李海龍,宋耀輝，陳兆峰,王晶,2,田一虹,2，王圓圓,2，陳徹,牛媛瑕

(1.甘肅中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院臨檢基礎(chǔ)教研室,蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點實驗室，甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實驗室,蘭州 730000；3.蘭州大學第一醫(yī)院消化科,蘭州 730000；4.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科,蘭州 730000)

·腫瘤與微環(huán)境檢測·

miR-20a-5p/miR-20b-5p在胃癌細胞和組織中的表達及調(diào)控靶基因信號通路富集分析*

李海龍1a,2,宋耀輝1，陳兆峰3,王晶1,2,田一虹1,2，王圓圓1,2，陳徹1,牛媛瑕4

(1.甘肅中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院臨檢基礎(chǔ)教研室,蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點實驗室，甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實驗室,蘭州 730000；3.蘭州大學第一醫(yī)院消化科,蘭州 730000；4.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科,蘭州 730000)

目的觀察miR-20a-5p/miR-20b-5p在胃癌細胞和胃癌組織中的表達，并用生物信息學方法分析其靶基因和富集的信號通路，探討其生物學行為和功能。方法采用實時熒光定量PCR法檢測miR-20a-5p/miR-20b-5p在不同分化程度(高、中、低)的胃癌細胞和正常胃黏膜細胞以及其在胃癌組織和癌旁組織中的表達水平，并分析其臨床意義，采用mirWALK網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫的預測軟件預測其靶基因，選擇該網(wǎng)站10個軟件中具備3個以上軟件支持的靶基因，用DAVID 6.7在線富集其靶基因參與的信號通路。結(jié)果miR-20a-5p/miR-20b-5p在不同分化程度(高、中、低)的胃癌細胞中表達上調(diào)(P均<0.05)，胃癌組織相對于癌旁組織亦明顯上調(diào)表達(P<0.05)，miR-20b-5p表達上調(diào)與胃癌淋巴結(jié)侵襲轉(zhuǎn)移以及浸潤深度關(guān)系密切(P均<0.05)；生物信息學分析提示，miR-20a-5p/miR-20b-5p的靶基因富集存在于腫瘤相關(guān)的多個信號通路中。結(jié)論miR-20a-5p/miR-20b-5p在胃癌細胞系及組織中呈高表達，并于與淋巴結(jié)侵襲轉(zhuǎn)移以及浸潤深度有關(guān)，可作為胃癌潛在的生物學標志物。

miR-20a-5p；miR-20b-5p；胃癌

研究證實，microRNAs(miRNAs)與胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、對化療藥物耐藥、臨床病理參數(shù)等關(guān)系十分密切[1-2]。miRNA發(fā)揮著類似于抑癌基因和癌基因的功能, 在腫瘤發(fā)生過程中起至關(guān)重要的作用，已經(jīng)成為特異性的胃癌分子標志物之一。我國學者研究證實，miR-20a和miR-20b在胃癌組織中的表達均高于癌旁組織[3-4]，一項針對我國和日本胃癌患者差異表達miRNA的薈萃(meta)分析指出[5]，miR-20a和miR-20b在胃癌組織中的表達均高于癌旁組織，其中,miR-20b的高表達胃癌患者預后較差，而miR-20a的高表達與胃癌患者預后之間并無關(guān)聯(lián)[5]。由于不同研究中樣本來源的差異，所報道的關(guān)于miR-20a和miR-20b表達的臨床病理參數(shù)等結(jié)論并不完全一致，甚至對于其在不同分化程度的胃癌細胞中的表達以及調(diào)控靶點尚缺乏系統(tǒng)性的研究。因此，本研究旨在檢測miR-20a，miR-20b在胃癌細胞和胃癌組織中的表達水平，并進行臨床病理參數(shù)分析和生物信息學分析，以期為胃癌的分子標志物和靶向治療研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系 胃癌細胞系A(chǔ)GS(高分化)、SGC-7901(中分化)、MKN-45(中分化)、MKN-28(中分化)、BCG-823(低分化)均購自北京協(xié)和腫瘤研究所細胞庫，MGC-803(低分化)和HGC-27(低分化)購自中科院上海細胞庫，正常胃黏膜上皮細胞系GES-1購自上海和元生物公司。

