陳美惠，丁厚偉，張慶明，龔光明，朱 慶，王曙東

自組裝白蛋白納米粒作為阿克拉霉素A遞送載體

陳美惠1，丁厚偉1，張慶明1，龔光明1，朱 慶2，王曙東1

目的本研究旨在通過阿克拉霉素(ACM)共價(jià)結(jié)合氨基氧乙酸(AOA)產(chǎn)生的活性中間體，以降低ACM毒性和提高靶向藥物。方法采用三(2-羧乙基)膦(TCEP)作為二硫鍵斷裂分子，通過分子間的“打開-中間-閉合”開關(guān)制備人血清白蛋白(HSA)的自組裝納米粒(Nanoparticle，NPs)。結(jié)果核磁共振氫譜(1H-NMR)分析表明ACM和AOA之間的結(jié)合發(fā)生在ACM的酮基(12C)位置。HSA納米粒(NPs-ACM)負(fù)載ACM的載藥量為7.4%。NPs-ACM的釋放與pH相關(guān)。與游離ACM相比，NPs-ACM的細(xì)胞毒性和心臟毒性降低。體內(nèi)研究表明，NPs-ACM對(duì)荷瘤小鼠靶向性比游離ACM高4倍(Plt;0.05)。結(jié)論納米粒NPs-ACM前體藥物是理想的ACM腫瘤靶向藥物載體。

白蛋白；阿克拉霉素A；藥物遞送

阿克拉霉素(aclacinomycin，ACM)是來自于鏈霉菌屬(Streptomyces galilaeus)的一種強(qiáng)效抗生素，有抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II和拓?fù)洚悩?gòu)酶I毒素的作用[1]。ACM可用于有效治療多種人類惡性腫瘤。然而，ACM臨床使用中的兩個(gè)主要問題是導(dǎo)致心肌炎癥和骨髓抑制[2]。藥物輸送系統(tǒng)(drug delivery systems,DDS)用以增強(qiáng)制劑抗腫瘤作用，減少其毒性，并顯示出對(duì)腫瘤微環(huán)境的優(yōu)勢(shì)，引起了很大的關(guān)注[3]。不同的DDS，如乳劑、脂質(zhì)體和磁性納米粒均可作為ACM載體[4-5]。然而，靜脈注射乳劑可在肝臟和脾臟被單核吞噬系統(tǒng)(MPS)迅速吞噬[6]。此外，脂質(zhì)體的缺陷，如不穩(wěn)定和復(fù)雜的制備工藝，限制了其應(yīng)用。前藥可增加母體化合物預(yù)期的治療指數(shù)，同時(shí)以一種可控的方式降低其不利影響[7]。

人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是一種多功能血漿蛋白，能將鐵、藥物和小分子輸送到組織到身體各處。近年來，白蛋白因?yàn)槠錈o免疫原性、生物降解性和豐度，已成為合適的候選藥物載體[8]。HSA納米粒通過增強(qiáng)的滲透性和保留效應(yīng)(EPR)的被動(dòng)靶向和通過gp60受體引起的主動(dòng)靶向而具備雙靶向功能[9]。以HSA為基礎(chǔ)的DDS可以通過共價(jià)連接藥物熒光探針以及暴露的活性基團(tuán)或非共價(jià)組裝，如交聯(lián)和高壓均質(zhì)化被開發(fā)[10-11]。白蛋白的水化膜在去溶劑化法中易被破壞。ACM鹽酸鹽是水溶性的化學(xué)藥品。因此，前藥法是ACM制備DDS的一種合適的方法。各種交聯(lián)劑，如二硫腙肽[12]，可以在母體藥物釋放的微環(huán)境被代謝。這些交聯(lián)劑已用于DDS的制備腫瘤靶向化療[13]。目前，缺乏ACM的前藥遞送系統(tǒng)?；谶@些概念，本研究開發(fā)了氨基氧乙酸(AOA)為交聯(lián)劑的HSA納米粒(NPs-ACM)靶向遞送系統(tǒng)。AOA通過C=N鍵耦聯(lián)ACM，與TCEP為還原劑制備的HSA納米粒形成NPs-ACM。用電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)、核磁共振氫譜(1H-NMR)、藥物釋放、高分辨電鏡(HRTEM)、活體成像等方法對(duì)NPs-ACM進(jìn)行了表征。

