郭敏　李祥龍

摘要：利用生物信息學(xué)方法對13個物種TYR基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，以及一級、二級、三級結(jié)構(gòu)和亞細胞定位進行預(yù)測和分析，同時擬構(gòu)建13個物種TYR基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：TYR基因編碼產(chǎn)物為不穩(wěn)定蛋白（貉子除外），整條多肽鏈表現(xiàn)出親水性。二級結(jié)構(gòu)主要為α螺旋、β折疊，β轉(zhuǎn)角區(qū)域分布少且散，均存在信號肽和跨膜區(qū)，可以判斷TYR基因編碼蛋白是定位于生物膜上的膜蛋白或分泌蛋白，主要在嘌呤和嘧啶、運輸和結(jié)合、電壓門控離子通道及轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用。各物種TYR基因編碼產(chǎn)物主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體以及細胞質(zhì)膜。除原雞外，其他物種該蛋白均存在跨膜區(qū)，貉子有2個跨膜區(qū)域。各物種系統(tǒng)發(fā)育樹與動物學(xué)進化觀點基本一致。

關(guān)鍵詞：物種；酪氨酸酶基因；毛色；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；生物信息學(xué)

中圖分類號： Q754文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0044-05[

[HJ14mm]

收稿日期：2016-06-01

基金項目：河北省高校創(chuàng)新團隊領(lǐng)軍人才培育計劃（編號：LJRC004）；河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃重點基礎(chǔ)研究項目（編號：15962901D）；河北省自然科學(xué)基金重點項目（編號：C2016407114）。

作者簡介：郭敏（1991—），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，碩士研究生，研究方向為功能基因組學(xué)。E-mail：1908384796@qqcom。

通信作者：李祥龍，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為動物遺傳育種。E-mail：lixianglongcn@yahoocom。

動物的毛色、羽色不但可以作為質(zhì)量性狀，也可作為一種經(jīng)濟性狀被利用。目前，綠色、環(huán)保、優(yōu)質(zhì)的毛皮產(chǎn)品已成為廣大消費者追求的目標。毛色表型主要受黑色素的影響，是黑色素在毛皮質(zhì)和髓質(zhì)中沉淀的種類和數(shù)量不同造成的。研究表明，動物毛色的形成主要與黑色素細胞中合成的2種色素（真黑色素、褐黑色素）比例有關(guān)。真黑色素通常可使皮膚或毛皮表現(xiàn)為褐色、黑色，褐黑色素能使皮膚或毛皮表現(xiàn)為黃色、紅棕色[1]，黑色素沉淀取決于這2種色素的相對含量。對于動物黑色素細胞而言，酪氨酸酶（tyrosinase，簡稱TYR）作為關(guān)鍵酶參與黑色素的合成[2]，具有加氧酶、脫氫酶雙重功能[3]，動物黑色素的形成主要遵循多巴（DOPA）途徑，指在動物體內(nèi)，酪氨酸在TYR的催化作用下，經(jīng)由DOPA、多巴醌、吲哚醌等形式，最后生成黑色素。酪氨酸酶相關(guān)蛋白酶1（TYRP1）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白酶2（TYRP2）與酪氨酸酶（TYR）構(gòu)成了酪氨酸酶基因家族，TYRP1、TYRP2各自催化特異的反應(yīng)參與黑色素的合成，這3種成員協(xié)同調(diào)控黑色素的形成[4]，并且與其他毛色相關(guān)基因共同作用調(diào)控毛色的形成。引起黑色素代謝紊亂的主要原因是TYR基因突變或酶的失活，最終將導(dǎo)致機體組織異常表達[5]。有研究表明，哺乳動物TYR基因包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，序列長度約為16 kb[6]。本研究選用GenBank中已提交物種的TYR基因編碼蛋白序列，利用生物信息學(xué)方法對TYR基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能進行預(yù)測和分析，以期研究TYR基因及其編碼蛋白的功能，進而為該基因調(diào)控的動物毛色機制研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

11序列來源

[JP2]從美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站（http：wwwncbinlmnihgov）的GenBank中下載包括斑馬魚、犬、東北虎、家兔、[JP3]家貓、綿羊、貉子、家牛、人、狨猴、原雞、中央蝙蝠、家豬等13個物種的TYR基因編碼蛋白序列[7]。序列來源見表1。

12蛋白結(jié)構(gòu)分析

121一級結(jié)構(gòu)利用Expasy開發(fā)的針對蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)的Protparam工具（http：wwwexpasyorgtoolsprotparamhtml）分析TYR基因編碼蛋白序列的相對分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點（pI）、消光系數(shù)、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)、總平均親水性等。同時通過 Expasy開發(fā)的Protscale工具對TYR基因編碼的蛋白質(zhì)進行親水性、疏水性分析。利用TMHMM Server v20在線軟件（http：wwwcbsdtudkservicesTMHMM-20）預(yù)測跨膜區(qū)[8-9]。