1.1.2研究對象 收集2009年10月至2010年4月甘肅省武威腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療的45例胃癌患者，男26例,女19例,年齡35～76歲,中位年齡56歲。診斷依據(jù)：以術(shù)前胃鏡活檢取材并經(jīng)病理組織學診斷確診[6]。TNM分期以國際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)TNM病理分期(第6版)為標準。胃癌患者納入標準：(1)經(jīng)病理組織學活檢確診為胃癌；(2)術(shù)前未行放化療或全身治療；(3)無嚴重其他系統(tǒng)疾患。排除標準：(1)胃良性疾病，如胃潰瘍、胃腺瘤或腺瘤性息肉、胃巨大皺襞癥等;(2)胃部其他惡性腫瘤，如胃惡性淋巴瘤、胃間質(zhì)瘤、胃神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等;(3)有原位癌肝轉(zhuǎn)移者。同時收集胃癌患者臨床病理參數(shù)，包括性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和TNM分期等。收集各患者的胃癌及其癌旁組織(距離癌灶5 cm以上，且經(jīng)HE染色證實均無癌細胞)，立即放入液氮中保存，后置-80 ℃保存。樣本采集經(jīng)醫(yī)院倫理學委員會批準，患者均知情同意。

1.1.3試劑和儀器 NanoVue 超微量分光光度計(美國Ge healthcare公司)；CFX96 實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，高糖DMED培養(yǎng)基(健順生物公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit，廣州復能基因公司)。

1.2實驗方法

1.2.1胃癌細胞系培養(yǎng) 取生長狀態(tài)良好的胃癌細胞系A(chǔ)GS、SGC-7901、MKN-45、MKN-28、MGC-803、BCG-823、 HGC-27 和正常胃黏膜上皮細胞系GES-1(細胞密度為1×106/mL)，加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下常規(guī)培養(yǎng)。每隔2～3 d換完全培養(yǎng)基，待細胞密度達90%時按1∶2比例傳代。取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測 內(nèi)參照U6特異引物(序列編號：HmiRQP9001)、miR-20a特異引物(序列編號：HmiRQP0312)、miR-20b特異引物(序列編號：HmiRQP0314)和通用引物(Uni-miR qPCR Primer)均由廣州基因復能公司設計并合成。用Trizol試劑提取各細胞系總RNA，取吸光度(A260/280 nm)為1.8～2.2的樣本用于后續(xù)實驗，并置-80 ℃保存。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 樣本置-20 ℃保存。PCR總體系為20 μL，包括SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10 μL，特異引物PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.8 μL，通用引物(10 μmol/L)0.8 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL。PCR循環(huán)參數(shù)： 95 ℃預變性10 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，共40個循環(huán)，以PCR儀自帶軟件包 BioRad.PCR.CFX Manager Analysis Tool(版本號：6.541.1028)于60 ℃時采集熒光信號，并進行熔解曲線分析。以U6作為內(nèi)參基因，相對表達量計算采用2-ΔΔCt法，實驗重復3次。

1.2.3miRNA靶基因預測和靶基因富集信號通路分析 使用mirwalk2.0網(wǎng)站(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/index.html)的集成的生物信息學軟件對miR-20a-5p/miR-20b-5p的靶基因進行預測分析，在該網(wǎng)站，預測所用的軟件包含DIANAmT、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICTAR4、PICTAR5、PITA、RNA22和Targetscan，選擇該網(wǎng)站10個軟件中有3個以上軟件支持的靶基因作為候選靶基因進行信號通路分析，對所檢索到上述的靶基因用DAVID 6.7軟件(https://david.ncifcrf.gov/)進行KEGG Pathway信號通路富集分析，富集聚類分析采用Fisher檢驗，檢驗水準為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1不同分化程度胃癌細胞中的miR-20a-5p/miR-20b-5p的表達 相對于正常胃黏膜上皮細胞，除了miR-20a-5p在AGS、MGC-803細胞中的表達，miR-20b-5p在MKN-28細胞中的表達無統(tǒng)計學意義外， miR-20a-5p/miR-20b-5p在不同分化程度的AGS、SGC-7901、MKN-45、MKN-28、MGC-803、BCG-823和HGC-27胃癌細胞系中的表達水平均上調(diào)。見表1。

