李雪霖 冉海濤 李 攀 郝 蘭 曹 陽 敖 夢 張 楠 宋 嬌 張 亮 易衡靜 王志剛

攜MAGE靶向金納米粒光聲及超聲顯像黑色素瘤的實驗研究

李雪霖 冉海濤 李 攀 郝 蘭 曹 陽 敖 夢 張 楠 宋 嬌 張 亮 易衡靜 王志剛

目的 制備抗黑色素瘤相關(guān)抗原（MAGE）抗體偶聯(lián)的載金納米棒靶向納米分子探針，探討其對體外惡性黑色素瘤細(xì)胞的靶向性，觀察其體外光聲成像效果。方法 采用雙乳化法制備包裹金納米棒和液態(tài)氟碳的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米粒，碳二亞胺法連接靶向MAGE的單克隆抗體，制備高分子多功能靶向PLGA納米分子探針，檢測其一般物理特性、MAGE抗體與納米粒的連接情況及其體外尋靶能力，并觀察體外光聲成像效果。結(jié)果 成功制備的靶向載金納米棒多功能納米分子探針平均粒徑（336.40±27.46）nm，平均Zeta電位（-4.34±4.9）mV。MAGE抗體與納米粒有效連接。體外尋靶能力實驗顯示黑色素瘤B16細(xì)胞株周圍有大量靶向納米探針環(huán)繞；光聲成像顯示隨金納米粒含量增加，其光聲信號逐漸增強(qiáng)。結(jié)論 MAGE抗體偶聯(lián)金納米棒納米分子探針制備成功，對體外惡性黑色素瘤細(xì)胞具有較好的生物活性，細(xì)胞靶向性較好，且體外光聲成像有明顯增強(qiáng)信號，可作為光聲成像造影劑，進(jìn)一步行腫瘤靶向光熱治療。

光聲技術(shù)；金納米棒；靶向納米探針；惡性黑色素瘤

隨著影像學(xué)發(fā)展，分子影像技術(shù)成為研究的熱點，其中光聲成像作為一種非入侵式和非電離式的新型生物醫(yī)學(xué)成像方法，其原理是當(dāng)脈沖激光照射到生物組織中時，組織的光吸收域?qū)a(chǎn)生超聲信號。這種光聲信號攜帶了組織的光吸收特征信息，使光聲成像能夠得到功能成像及分子水平的影像信息［1-2］。納米級的生物材料在影像學(xué)研究中能達(dá)到分子水平的疾病診斷及精準(zhǔn)治療［3-4］。其中，金納米棒具有獨特的可調(diào)節(jié)表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）光學(xué)特性，其光吸收系數(shù)高，能夠從分子學(xué)水平檢測腫瘤的病理學(xué)特征［5］。研究［6］表明金納米粒子的吸收和散射強(qiáng)度明顯強(qiáng)于大部分有機(jī)染料分子，在成像中具有顯著優(yōu)勢。黑色素瘤相關(guān)抗原（melanomas associated antigen，MAGE）為黑色素瘤特異性抗原，在惡性黑色素瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)。本實驗擬制備一種載金納米棒的高分子納米分子探針，其包裹相變材料液態(tài)全氟己烷（perfluorohexane，PFH），同時能連接MAGE抗體特異性靶向惡性黑色素瘤細(xì)胞，旨在探討納米分子探針的體外光聲成像效果，為腫瘤的早期診斷和靶向精準(zhǔn)治療開拓新的思路。

材料與方法

一、主要實驗材料及儀器

金納米棒（香港Nanoseedz公司）；PFH；聚乳酸-羥基乙酸-羧基（PLGA-COOH，50∶50 聚合比，分子量12 000 kDa，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司）；二氯甲烷；聚乙烯醇（Sigma）；異丙醇；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，Sigma）；熒光染料 DiI、DAPI；MES 緩沖液；Gibco 1640培養(yǎng)液；胎牛血清（PAN-biotech，德國）。小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16株（武漢普諾賽）；抗MAGE-1抗體（Bioye，中國）；四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體（Abcam，英國）。

