號：12-0390-82）購自美國eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 將45只SD大鼠分為5個實驗組，即溶劑組、15mg/kg組、30mg/kg組、60mg/kg組（每組10只）、空白對照組（5只）。除空白對照組采用0.9%氯化鈉溶液與完全弗氏佐劑的混合乳劑免疫誘導外，其余4組均按EAE模型制作方法處理。4組中，溶劑組腹腔注射2%二甲基亞砜溶液，其余3組分別腹腔注射沙利度胺 15、30、60mg/kg。

1.2.2 EAE模型制作 參考文獻[9-10]及我們前期造模方法：所有豚鼠先采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，再用0.9%氯化鈉溶液左心室灌注處死并迅速剝離脊髓組織，加入等質量0.9%氯化鈉溶液后于玻璃勻漿器內進行充分勻漿，再加入等體積完全弗氏佐劑后用注射器反復抽打成油包水乳劑（0.4ml/只）。于SD大鼠四肢足墊皮下注射上述乳劑，即刻以及48h后，各腹腔注射1次百日咳毒素（均1ml）。造模當天計為第0天（d0）。

1.2.3 沙利度胺給藥 沙利度胺先用二甲基亞砜溶解，再用0.9%氯化鈉溶液稀釋，最終溶液含二甲基亞砜2%，沙利度胺濃度為90mg/ml。在d0開始用微量注射器腹腔注射方式給藥，連續(xù)15d，1次/d。

1.2.4 行為學評分 在d0～d20每日行為學評分，評分標準參考文獻[10]：無明顯異常：0分；尾巴無力：1分；輕微后肢無力：2分；嚴重后肢麻痹：3分；四肢麻痹：4分；瀕死或死亡：5分。在d0～d20各組大鼠每日行為學評分之和，計為累積評分，期間出現(xiàn)的最高行為學評分為最高評分。

1.2.5 常規(guī)病理檢測 在d20采用10%水合氯醛麻醉5組大鼠，用左心室灌注0.9%氯化鈉溶液的方法統(tǒng)一處死。剝離腦、脊髓組織，并在4%多聚甲醛中固定24 h，制成蠟塊后切片，用HE染色。普通光學顯微鏡觀察腦脊髓組織炎癥情況。按照參考文獻[11]標準進行評分：無

炎癥變化：0分；炎癥細胞浸潤僅限于血管周圍和脊膜周圍：1分；脊髓內輕微的炎癥細胞浸潤（1～10個細胞/片）：2分；脊髓內中度的炎癥細胞浸潤（11～100個細胞/片）：3分；脊髓內嚴重的炎癥細胞浸潤（＞100個細胞/片）：4分。

1.2.6 脊髓單核細胞分離與流式細胞術檢測 新鮮脊髓組織迅速用手術刀切碎，用Ⅳ型膠原酶消化45min，過濾后離心留取細胞沉淀，用不同濃度Percoll液離心獲得脊髓單核細胞，將單核細胞懸液濃度調整為2×105/ml，加25μl懸液于Eppendrf管，加入APC標記的CD4抗體，F(xiàn)ITC標記的CD3抗體，PE標記的CD25抗體各5μl，4℃冰箱避光反應 30min后上機（BD FACSAria）檢測,用Flowjo7.6.1軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.7 血清Elisa檢測 5組大鼠分別于左心室取血，獲得的血清標本用于INF-γ、TNF-α蛋白濃度檢測。按照試劑盒說明書要求，Elisa試劑盒、待測血清標本達室溫后進行檢測。將標準液、稀釋的血清標本用移液器移取到96孔板，移取抗體液等試劑到各孔后置搖床（500r/min）室溫孵育2h，清空各孔液體后重復洗板2次，清空各孔內液體，并拍盡孔內殘余液體，移取底物工作液等到各孔后室溫孵育1h，移取終止液到各孔，上機檢測光密度。最后根據(jù)光密度值擬合標準曲線來計算各標本濃度。1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件，計量資料采用表示。日均行為學評分采用兩因素多水平方差分析，其余組間比較采用單因素方差分析，多樣本間比較有統(tǒng)計學差異者進一步采用Dunnet t檢驗作兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 5組大鼠EAE發(fā)病情況及INF-γ、TNF-α水平比較 見表1。