表1 miR-20a-5p/miR-20b-5p在胃癌細胞中的表達

注：以GES-1細胞為對照，a,P<0.05;b,P<0.01。

2.2胃癌組織和癌旁組織中的miR-20a-5p/miR-20b-5p的表達 相對于癌旁組織，miR-20a-5p在胃癌組織中有29例表達上調(diào)[3.23(1.83,8.89)]， 16例表達下調(diào)[0.26(0.12,0.56)]，差異有統(tǒng)計學意義(Z= 5.501,P=0.000)；miR-20b-5p在胃癌組織中有31例表達上調(diào)[3.23(1.93,5.35)]，14例表達下調(diào)[0.24(0.17,0.34)]，差異有統(tǒng)計學意義(Z=5.320,P=0.000) 。進一步進行臨床病理參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)， miR-20b-5p在胃癌組織中表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵犯深度有關(guān)(P<0.05)。而與年齡、性別、癌細胞分化程度、血管轉(zhuǎn)移、Borrmann分型、侵犯深度無關(guān); miR-20a-5p在胃癌組織中的表達與各臨床病理參數(shù)均無關(guān)。見表2。

表2 miR-20a-5p/miR-20b-5p在胃癌組織中的表達(2-ΔΔCt)

續(xù)表

2.3miR-20a-5p/miR-20b-5p的靶基因預測和生物信息學分析 生物信息學結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-20a與miR-20b的預測靶基因富集在88和93個信號通路中，其中與腫瘤有密切關(guān)系的分別有38個，涉及多種腫瘤，凋亡、細胞周期、增殖、代謝、侵襲轉(zhuǎn)移以及多個關(guān)鍵的信號通路。見表3、4。

表3 miR-20a-5p預測靶基因富集信號通路分析

表4 miR-20b-5p預測靶基因富集信號通路分析

3 討論

人類miR-20a(ACCESSION：NG_032702.1，mirbase：MI0000076)和miR-20b(ACCESSION：NG_032702.1，mirbase：MI0001519)均屬于miR-17家族。研究表明，該基因家族與多種腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成等生物學功能關(guān)系密切[7-9]。其中， miR-20a與miR-20b在胃癌組織中高表達，然而其在胃癌中的表達及其臨床病理參數(shù)的報道并不完全一致[3-5]。本實驗發(fā)現(xiàn)，miR-20a與miR-20b在不同分化程度胃癌細胞系中的表達量明顯高于GES-1細胞；并揭示了其在不同分化程度胃癌細胞中的表達水平亦存在差異。通過對臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，miR-20a與miR-20b在胃癌組織中的表達量明顯高于胃癌旁組織；與多項研究報道的結(jié)果較為一致[3-5]。臨床病理參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，miR-20b在胃癌組織中高表達，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及浸潤深度具有臨床相關(guān)性，而與年齡、性別、腫瘤TNM分期、癌細胞分化程度、血管轉(zhuǎn)移、Borrmann分型無關(guān)，miR-20a與上述臨床病理參數(shù)均無關(guān)。Wang等[10]報道指出，miR-20a在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本組資料研究結(jié)果與其并不完全一致。Guo等[5]通過meta分析發(fā)現(xiàn)，miR-20b與臨床病理參數(shù)或預后有關(guān)，而miR-20a則無關(guān)，與本研結(jié)果較為一致。miR-20a-5p和miR-20b-5p由miR-20a與miR-20b剪切形成， miR-20a-5p序列(5′→3′)為：UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG，mir-20b-5p序列(5′→3′)為：CAAAGUGCUCAUAGUGCA

GGUAG, 兩種剪切后的miRNA序列相差2個堿基，因此，在本組資料中，miR-20a-5p與miR-20b-5p臨床病理參數(shù)存在差異的原因可能是成熟miR-20a與miR-20b剪切形成的不同變體調(diào)控了不同的生物學行為所致。

本組資料來自甘肅省胃癌高發(fā)地區(qū)，樣本有一定的代表性。miRNA調(diào)控下游靶基因往往通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄后翻譯或造成mRNA降解實現(xiàn)。上調(diào)miR-20a可以促進胃癌細胞生長，其功能可借靶向調(diào)控UBE2C、EGR2和FBXO31基因的表達來實現(xiàn)[11-13]。然而，更多的靶基因仍需預測并通過實驗驗證，以充分闡明miR-20a與miR-20b的功能。因此，為分析miR-20a與miR-20b的功能，本研究借助于公認的miRNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫mirwalk2.0和信號通路富集分析數(shù)據(jù)庫DAVID 6.7進行生物信息學預測和分析。結(jié)果顯示，miR-20a與miR-20b的預測靶基因富集在88和93個信號通路中，其中與腫瘤有密切關(guān)系的分別有38個，涉及多種腫瘤、凋亡、細胞周期、增殖、代謝、侵襲轉(zhuǎn)移以及多個關(guān)鍵的信號通路。miR-20a與miR-20b的預測靶基因及其數(shù)量是不同的，其富集的信號通路既有重復又有不同，這一結(jié)果可佐證并解釋本研究中miR-20a-5p和miR-20b-5p臨床病理參數(shù)的不同之處。因此，從預測靶基因的功能和富集信號通路分析看，miR-20a與miR-20b與腫瘤多種生物學行為密切相關(guān)。