聲振儀（Sonic，美國）；電子天平（Mettler Toledo，XS104，瑞士）；超聲清洗機(jī)（VCY-500，上海）；高速分散均質(zhì)機(jī)（XHF-D，寧波）；磁力攪拌器；Malvern激光粒徑及電位檢測儀（Malvern Zetasizer，美國）；紫外分光光度計（FEI Nova 450，美國）；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，美國）；激光共聚焦顯微鏡（LEICATCSSP2型）；奧林巴斯倒置熒光顯微鏡；光聲成像系統(tǒng)（Vevo LAZR，美國）。

二、實驗方法

1.靶向載金納米棒的PLGA液態(tài)氟碳納米粒的制備：采用雙乳化法制備非靶向納米探針，200μl金納米棒溶液加入200μl PFH；冰浴條件下使用聲振儀聲振1 min（占空比 5∶5，103 W），得到白色初乳液。將 50 mg PLGA-COOH加入2 ml二氯甲烷，充分混勻并予超聲清洗機(jī)振蕩完全溶解，再將上述初乳液加入到PLGA二氯甲烷溶液中，繼續(xù)聲振4 min，得到乳色復(fù)乳液。向復(fù)乳液中加入4%聚乙烯醇5 ml，以均質(zhì)機(jī)均質(zhì)5 min；然后加入2%異丙醇10 ml，使納米粒表面固化；使用磁力攪拌器攪拌3 h使二氯甲烷充分揮發(fā)；使用高速冷凍離心機(jī)離心3次（10 000 r/min，8 min），雙蒸水洗滌，收集得到非靶向GNR-PFH-PLGA納米粒。采用碳二亞胺法靶向修飾納米探針，將上述非靶向納米粒溶解于 1 ml MES緩沖液（0.1 mol/L，pH 值 5.5）中，加入耦聯(lián)活化劑 EDC 和 NHS（EDC∶NHS摩爾比為 1∶3，PLGA∶EDC 摩爾比為 1∶10），冰浴振蕩孵育 1 h，離心、PBS洗滌 3次后，復(fù)溶于 MES緩沖液（0．1 mol/L，pH值8）中，然后加入10μl抗MAGE抗體（抗MAGE抗體與PLGA摩爾比為1∶1），冰浴振蕩孵育過夜，再次離心、PBS洗滌3次，得到靶向GNR-PFH-PLGA納米粒，加入10μl的TRITC山羊抗鼠二抗，冰浴振蕩孵育4 h，離心、洗滌3次，溶于2 ml雙蒸水中，4℃保存。在第一步聲振前加入適量DiI熒光染料用于免疫熒光實驗。

2.靶向多功能納米分子探針的物理性質(zhì)檢測：光學(xué)顯微鏡觀察納米分子探針大小及均一度；Malvern激光粒徑檢測儀檢測其粒徑；Zeta電位檢測儀檢測其表面電位；透射電鏡觀察其表面形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)；紫外分光光度儀計算納米粒中金納米棒的包封率。取一定量納米粒經(jīng)低溫離心分離上清液，于780 nm波長處測定上清液吸光度，計算包封率［7］：包封率=（金納米棒投入量-上清液中金納米棒量）/金納米棒總投入量。

3.細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞培養(yǎng)于1640培養(yǎng)液中，均添加10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素雙抗，在37℃、5%二氧化碳條件下常規(guī)培養(yǎng)。