1 材料與方法

1.1主要材料 HSA，近紅外797(NIR-797)和TCEP均購自Sigma Aldrich(圣路易斯，美國(guó))。阿克拉霉素鹽酸鹽(98%，化學(xué)級(jí))購自萬樂藥業(yè)有限公司(深圳，中國(guó))，小鼠肛門纖維肉瘤細(xì)胞S180和乳腺癌細(xì)胞MCF-7購自上海博谷生物公司，ICR小鼠(SPF級(jí),購自南通大學(xué),許可證號(hào)：2008001683031。通風(fēng)條件，室溫25 ℃，自由采食)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1合成AOA-ACM AOA-ACM和NPs-ACM的制備見圖1。100 mg的ACM溶解在10 mL的5%葡萄糖溶液，37 ℃條件下，加入100 mg AOA。3 h后，用100 mL氯仿提取AOA-ACM，蒸發(fā)至干燥。在室溫下，以四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo)，以Bruker AVANCE III光譜儀(400 MHz),1H-NMR分析ACM-AOA的結(jié)構(gòu)。電噴霧質(zhì)譜(ESI-M)定AOA-ACM的相對(duì)分子量。

①ACM；②AOA-ACM；③ACM中間體；④HSA；⑤TCEP還原的HSA分子暴露的疏水區(qū)域；⑥納米白蛋白；⑦NPs-ACM納米粒圖1 AOA-ACM的合成和NPs-ACM納米粒制備示意圖

1.2.2NPs-HSA及NPs-ACM的制備 200 mg的HSA在37 ℃下溶解于50 mL Tris buffer(5 mmol/L，pH 7.4)，添加TCEP(5 mmol/L)。攪拌10 min制備納米粒HSA。合成的納米HSA與AOA-ACM結(jié)合。HSA蛋白粒子耦聯(lián)AOA-ACM：2 mL二甲酰胺(DMF)溶解AOA-ACM(80 mg)，加入DCC(50 mg，0.225 mmol)和NHS(60 mg，0.51 mmol)?；旌衔镌谑覝叵聰嚢? h后0.45 μm小濾器(密理博公司產(chǎn)品)過濾，。上清液中加入HSA(200 mg)磷酸鹽緩沖液(10 mL)進(jìn)一步攪拌12 h。透析出去未結(jié)合的小分子后凍干。

1.2.3細(xì)胞攝取 異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記NPs-ACM：20 mg的前藥被溶解在2 mL碳酸氫鹽緩沖液(0.05 M)，加入2 mg FITC。溶液在37 ℃孵育12 h，pH 7.4的PBS透析。MCF-7細(xì)胞(1×105)/孔接種到共聚焦培養(yǎng)板(生物科技，美國(guó))后，培養(yǎng)24 h。用FITC標(biāo)記的NPs-ACM，等量的ACM(1 μmol/L)分別共培養(yǎng)2 h和4 h。PBS清洗去除殘留的FITC，并用400 μL 4，6-diamidino-2苯基吲哚(DAPI)染細(xì)胞核15 min，甲醇固定。奧林巴斯FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察細(xì)胞。FITC和DAPI的激發(fā)(EX)波長(zhǎng)和發(fā)射(EM)波長(zhǎng)分別為490 nm和525 nm，358 nm和461 nm。