由表1可見，60mg/kg組潛伏期大于溶劑組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），60mg/kg組行為學最高學評分、累積評分、d11評分、d19評分、血清INF-γ與TNF-α濃度小于溶劑組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。30mg/kg組行為學最高評分、累積評分、d19評分、血清INF-γ與TNF-α小于溶劑組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。15mg/kg組血清TNF-α濃度小于與溶劑組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。15mg/kg組潛伏期、行為學評分、血清INF-γ濃度與與溶劑組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。各沙利度胺處理組發(fā)病率與溶劑組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.2 5組大鼠EAE發(fā)病期中樞炎癥比較 見圖1。

表1 5組大鼠EAE發(fā)病情況及INF-γ、TNF-α水平比較

圖1 5 組大鼠 EAE 發(fā)病期中樞炎癥比較[a：溶劑組；b：15mg/kg組；c：30mg/kg組；d:60mg/kg組；e：空白對照組（×200）]

由圖1可見，溶劑組可見典型淋巴袖套形成，分布較多。15mg/kg組偶見典型淋巴袖套，單核細胞主要分布于脊髓膜下。30mg/kg及60mg/kg組較少見到典型淋巴袖套，炎性單核細胞主要分布于脊髓膜下，且數(shù)量較少?？瞻讓φ战M脊髓HE染色病理切片中未見明顯炎癥細胞浸潤。HE染色半定量分析顯示，30mg/kg組[（1.60±0.84）分]及60mg/kg組[（1.30±0.95）分]評分低于溶劑組[（2.90±0.1.20）分]，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。15mg/kg組[（2.401.27）分]與溶劑組比較評分有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 5組大鼠EAE發(fā)病期CD4+T、Treg細胞中樞募集水平比較 見圖2、表2。

圖 2 5 組大鼠 EAE 發(fā)病期 CD4+T、Treg細胞中樞募集水平比較（a：溶劑組 CD4+T；b：15mg/kg組 CD4+T；c：30mg/kg組 CD4+T；d：60mg/kg組 CD4+T；e：溶劑組 Treg細胞；f：60mg/kg組 Treg細胞）

由表2可見，15mg/kg組與溶劑組比較，CD4+T細胞比例、CD4+T數(shù)量有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，而30、60mg/kg組均有明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。進一步研究發(fā)現(xiàn)，60mg/kg組相對溶劑組中樞募集Treg細胞比例上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺可延遲EAE疾病發(fā)作，減輕臨床癥狀，抑制中樞炎癥細胞浸潤，減少炎癥因子INF-γ、TNF-α釋放。雖然已有沙利度胺抑制EAE的相關報道[12-13]，但我們進一步比較了不同劑量沙利度胺對EAE的治療效應。本研究發(fā)現(xiàn)15mg/kg治療劑量雖能有效抑制炎癥因子TNF-α釋放，但不能抑制SD大鼠EAE發(fā)病，但30mg/kg以及60mg/kg劑量均可抑制EAE發(fā)病。沙利度胺30mg/kg可能是起始有效劑量，而60mg/kg療效更加明顯。

表2 5組大鼠EAE發(fā)病期CD4+T、Treg細胞中樞募集水平比較

在多發(fā)性硬化或EAE發(fā)病過程中，CD4+T細胞是參與炎癥調控機制的主要淋巴細胞亞型[2]。CD4+T細胞隨著炎癥啟動從外周淋巴器官募集進入中樞，并釋放各類炎癥因子，刺激中樞吞噬細胞活化遷移，最終損傷少突膠質細胞甚至神經(jīng)元軸突[4]。CD4+T細胞中樞募集水平是與中樞炎癥程度成正比的。本研究通過HE染色經(jīng)光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，溶劑組脊髓內含有廣泛的單核淋巴細胞浸潤，而30mg/kg和60mg/kg沙利度胺可明顯抑制單核淋巴細胞浸潤。進一步通過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)30mg/kg和60mg/kg沙利度胺不僅減少了CD4+T細胞向中樞浸潤絕對數(shù)量，也降低了在中樞浸潤淋巴細胞中的比例。沙利度胺通過減少CD4+T細胞分化激活，抑制其向中樞募集而實現(xiàn)EAE治療作用。