4.免疫熒光法檢測靶向納米探針表面抗MAGE及分組抗體連接情況及體外尋靶能力：各取1 ml靶向GNR-PFH-PLGA納米粒（靶向組），與非靶向GNRPFH-PLGA納米粒（非靶向組），分別加入兩個EP管中，并用 MES緩沖液（0.1 mol/L，pH 值 8）稀釋至 2 ml；避光條件下向兩個EP管中加入適量標(biāo)記TRITC的山羊抗鼠IgG；冰浴下振蕩孵育4 h，3次洗滌、離心；各取少量納米粒滴于激光共聚焦培養(yǎng)皿上，激光共聚焦顯微鏡觀察兩組對標(biāo)記TRITC的山羊抗鼠IgG的連接情況。常規(guī)培養(yǎng)的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞分為兩份，取對數(shù)生長期以適當(dāng)密度接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，將帶有DiI的靶向納米粒及非靶向納米粒分別加入細(xì)胞，37℃孵育1 h，PBS洗滌3次；使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，加入50μl細(xì)胞核染料DAPI，染色15 min，PBS洗滌3次；于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5.體外光聲成像實驗：制備濃度為1.570 mg/ml、3.125 mg/ml、6.250 mg/ml、12.500 mg/ml及 25.000 mg/ml的納米粒，各取100μl分別置于瓊脂糖凝膠模型（3%）中。激光觸發(fā)不同濃度納米粒，采用光聲成像儀（波長780 nm，重復(fù)頻率10 Hz，脈沖寬度5 ns，超聲探頭頻率10 MHz）進(jìn)行光聲信號的采集并生成二維圖像，并記錄光聲信號的變化。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，組間兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、靶向多功能納米分子探針的物理性質(zhì)檢測

成功制備的納米粒溶液呈乳白色懸濁液，粒徑為（336.40±27.46）nm，Zeta 電位為（-4.34±4.9）mV；光鏡下成圓球形，形態(tài)規(guī)則，表面光滑（圖1A）；透射電鏡下可見納米粒呈球形，大小分布均勻（圖1B），納米粒表面有金納米棒附著（圖 1C）；包封率為（53.74±6.31）%。

二、免疫熒光法檢測靶向納米探針表面抗MAGE抗體連接情況及體外尋靶能力

圖1 納米粒物理性質(zhì)檢測

激光共聚焦顯微鏡下白光通道見兩組納米粒呈圓球形透明狀，分散均勻。靶向組納米粒組熒光通道可見TRITC標(biāo)記的納米粒呈紅色，融合后見納米粒圖像重合良好；而非靶向組熒光通道未見熒光顯色，融合圖像無變化。見圖2。

經(jīng)DAPI染色的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞核呈藍(lán)色，經(jīng)DiI染色的納米粒呈紅色。融合圖像見靶向組納米粒在黑色素瘤細(xì)胞膜上大量富集環(huán)繞，細(xì)胞株周圍可見納米粒圈網(wǎng)狀團(tuán)聚圍繞；而非靶向組未見納米粒在黑色素瘤細(xì)胞的富集。見圖3。

三、體外光聲成像結(jié)果

光聲儀顯示濃度為 1.570 mg/ml、3.125 mg/ml、6.250 mg/ml、12.500 mg/ml、25.000 mg/ml的納米粒光聲值分別為 0.254、0.267、0.497、0.833、1.226。隨著納米粒濃度的增加，其光聲信號呈逐漸增強(qiáng)趨勢，且不同濃度納米粒信號強(qiáng)度比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。

討 論

圖3 激光共聚焦顯微鏡檢測體外尋靶情況

圖4 不同濃度納米粒的光聲成像二維圖像

光聲成像技術(shù)的基本原理是光敏物質(zhì)吸收的光能量轉(zhuǎn)換為熱能，致組織發(fā)生熱膨脹效應(yīng)，從而激發(fā)組織產(chǎn)生超聲頻譜信號［1］，其成像分辨率高即源于激光激發(fā)和超聲探測的雙重聚焦［8］。近紅外光譜為非可見光，適用于人體及動物研究，對特定部位或組織顯像，如腫瘤組織可以采用光聲成像對比劑結(jié)合近紅外光譜進(jìn)行顯影。金納米棒擁有隨長寬比變化連續(xù)可調(diào)的表面等離子體共振波長，生物相容性好，且具有低毒性，能連接生物分子用于靶向研究［9］，具有強(qiáng)烈的光學(xué)消光特性及良好的光熱轉(zhuǎn)換效率，且穩(wěn)定性好，不易發(fā)生淬滅，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［10］。