122二級結(jié)構(gòu)利用Chou & Fasman Secondary Structure Prediction Server軟件預(yù)測TYR基因所編碼蛋白質(zhì)的α螺旋、β折疊和β轉(zhuǎn)角。同時，分別使用Protfun 22 Server[10-11]、Signal P 41 Server[12]在線軟件分析預(yù)測TYR基因編碼產(chǎn)物的功能分類和信號肽。

123亞細胞定位利用PSORT Ⅱ Prediction在線軟件（http：psorthgcjpform2html）對TYR基因編碼蛋白在細胞內(nèi)的位置進行定位與分析[13]。

13構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

應(yīng)用DNAMAN軟件對不同物種TYR基因編碼蛋白序列進行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。

2結(jié)果與分析

21不同物種TYR基因編碼蛋白的一級結(jié)構(gòu)

211蛋白質(zhì)理化性質(zhì)由表2可知，13個物種TYR基因編碼蛋白的氨基酸組成相同，且亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）含量明顯高于其他氨基酸。表3為13個物種TYR基因編碼蛋白的理化參數(shù)，包括氨基酸數(shù)量、相對分子質(zhì)量、pI值、分子式、原子總數(shù)、正電荷殘基數(shù)負電荷殘基數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪系數(shù)和親水性總平均值等?？梢钥闯?，脂肪系數(shù)均高達70以上，其中貉子的脂肪系數(shù)最高，達到8139；親水性總平均值表現(xiàn)為負值，說明這13個物種TYR基因編碼的蛋白均為親水蛋白；除貉子（不穩(wěn)定指數(shù)<40，穩(wěn)定）外，其他物種TYR基因編碼的蛋白均為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。endprint

212跨膜區(qū)分析通過軟件分析可知：貉子TYR基因編碼產(chǎn)物有2個跨膜區(qū)域，原雞TYR基因編碼產(chǎn)物無跨膜區(qū)域，第1～499 aa位于胞外。對13個物種進行跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果顯示，除原雞外，其他物種該蛋白均存在跨膜區(qū)（表4），揭示該蛋白是定位于生物膜的跨膜蛋白。

22不同物種TYR基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)

221α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角的預(yù)測經(jīng)過軟件分析可知：在各物種TYR基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋、β-折疊區(qū)域分布較廣，而β-轉(zhuǎn)角區(qū)域分布少且較分散（表5）。

222信號肽的預(yù)測通過分析蛋白序列有無信號肽，可以判斷此蛋白是否為分泌蛋白[15]。表6的預(yù)測結(jié)果顯示，原始剪切位點分值（raw cleavage site score，簡稱C值）的最大值與被結(jié)合的剪切位點的分值（combined cleavage site score，簡稱Y值）的最大值均趨向于+1，信號肽分值（signal peptide score，簡稱S值）的最大值在切割位點前高，在切割位點后低，符合信號肽的標準，可以判斷TYR基因編碼產(chǎn)物中存在信號肽。

223親水性與疏水性的預(yù)測親水性氨基酸一般位于蛋白分子表面，而疏水性氨基酸位于蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部[16]。氨基酸的親水、疏水性可以用來判斷蛋白質(zhì)折疊的大致趨勢。對13個物種TYR氨基酸序列的親水、疏水性進行預(yù)測，正值

表疏水，負值表親水；正值越大表示疏水性越強，負值越小表示親水性越強，表7結(jié)果顯示，13個物種整條多肽鏈均表現(xiàn)親水性，因此認為，TYR基因編碼產(chǎn)物為親水蛋白，且位于蛋白質(zhì)分子表面。

23不同物種TYR基因編碼蛋白的亞細胞定位

如表9所示，各物種TYR基因編碼產(chǎn)物主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體以及細胞質(zhì)膜，其中人的該基因編碼產(chǎn)物有小部分定位于細胞外（111%），而原雞的該基因編碼產(chǎn)物主要定位于細胞外，比例高達667%，小部分定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及液泡中，且比例均為111%。

24不同物種TYR基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)

對不同物種TYR基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行同源建模，結(jié)果表明，各物種蛋白結(jié)構(gòu)豐富多樣，存在大量折疊、螺旋扭曲，這些特點對物種的生物學(xué)功能具有重大意義。

25系統(tǒng)發(fā)育樹

3結(jié)論

不同物種TYR基因編碼蛋白脂肪系數(shù)均高達70以上，其中貉子最高，達到8139。除貉子外，其他物種TYR基因編碼蛋白均為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，整條多肽鏈表現(xiàn)親水性。除原雞外，其他物種該蛋白均存在跨膜區(qū)，貉子有2個跨膜區(qū)域，揭示該蛋白是定位于生物膜的跨膜蛋白。

TYR基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為α螺旋、β折疊，β轉(zhuǎn)角區(qū)域分布少且散，均存在信號肽、跨膜區(qū)，主要在嘌呤和嘧啶、運輸和結(jié)合、電壓門控離子通道及轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用。各物種TYR基因編碼產(chǎn)物主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體以及細胞質(zhì)膜，人有小部分定位于細胞外（111%），而原雞主要定位于細胞外（667%），小部分定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及液泡中（111%）。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果符合動物學(xué)進化觀點。

[FK（W14][TPGM1tif]

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