1.2.4ACM和NPs-ACM的細(xì)胞毒性和心臟毒性 培養(yǎng)24 h后，MCF-7和S180腫瘤細(xì)胞與ACM和NPs-ACM孵育(0.1 ～100 μmol/L，pH 7.4) 共孵育24 h。每孔加入 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(5 mg/mL)10 uL，37 ℃孵育4 h后，加入200 μL二甲亞砜(DMSO)溶解甲瓚晶體。采用分光光度法(570 nm)測(cè)定甲瓚吸光度。組織病理學(xué)法評(píng)價(jià)ACM 和NPs-ACM的心臟毒性。15只健康雄性ICR小鼠(22～25 g)分為3組，每組5只。ACM組和NPs-ACM組第1天、第3天和第5天，注射入6 mg/kg游離ACM和NPs-ACM，對(duì)照組注射等滲鹽水。最后一次注射后4 d，剝離小鼠心臟，HE染色，并進(jìn)行組織學(xué)分析。

1.2.5荷瘤小鼠模型的構(gòu)建以及ACM和NPs-ACM的體內(nèi)分布 200 uL S180細(xì)胞懸浮液(5×105細(xì)胞/mL，PBS稀釋)注射至ICR小鼠左腋下，制備荷瘤小鼠模型。ACM和NPs-ACM按照6 mg/kg劑量靜脈注射荷瘤小鼠。48 h后，處死小鼠，取瘤組織、心、肝、脾、肺和腎。對(duì)照組小鼠注射等滲鹽水(0.1 mL/只)。用IVIS Spectum(Caliper，USA)成像系統(tǒng)分析，自發(fā)背景熒光利用軟件進(jìn)行抑扣除。激發(fā)波長(zhǎng)425 nm，發(fā)射波長(zhǎng)510 nm，評(píng)價(jià)ACM及前體藥物在各器官的分布。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1合成AOA-ACM1H-NMR顯示ACM可以通過其他的12C-酮基基團(tuán)與小分子AOA反應(yīng)形成AOA-ACM，見圖2。ESI-MS顯示AOA-ACM以正離子模式[M + H]形成離子峰，相對(duì)分子質(zhì)量為m/z=885.42，見圖3。

圖2 AOA-ACM的核磁共振氫譜

圖3 AOA-ACM的質(zhì)譜圖

2.2HSA蛋白與NPs-ACM外貌和大小 AOA-ACM與NPs-HSA粒子耦聯(lián)形成NPs-ACM前藥。HSA和NPs-ACM的半徑和外貌見圖4。兩者分別為10～18 nm及30～90 nm的球形粒子。粒徑100 nm可以獲得較好的靶向性能[14]。

a：游離的HSA；b：NPs-ACM粒子

圖4高分辨電鏡觀察粒子外貌和動(dòng)態(tài)光散射察粒子大小

2.3NPs-ACM的載藥量和體外釋放 紫外吸光法測(cè)定NPs-ACM的載藥量。HSA和ACM分別在280 nm和430 nm處具有吸收峰。納米粒中的HSA含量為42.5 mg/mL (BCA試劑盒定量)，ACM濃度為3.06 mg/mL。載藥率為3.06/42.5×100 = 7.4%。耦聯(lián)物中，ACM與HAS的比例為6∶1。36 h內(nèi)，pH5.0條件下，約60%的ACM從NPs-ACM釋放,而pH 7.2條件下，只有10%左右。NPs-ACM的釋放是依賴于酸不穩(wěn)定C=N之間的連接ACM和AOA部分。見圖5。

圖5不同pH條件下ACM從NPs-ACM中累積釋放

2.4NPs-ACM的體外細(xì)胞毒性和心臟毒性 結(jié)果顯示，NPs-ACM相對(duì)于ACM的細(xì)胞毒下降，見圖6?？赡芘cNPs-ACM相對(duì)分子量比較大，ACM迅速擴(kuò)散抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)。NPs-ACM釋放ACM依賴于細(xì)胞內(nèi)釋放酸性環(huán)境，在發(fā)揮抗腫瘤活性方面有滯后性。NPs-ACM穿透細(xì)胞膜較慢，進(jìn)入溶酶體后釋放ACM，呈現(xiàn)對(duì)抗腫瘤細(xì)胞較低的細(xì)胞毒性。其IC50較ACM大。

MTT測(cè)定細(xì)胞半數(shù)抑制率(n=6)