MS/EAE疾病階段可以觀察到INF-γ、TNF-α等炎癥介質水平上調，是反應炎癥情況的觀測指標[14]。在脫髓鞘炎癥反應過程中INF-γ、TNF-α可以由致病性CD4+T細胞、巨噬細胞等免疫活性細胞釋放，可促進炎癥損傷。本研究發(fā)現(xiàn)30mg/kg和60mg/kg沙利度胺能抑制INF-γ、TNF-α蛋白濃度水平，但確切調節(jié)通路不明。

致病性CD4+T細胞激活、釋放相關炎癥介質的同時，Treg細胞也會分化激活，并向中樞炎癥區(qū)募集，釋放IL-10等免疫調控因子，抑制致病性CD4+T細胞繼續(xù)激活和釋放炎癥介質[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)MS患者存在Treg細胞分化激活功能受限，不能有效抑制中樞炎癥反應[15]。本研究通過對中樞浸潤CD4+T細胞亞型分析發(fā)現(xiàn)，沙利度胺可提高中樞Treg細胞比例。因此，沙利度胺可能通過促進Treg細胞亞型分化或促進Treg細胞從外周淋巴器官向中樞募集而抑制EAE。

總之，沙利度胺對多種自身免疫性疾病以及腫瘤性疾病有治療效應[4,16-17]，不良反應少，且較為廉價。本項研究發(fā)現(xiàn)沙利度胺30mg/kg以上治療劑量即可抑制SD大鼠EAE發(fā)病。而目前有效治療MS的藥物短缺[4]，利用沙利度胺或者開發(fā)出更加高效的結構類似物來治療多發(fā)性硬化具有臨床前景。

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Thalidomide alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis through promoting Treg cell recruitment in rats

WANG Zhaowei,LI Fang,WU Chenglong,et al.Department of Neurology,Shaoxing People'Hospital（Shaoxing Hospital of Zhejiang University）,Shaoxing 312000,China

Objective To investigate the effect of thalidomide on experimental autoimmune encephalomyelitis（EAE）in rats and its related mechanisms. Methods SD rates were injected with spinal cord homogenate of guinea pig(EAE group)or solvent(control group),then the rats were treated with thalidomide at different doses(15mg/kg,30mg/kg,60mg/kg).The clinic scores of EAE were assessed daily until animals were sacrificed.All rats were sacrificed at d20 after model induced and paraffin sections were prepared and stained with hematoxylin-eosin.Serum INF-γ and TNF-α levels were measured by ELISA.The spinal cord infiltrating CD4+T cells and CD4+CD25+T cells were determined by flow cytometry. Results Thalidomide 15mg/kg did not effectively reduce the severity of EAE,but reduced the TNF-α protein levels.Thalidomide 30mg/kg and 60mg/kg reduced the clinic score of EAE,the inflammation in the spinal cord,the number of infiltrating CD4+T cells and the INF-γ,TNF-α protein levels.And thalidomide 60mg/kg promoted CD4+CD25+T cell recruitment into central nervous system.Conclusion Thalidomide alleviated the severity of EAE in rats,which may be related to the promotion of CD4+CD25+T cell recruitment into central nervous system.

Thalidomide Multiple sclerosis EAE Treg cells

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.22.2016-2092

浙江省基礎公益研究計劃項目（LGF18H090018）；紹興市人民醫(yī)院青年科研基金項目（2017A10）

312000 紹興市人民醫(yī)院（浙江大學紹興醫(yī)院）神經(jīng)內科（王趙偉、吳承龍、肖桂榮、鐘芳芳）；杭州市蕭山區(qū)第一醫(yī)院神經(jīng)內科（厲芳）

吳承龍，E-mail：wuchlo7666@126.com

2016-12-13）

楊麗）