莢麗麗，魏嵐，趙健，賈玉迪，邱雨，杜超穎，孫立新#（.沈陽藥科大學藥學院，遼寧本溪7004；.沈陽藥科大學無涯學院，沈陽 006）

了哥王藥材中7種成分的含量測定及其主成分、聚類分析Δ

莢麗麗1＊，魏嵐1，趙健1，賈玉迪2，邱雨2，杜超穎1，孫立新1#（1.沈陽藥科大學藥學院，遼寧本溪117004；2.沈陽藥科大學無涯學院，沈陽 110016）

目的：建立同時測定了哥王藥材中7種成分含量的方法，同時對其進行主成分分析及聚類分析。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Diamonsil Platisil ODS，流動相為乙腈-0.15%三乙胺溶液（磷酸調(diào)pH至6.0）（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為40℃，進樣量為10 μL。采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對含量測定結(jié)果進行主成分分析與聚類分析。結(jié)果：柚皮苷、楊梅素、牛蒡苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素和西瑞香素檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為2.688～53.76 μg/mL（r＝0.999 8）、5.052～101.00 μg/mL（r＝0.999 9）、2.052～41.04 μg/mL（r＝0.999 9）、2.108～42.16 μg/mL（r＝0.999 9）、5.112～102.20 μg/mL（r＝0.999 9）、0.820～16.42 μg/mL（r＝0.999 9）、2.070～41.40 μg/mL（r＝0.999 9）；定量限≤1.072 0 μg/mL，檢測限≤0.331 8 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為97.8%～102.5%（RSD＝1.8%，n＝6）、97.2%～102.0%（RSD＝2.0%，n＝6）、95.2%～100.1%（RSD＝1.7%，n＝6）、95.2%～99.3%（RSD＝1.6%，n＝6）、97.0%～100.8%（RSD＝1.3%，n＝6）、95.5%～98.6%（RSD＝1.1%，n＝6）、95.0%～99.3%（RSD＝1.8%，n＝6）。10批藥材樣品有3個主成分。10個產(chǎn)地的藥材樣品可聚為2類；廣東清遠和貴州貴陽產(chǎn)地的藥材樣品質(zhì)量較好。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復性好，可用于了哥王藥材中7種成分含量的同時測定；不同產(chǎn)地的了哥王藥材質(zhì)量差異較大。

了哥王；高效液相色譜法；含量測定；主成分分析；聚類分析

了哥王為瑞香科蕘花屬植物南嶺蕘花Wikstroemia indica（L.）C.A.Mey.的干燥根或根皮，其性寒、味苦、微辛、有毒，入肝、肺經(jīng)，具有清熱解毒、化痰散結(jié)、消腫利水等作用[1]。了哥王藥材廣泛分布于我國長江以南地區(qū)，盛產(chǎn)于廣東、廣西、福建等地，為民間常用中草藥[2]，其化學成分主要為黃酮類、香豆素類、木脂素類、蒽醌類等?，F(xiàn)代藥理研究表明，了哥王藥材具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗腫瘤、抗病毒等作用[3-4]。目前關(guān)于了哥王藥材高效液相色譜法（HPLC）的定量報道大多側(cè)重單一或某一類成分的測定，難以全面控制其質(zhì)量。如熊友香等[5]測定了不同產(chǎn)地藥材中西瑞香素的含量；孫立新等[6]同時測定了藥材中羅漢松脂酚和牛蒡子苷元的含量；孫麗霞等[7]同時測定了藥材中楊梅素等4種黃酮類成分的含量；盧雪飛等[8]同時測定了藥材中西瑞香素等4種香豆素類成分的含量。但目前尚未見HPLC法同時測定了哥王藥材中不同類別多種成分含量的報道，且該藥材產(chǎn)地較廣，不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量可能存在差異，進而影響其藥效。因此，筆者建立HPLC法同時測定不同產(chǎn)地了哥王藥材中柚皮苷、楊梅素、牛蒡苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素和西瑞香素7種活性成分的含量，并通過SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對其進行主成分分析及系統(tǒng)聚類分析，對不同產(chǎn)地了哥王藥材質(zhì)量進行綜合評價，為合理評價該藥材質(zhì)量及指導臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