圖6 ACM和NPs-ACM對(duì)S180腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性

小鼠心臟組織病理分析結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，ACM組心臟顯示出了嚴(yán)重的空泡和嗜酸性病變，而NPs-ACM組與對(duì)照組無明顯的細(xì)胞病變，見圖7。顯示納米制劑對(duì)小鼠的心臟毒性顯著下降，可能與選擇性的腫瘤靶向有關(guān)。

2.5NPs-ACM細(xì)胞攝取 結(jié)果表明，NPs-ACM在MCF-7細(xì)胞質(zhì)中的濃度增加具有時(shí)間依賴性(2 h到4 h)。見圖8。

2.6ACM和NPs-ACM的體內(nèi)分布 結(jié)果顯示，NPs-ACM主要聚集于腫瘤和肝組織，在肝組織的熒光強(qiáng)度高于ACM，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。NPs-ACM對(duì)腫瘤的靶向性約為ACM的4倍(P= 0.023)。NPs-ACM的EPR效應(yīng)以及在血液循環(huán)時(shí)間的延長(zhǎng)可能是導(dǎo)致其對(duì)腫瘤靶向性的重要因素。見圖9。

a：等滲鹽水對(duì)照組; b：ACM組；c：NPs-ACM組

圖7各組小鼠心臟組織病理形態(tài)(HE ×200)

圖8 LSCM顯示FITC標(biāo)記的NPs-ACM在37 ℃下孵育2 h和4 h的MCF-7細(xì)胞

a:離體NIRF光學(xué)圖像；b:熒光定量

荷瘤小鼠注射游離ACM和NPs-ACM后，各器官或組織攜帶小鼠熒光量比較(n=3)，*Plt;0.05

圖9荷瘤小鼠ACM制劑的體內(nèi)分布

3 討 論

本研究提出了一種簡(jiǎn)便的方法，制備活性中間體和藥理物質(zhì)(含有酮基的ACM)靶向輸送系統(tǒng)。AOA與ACM在酮基的12C位置發(fā)生耦聯(lián)，隨后結(jié)合NPs-HSA生成NPs-ACM前藥，載藥量為7.4%。NPs-ACM的釋放依賴于pH。與游離ACM相比，NPs-ACM腫瘤靶向性大大提高,心臟毒性大大降低。因此，NPs-ACM是一種安全的、可注射的，有前景的用于腫瘤靶向的DDS。

[1] Nitiss JL，Pourquier P，Pommier Y. Aclacinomycin A stabilizes topoisomerase I covalent complexes[J]. Cancer Res，1997，57(20): 4564-4569.

[2] Ariji F，Shida K，Konno K，etal. Cardiotoxic study of aclacinomycin A. Subacute cardiotoxic effect of aclacinomycin A in rats (author's transl) [J].Jpn J Antibiot，1980，33(3): 281-293.

[3] 章 磊,流小舟,孫 暢,等.多途徑靶向給藥系統(tǒng)在骨肉瘤治療中的研究進(jìn)展[J]. 東南國(guó)防醫(yī)藥，2016，18(6)632-635.

[4] Shiokawa T，Hattori Y，Kawano K，etal. Effect of polyethylene glycol linker chain length of folate-linked microemulsions loading aclacinomycin A on targeting ability and antitumor effect in vitro and in vivo[J]. Clin Cancer Res，2005,11(5): 2018-2025.

[5] Wang J，Maitani Y，Takayama K. Antitumor effects and pharmacokinetics of aclacinomycin A carried by injectable emulsions composed of vitamin E，cholesterol，and PEG-lipid[J]. J Pharm Sci，2002，91(4):1128-1134.

[6] Jiang XH，Liao GT，Huang GQ，etal. The antihepatoma effect of lyophilized aclacinomycin A polyisobutylcyanoacrylate nanoparticles in vitro and in vivo[J].Yao Xue Xue Bao，1995，30(3):179-183.