另有報道顯示，胃癌患者血清中miR-20a的表達量明顯高于對照組，其表達與胃癌分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，低分化組血清miR-20a表達水平明顯高于中分化組和高分化組[14-15]。國芳等[15]報道指出，早期胃癌患者血清中miR-1和miR-20a的表達明顯升高，AUCROC分別為0.813 8和0.774 2，兩者聯(lián)合的AUCROC為0.865 3,敏感性和特異性分別為80.5%和83.6%，miR-20a在Ⅱ～Ⅳ期患者血清中的表達水平明顯高于Ⅰ期，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。提示miR-20a可能成為對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移進行預測的分子標志物。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-20a與miR-20b是在胃癌細胞和組織中高表達的癌基因，臨床病理參數(shù)分析顯示miR-20b高表達與胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。生物信息學分析提示，miR-20a與miR-20b是胃癌發(fā)病和進展中某些生物學行為和功能標志物，具備深入研究的潛在價值。然而，本研究檢測的臨床樣本僅僅代表本地區(qū)的胃癌樣本，仍需更多的不同地區(qū)、不同人種的臨床樣本，以掌握miR-20a與miR-20b的完整臨床病理參數(shù)，為胃癌診斷提供充分的依據(jù)。

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2017-07-25)

(本文編輯：許曉蒙)

ExpressionsofmiR-20a-5p/miR-20b-5pingastriccancercellsandgastriccarcinomatissuesandenrichinganalysisoftheirtargetgenesandsignalpathways

LIHai-long1,2,SONGYao-hui1,CHENZhao-feng3,WANGJing1,2,TIANYi-hong1,2,WANGYuan-yuan1,2,CHENChe1,NIUYuan-xia4

(1.BasicTeachingandResearchDepartmentofClinicalLaboratory,SchoolofClinicalMedicine,GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,Gansu; 2.KeyLaboratoryofTraditionalChineseHerbsandPrescriptionInnovationandTransformationofGansuProvince,GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,Gansu; 3.DepartmentofGastroenterologyandHepatology,FirstHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,Gansu; 4.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofGansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,Gansu,China)

ObjectiveTo investigate the expressions of miR-20a-5p/miR-20b-5p in gastric cancer cells and gastric carcinoma tissues, analyze their target genes and enriching signal pathways using bioinformatics methods, and explore their biological behavior and function.MethodsThe expression levels of miR-20a-5p/miR-20b-5p in gastric cancer cells with different differentiation such as high, middle or low differentiation, normal gastric mucosa cells, gastric cancer tissues and adjacent tissues were detected by real-time fluorescent quantitative PCR, and their clinical significance was analyzed. The target genes of miR-20a-5p/miR-20b-5p were predicted using 10 softwares affiliated to mirWALK web database, and the genes supported by more than three softwares were selected as target genes. The signal pathways of target genes were enriched by online DAVID 6.7 software.ResultsThe expression levels of miR-20a-5p/miR-20b-5p in gastric cancer cells with different differentiation were significantly higher than that in normal gastric mucosa cells (allP<0.05), and that in gastric cancer tissues higher than adjacent tissues (P<0.05). The up-regulated expression of miR-20b-5p was closely related to lymph node metastasis and invasion depth (allP<0.05). Bioinformatics analysis showed that the enriched target genes of miR-20a-5p/miR-20b-5p existed in multiple signaling pathways associated with cancer.ConclusionMiR-20a-5p/miR-20b-5p may be a promising biomarker of gastric cancer, which is highly expressed in gastric cancer and is related to lymph node metastasis and invasion depth.

miR-20a-5p; miR-20b-5p; gastric cancer

10.13602/j.cnki.jcls.2017.11.06

甘肅省高等學?？蒲许椖?甘財教[2014]63-15)。

李海龍，1975年生，男，副教授，博士研究生，從事腫瘤分子機制和中藥抗腫瘤研究。

牛媛瑕，E-mail：niuyuanxia@126.com。

R735.2；R730.231

A