謝昆　麗仙　王靖　朱靈明　尹建華　葉青霞　孫艷

摘要：抗菌肽是構(gòu)成昆蟲體液免疫的主要方式，BmMoricin是家蠶免疫系統(tǒng)中1種重要的抗菌肽，具有極強的抑菌活性。以家蠶中腸組織總RNA為模板，設(shè)計1對特異性引物，通過RT-PCR技術(shù)擴增BmMoricin，構(gòu)建pET32a-BmMoricin原核表達(dá)載體，采用自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)BmMoricin重組蛋白。結(jié)果表明，BmMoricin基因片段的大小為201 bp，編碼66個氨基酸，自誘導(dǎo)表達(dá)的BmMoricin重組蛋白大小約為19 ku，表達(dá)產(chǎn)率比異丙基-β-D-疏基半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率高，為BmMoricin抗菌肽的生物學(xué)活性鑒定及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：家蠶；抗菌肽；BmMoricin；重組蛋白；自誘導(dǎo)

中圖分類號： Q785；S8812+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0052-03[

收稿日期：2016-06-30

基金項目：云南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（編號：DCXM163018）；紅河學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項目（編號：SZ1520）；紅河學(xué)院應(yīng)用型科學(xué)研究項目（編號：XJY15Z07）；紅河學(xué)院博士專項（編號：XJ15B13）。

作者簡介：謝昆（1975—），男，云南昆明人，博士，副教授，主要從事動物生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：xk_biology2@126com。

在昆蟲細(xì)胞中，天然免疫是主要的免疫屏障，抗菌肽在阻止微生物入侵和預(yù)防感染方面具有重要的作用，抗菌肽具有分子量低、熱穩(wěn)定性強、抗菌性廣譜、抑菌活性強等優(yōu)點[1]，絕大部分的抗菌肽由復(fù)雜的基因家族編碼，因此大量的抗菌肽是宿主抵抗微生物感染的主要方式[2-3]。在細(xì)胞內(nèi)抗菌肽的誘導(dǎo)表達(dá)受Toll和IMD信號途徑的調(diào)控[4]，然而，抗菌肽的生物學(xué)功能也各有差異，抗菌肽Cecropins和Moricin具有極強的抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌活性，但抗真菌活性較弱，而Drosomycin具有極強的抗真菌活性，不同的抗菌肽家族成員之間抗菌機理也不同[5-6]。在家蠶細(xì)胞中，家蠶抗菌肽BmMoricin最先是從家蠶血淋巴中分離得到，主要對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有抑菌活性，BmMoricin包含61個氨基酸殘基，前22個形成預(yù)測的分泌肽，成熟的BmMoricin含39個氨基酸，通過其氨基端α-螺旋插入到細(xì)菌質(zhì)膜，增加細(xì)菌的滲透壓來抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，在BmMoricin[CM（215]家族的12個基因成員中，含8個B亞家族（BmMoricin B1～B8）、3個A亞家族（BmMoricin LA1～LA3）、1個BmMoricin基因，它們在家蠶抵抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌方面具有極其重要的作用[7]。自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是Studier于2005年發(fā)現(xiàn)的，該系統(tǒng)中含有一定比例的葡萄糖和乳糖，葡萄糖耗盡后乳糖才被利用，目的蛋白開始表達(dá)[8]。自誘導(dǎo)表達(dá)的最終菌體密度大，蛋白產(chǎn)量高，而且沒有毒性，適于重組蛋白的高效表達(dá)[9]。本研究以5齡7 d家蠶中腸組織為材料，設(shè)計特異性引物，通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)擴增BmMoricin基因，構(gòu)建pET32a-BmMoricin原核表達(dá)載體，采用自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)BmMoricin重組蛋白，以期為BmMoricin抗菌肽的抑菌活性研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

11試驗材料

家蠶（青松×皓月），由云南省蒙自市家蠶養(yǎng)殖戶提供。質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒，均購自愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司；RNAiso Plus，購自寶生物工程（大連）有限公司；T4 DNA鏈接酶、限制性核酸內(nèi)切酶，均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；DL2000 DNA marker、RT-PCR試劑盒、高分子量預(yù)染蛋白marker，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。LB培養(yǎng)基：稱取100 g胰蛋白胨、50 g 酵母抽提物、100 g氯化鈉，加入950 mL蒸餾水中，攪拌直至完全溶解，用10 molL的NaOH調(diào)節(jié)pH值為74，以蒸餾水定容至1 000 mL，105 kPa高壓滅菌20 min；ZYM-5052培養(yǎng)基：精確稱取7098 g Na2HPO4、6804 5 g KH2PO4、11090 5 g NH4Cl、0710 2 g Na2SO4、0240 72 g MgSO4、0222 g CaCl2、0198 g MnCl2、0288 g ZnSO4、0047 g NiCl2、0048 4 g NaMoO4、0012 g H3BO3、5 mL甘油、06 g葡萄糖、2 g 乳糖，加入950 mL蒸餾水中，攪拌直至完全溶解，以蒸餾水定容至1 000 mL，105 kPa高壓滅菌20 min。