本實驗中研制的包裹金納米棒及液態(tài)氟碳PLGA靶向納米粒粒徑均一，分散度可。免疫熒光檢測顯示抗MAGE抗體和納米粒連接率高。體外尋靶實驗顯示靶向納米粒在黑色素瘤細(xì)胞株有明顯富集環(huán)繞；而非靶向組納米粒均勻分布于細(xì)胞株之間無團(tuán)聚，結(jié)果證實靶向納米粒對惡性黑色素瘤細(xì)胞有較好的生物活性，可為后續(xù)腫瘤的靶向治療提供有利條件。光聲成像實驗結(jié)果顯示，隨著不同濃度組金納米棒含量的增加，光聲信號呈逐漸增強(qiáng)趨勢，證實該納米?？勺鳛檫m用于近紅外光譜范圍內(nèi)良好的光聲成像對比劑。研究［11-12］結(jié)果提示，相變型納米粒可利用聲致相變及光致相變作用殺傷腫瘤細(xì)胞。故筆者在本研究后續(xù)實驗中，將對納米粒的光致相變聯(lián)合光熱治療抑制腫瘤細(xì)胞生長行進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實驗成功制備抗MAGE抗體偶聯(lián)金納米棒納米分子探針，其對體外惡性黑色素瘤細(xì)胞具有較好的生物活性，細(xì)胞靶向性較好，且體外光聲有明顯增強(qiáng)信號，可作為光聲成像造影劑，進(jìn)一步行腫瘤靶向光熱治療。

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MAGE-targeted gold nanoparticlesfor enhancing photoacoustic and ultrasound imaging on melanoma

LIXuelin，RANHaitao，LIPan，HAOLan，CAOYang，AOMeng，ZHANGNan，SONGJiao，ZHANGLiang，YIHengjing，WANGZhigang
Department of Geriatrics，Chongqing General Hospital，Chongqing400014，China

Objective To investigate the ability of targeting in vitro melanoma of nanoparticle probe loaded with gold nanorod and its consequence of photoacoustic imaging in vitro.Methods The polymeric multifunctional nanoparticles probe loaded with gold nanorod and liquid perfluorocarbon，and connected with MAGE-antibody targeting melanoma was prepared by double emulsion method and carbodiimide method.General physical property，the condition of MAGE-antibody connected with nanoparticles and the ability of targeting of the probe were tested.The different concentration of nanoparticles was imaged by photoacoustic.Results The targeting polymeric multifunctional nanoparticles probes loaded with gold nanorod were prepared successfully with average particle diameter of（336.40±27.46）nm and Zeta potential of （-4.34±4.90）mV.MAGE-antibody was successfully connected with the nano probes.There were massive targeting nano probes surrounded the melanoma cell strains B16 in the targeting group in vitro.The photoacoustic signal of the nano probes was enhanced with the increase of gold nanorod concentration in photoacoustic experiment in vitro.Conclusion The prepared polymeric multifunctional nanoparticles probe loaded with gold nanorod and connected with MAGE-antibody targeting melanoma can be used as a photoacoustic contrast agent，which can inhibit the proliferation of melanoma by targeting photothermal therapy．

Photoacoustic imaging；Gold nanorod；Targeted nanoprobe；Melanoma

R-331；R445.1

A

國家自然科學(xué)基金重點項目（31630026、81630047）；國家自然科學(xué)基金青年基金項目（81501482）

400014 重慶市人民醫(yī)院老年科（李雪霖）；重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所（冉海濤、李攀、郝蘭、曹陽、敖夢、張楠、宋嬌、張亮、易衡靜、王志剛）

王志剛，Email：wzg62942443@163.com

2017-09-07）