[7] Wohl AR，Michel AR，Kalscheuer S,etal. Silicate esters of paclitaxel and docetaxel: synthesis，hydrophobicity，hydrolytic stability，cytotoxicity，and prodrug potential[J].J Med Chem，2014，57 (6)：2368-2379.

[8] Israel LL，Kovalenko EI，Boyko AA，etal.Towards hybrid biocompatible magnetic rHuman serum albumin-based nanoparticles: use of ultra-small (CeLn)3/4+ cation-doped maghemite nanoparticles as functional shell[J]. Nanotechnology，2015，26(4):045601.doi: 10.1088/0957-4484/26/4/045601.

[9] Kobayashi H，Watanabe R，Choyke PL. Improving conventional enhanced permeability and retention (EPR) effects; what is the appropriate target? [J] Theranostics，2014，4(1): 81-89.

[10] Wilson B，Ambika TV，Patel RD，etal.Nanoparticles based on albumin: preparation，characterization and the use for 5-flurouracil delivery[J].Int J Biol Macromol，2012， 51(5)： 874-878.

[11] Subia B，Kundu SC. Drug loading and release on tumor cells using silk fibroin-albumin nanoparticles as carriers[J]. Nanotechnology，2013，24(3)：035103. doi: 10.1088/0957-4484/24/3/035103.

[12] Kastl R，Wennemers H. Peptide-catalyzed stereoselective conjugate addition reactions generating all-carbon quaternary stereogenic centers[J].Angew Chem Int Ed Engl，2013，52 (28): 7228-7732.

[13] Kitamura I，Oki T，Inui T. A sensitive analytical method for aclacinomycin A and its analogs by thin-layer chromatography and fluorescence scanning[J]. J Antibiot (Tokyo)，1978,31(9):919-922.

[14] 龔光明，陳美惠，王曙東. 人血漿蛋白多烯紫杉醇納米粒子的自組裝及對(duì)腫瘤的靶向性[J].東南國(guó)防醫(yī)藥，2016，18(5)468-471.

2017-04-17；

2017-08-21)

(本文編輯：葉華珍； 英文編輯：王建東)

Self-assembledalbuminnanoparticlesasananocarrierforaclacinomycinA

CHEN Mei-hui1，DING Hou-wei1，ZHANG Qing-ming1，GONG Guang-ming1，ZHU Qing2，WANG Shu-dong1

(1.DepartmentofPharmaceuticalPreparation，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion，PLA，Nanjing210002，Jiangsu，China；2.CollegeofPharmacy，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，Jiangsu，China)

ObjectiveThis study aimed to reduce the cytotoxicity and improve the targeting of aclacinomycin (ACM) by covalently coupling it with amino-oxyacetic acid (AOA) to generate an active intermediate，AOA-ACM.MethodsAOA-ACM was conjugated with self-assembled human serum albumin (HSA) nanoparticles constructed using Tris (2-carboxyethy1) phosphine (TCEP) as disulfide bond breaking molecules.ResultsConjugation between ACM and albumin nanoparticles was found to occur at an ACM ketone site using 1H-NMR. The drug loading efficiency of ACM conjugated with HSA nanoparticles (NPs-ACM) was 7.4% (molar ratio=6:1). The release of NPs-ACM was pH dependent. The cytotoxicity and cardiotoxicity of NPs-ACM were reduced compared with the free ACM. Vivo studies indicated that NPs-ACM exhibited fourfold higher tumor targeting capability on S180-tumor-bearing mice compared with the free ACM (Plt;0.05).ConclusionThe NPs-ACM prodrug is ideal tumor targeting drug carriers for ACM.

Albumin；Aclacinomycin A；Drug delivery

R945

A

1672-271X(2017)06-0565-05

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.06.002

國(guó)家自然科學(xué)基金(31671026)

1.210002 南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科；2.210023 南京，南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院

王曙東，E-mail:sdwangpharm@126.com

陳美惠，丁厚偉，張慶明,等.自組裝白蛋白納米粒作為阿克拉霉素A遞送載體[J].東南國(guó)防醫(yī)藥，2017,19(6):565-569.