12試驗方法

121引物設(shè)計

根據(jù)GenBank上公布的BmMoricin（AB0069151）mRNA序列，應(yīng)用Primer Primer 50引物設(shè)計軟件設(shè)計1對特異性引物為F：5′-CATG[ZZ（Z]CCATGG[ZZ）]CAAAAAT [JP2]ACCTATCAAGGCCATTAAGACTGTAGGAAAGGCAGTCGGTA-3′，R：5′-CCG[ZZ（Z]CTCGAG[ZZ）]TCAATGCTTTCTTTTCTTCGGTTTCA AGAAATTGAAAACATC-3′，下劃線部分為限制性內(nèi)切酶識別位點，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

122總RNA提取及RT-PCR擴增

取5齡7 d家蠶的中腸組織，應(yīng)用RNAiso Plus提取其總RNA，提取方法參考《分子克隆實驗指南》[10]。應(yīng)用寶生物工程（大連）有限公司的PrimeScriptTM One Step RT-PCR試劑盒，RT-PCR擴增出BmMoricin抗菌肽基因，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。endprint

123表達(dá)載體的連接、轉(zhuǎn)化及鑒定

DNA凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物，用NcoⅠ、XhoⅠ雙酶切BmMoricin基因和pET32a載體，構(gòu)建pET32a-BmMoricin原核表達(dá)載體，質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化、酶切鑒定、PCR鑒定等操作方法均參考《分子克隆實驗指南》[10]。

124重組蛋白的異丙基-β-D-巰基半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)

構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，加入終濃度為01 mmolL的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，分別收集誘導(dǎo)0～6 h的菌液，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測重組蛋白的表達(dá)情況。

125重組蛋白的自誘導(dǎo)表達(dá)

按照Studier的方法進行自誘導(dǎo)表達(dá)研究[8]。挑取含有重組質(zhì)粒的單菌落，接種到4 mL含有100 μgmL氨芐青霉素（Amp）的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 、220 rmin培養(yǎng)過夜，再按1%的接種量接種到10 mL含有100 μgmL Amp的ZYM-5052培養(yǎng)基中，37 ℃、220 rmin培養(yǎng)12、14、16、18、20、22 h后收集菌液，與IPTG誘導(dǎo)的菌液進行SDS-PAGE檢測分析，比較兩者重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的差異。

2結(jié)果與分析

21家蠶抗菌肽基因的RT-PCR擴增

以5齡7 d時期家蠶的中腸組織總RNA為模板，通過 RT-PCR技術(shù)擴增家蠶抗菌肽基因BmMoricin。由圖1可知，目的基因片段的大小約為201 bp，可以編碼66個氨基酸，與預(yù)期結(jié)果一致。

[FK（W15][TPXK1tif]

22表達(dá)載體的構(gòu)建

構(gòu)建pET32a-BmMoricin原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒，PCR和NcoⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定結(jié)果如圖2、圖3所示。從圖2可以看出，經(jīng)PCR鑒定重組質(zhì)粒的大小與圖1中RT-PCR的結(jié)果一致；從圖3的重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果可以看出，大片段為pET32a載體片段，小片段為酶切后的BmMoricin小片段。

23抗菌肽重組蛋白的自誘導(dǎo)表達(dá)

抗菌肽分別經(jīng)1 mmolL IPTG誘導(dǎo)0、1、2、3、4、5、6 h和自誘導(dǎo)表達(dá)12、14、16、18、20、22 h后，由圖4可知，IPTG和自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)皆能成功表達(dá)BmMoricin重組蛋白（箭頭所指），表達(dá)的重組蛋白大小為19 ku，自誘導(dǎo)系統(tǒng)組表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)率明顯高于IPTG誘導(dǎo)組。

3討論

昆蟲是一類進化上較為低等的動物，同時也是世界上種類和數(shù)量最多的動物。面對大量的外源微生物的侵害，雖然沒有類似于哺乳動物的特異性免疫系統(tǒng)， 但是仍然能夠較好地生存，說明昆蟲必定有對非特異因子產(chǎn)生免疫應(yīng)答的高效先天免疫系統(tǒng)，昆蟲的免疫系統(tǒng)由體液免疫和細(xì)胞免疫組成[11]。昆蟲的體液免疫與高等動物有明顯的差異，主要依賴血液中的抗菌肽和蛋白質(zhì)。當(dāng)昆蟲機體受到病原微生物侵染時，體內(nèi)的識別蛋白能夠識別微生物表面的肽聚糖或脂多糖及其他物質(zhì)，引發(fā)絲氨酸蛋白酶和解除絲氨酸蛋白酶抑制劑的細(xì)胞外級聯(lián)反應(yīng)，激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終在其脂肪體、血液、中腸和表皮等器官或組織中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽，進而殺滅外源微生物[12]。2006年Cheng等通過對家蠶基因組框架圖序列的搜尋，找到了35條抗菌肽基因序列[2]。Moricin是由Hara等首先從家蠶血淋巴中分離得到的，對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均有強烈的抗菌活性，家蠶抗菌肽moricin（BmMoricin）由61個氨基酸殘基組成，在其N-末端部分每隔3～4個氨基酸殘基就有帶電荷氨基酸，只形成1個長的具有親水脂性質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)，在C-末端則存在堿性氨基酸殘基串，沒有發(fā)現(xiàn)BmMoricin有氨基酸的修飾，其抗菌機制可能是利用堿性C端與細(xì)胞膜表面作用，然后利用N端改變膜的通透性，形成離子通道[13]。BmMoricin的等電點高達(dá)120，對細(xì)菌的抗性明顯高于BmCecropin家族各成員[13]。

本研究通過RT-PCR技術(shù)從5齡7 d家蠶中腸組織中克隆BmMoricin抗菌肽基因，構(gòu)建pET32a-BmMoricin重組表達(dá)載體，采用自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中對重組蛋白進行自誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，自誘導(dǎo)系統(tǒng)組的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率明顯高于IPTG誘導(dǎo)組。試驗結(jié)果為家蠶抗菌肽的純化、活性鑒定奠定了基礎(chǔ)。

[HS223][HT85H]參考文獻(xiàn)：

[1][ZK（#]Sackton T B，Lazzaro B P，Schlenke T A，et al Dynamic evolution of the innate immune system in Drosophila[J] Nature Genetics，2007，39（12）：1461-1468

[2]Cheng T C，Zhao P，Liu C，et al Structures，regulatory regions，and inductive expression patterns of antimicrobial peptide genes in the silkworm Bombyx mori[J] Genomics，2006，87（3）：356-365

[3]Tanaka H，Ishibashi J，F(xiàn)ujita K，et al A genome-wide analysis of genes and gene families involved in innate immunity of Bombyx mori[J] Insect Biochemistry and Molecular Biology，2008，38（12）：1087-1110

[4]Lemaitre B，Hoffmann J The host defense of Drosophila melanogaster[J] Annual Review of Immunology，2007，25（1）：697-743endprint

[5]Samakovlis C，Kimbrell D A，Kylsten P，et al The immune response in Drosophila：pattern of cecropin expression and biological activity[J] EMBO Journal，1990，9（9）：2969-2976

[6]Ekengren S，Hultmark D Drosophila cecropin as an antifungal agent[J] Insect Biochemistry and Molecular Biology，1999，29（11）：965-972

[7]Hemmi H，Ishibashi J，Hara S，et al Solution structure of moricin，an antibacterial peptide，isolated from the silkworm Bombyx mori[J] Febs Letters，2002，518（123）：33-38

[8]Studier F W Protein production by auto-induction in high density shaking cultures[J] Protein Expression and Purification，2005，41（1）：207-234

[9]馮杉 T7表達(dá)系統(tǒng)及自誘導(dǎo)蛋白產(chǎn)出策略[J] 北京教育學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2009，4（3）：10-15

[10][ZK（#]薩姆布魯克 J，拉塞爾 D W 分子克隆實驗指南[M] 黃培堂，譯 3版 北京：科學(xué)出版社，2002

[11]Lemaitre B，Hoffmann J The host defense of Drosophila melanogaster[J] Annual Review of Immunology，2007，25（1）：697-743

[12]Kimbrell D A，Beutler B The evolution and genetics of innate immunity[J] Nature Reviews Genetics，2001，2（4）：256-267

[13]Hara S，Yamakawa M Moricin，a novel type of antibacterial peptide isolated from the silkworm，Bombyx mori[J] Journal of Biological Chemistry，1995，270（50）：29923-29927endprint