L-2130型HPLC儀，包括L-2400紫外檢測器、D-2000 Elite色譜工作站（日本Hitachi公司）；JF1004型電子分析天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）；TG332A型微量電子分析天平（湘儀天平儀器設備有限公司）；PB-10型pH計（德國Sartorius公司）；RE2000A型旋轉(zhuǎn)揮發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-500E型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

柚皮苷對照品（寶雞市辰光生物科技有限公司，批號：20150119，純度：≥98%）；楊梅素對照品（批號：130924，純度：＞99%）、牛蒡苷對照品（批號：130120，純度：＞98%）均購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；木犀草素對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-12100401，純度：≥98%）；槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100081-200903，純度：≥98%）；芹菜素對照品、西瑞香素對照品（沈陽藥科大學藥學院實驗室自制，經(jīng)核磁共振檢測確定結(jié)構(gòu)，HPLC測定純度均＞99%）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

試驗收集不同來源的了哥王藥材10批（見表1），經(jīng)沈陽藥科大學中藥學院路金才教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

表1 了哥王藥材來源Tab 1 Resource of W.indica

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil Platisil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.15%三乙胺溶液（磷酸調(diào)pH至 6.0）（B），梯度洗脫（0～4 min，8%→10%A；4～17 min，10%→14%A；17～23 min，14%→17%A；23～35 min，17%→18%A；35～45 min，18%→19.5%A；45～60 min，19.5%→20%A；60～80 min，20%A；80～96 min，20%→22%A；96～100 min，22%→23%A；100～125 min，23%→31%A；125～135 min，31%→35%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取待測成分對照品各適量，精密稱定，加75%甲醇溶液超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理20 min，濾過，取續(xù)濾液，即得單一對照品貯備液。精密量取上述單一對照品貯備液適量，加75%甲醇溶液制成柚皮苷、楊梅素、牛蒡苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、西瑞香素質(zhì)量濃度分別為134.4、252.6、102.6、105.4、255.6、41.04、103.5 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品粉碎，過40目篩，取約0.5 g，精密稱定，加水15 mL，加熱回流2次，每次2 h，濾過，取續(xù)濾液，合并2次濾液，于80℃下旋轉(zhuǎn)蒸干，殘渣置于5 mL量瓶中，加75%甲醇溶液溶解并定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，理論板數(shù)以柚皮苷、楊梅素、牛蒡苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、西瑞香素峰計均＞3 000；分離度＞1.5，各成分基線分離良好。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.2、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加75%甲醇溶液定容，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以柚皮苷、楊梅素、牛蒡苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、西瑞香素質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸。回歸方程與線性范圍見表2。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

表2 回歸方程、線性范圍與定量限、檢測限Tab 2 Regression equations，linear ranges and limits of quantify，limits of detection

2.5 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，當信噪比為10∶1時，得定量限；當信噪比為3∶1時，得檢測限，詳見表2。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，柚皮苷、楊梅素、牛蒡苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、西瑞香素峰面積的RSD分別為1.2%、1.2%、1.0%、1.1%、0.9%、1.5%、1.4%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（No.S2），適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，柚皮苷、楊梅素、牛蒡苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、西瑞香素峰面積的RSD分別為1.8%、1.5%、1.7%、1.0%、1.6%、1.8%、1.6%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

精密稱取樣品（No.S2）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果，柚皮苷、楊梅素、牛蒡苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、西瑞香素含量平均值分別為162.6、220.6、305.8、408.2、964.2、115.1、318.5 μg/g，RSD分別為1.5%、1.7%、1.1%、1.4%、1.2%、1.4%、1.5%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量樣品（No.S2）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

續(xù)表3Continued tab 3

2.10 藥材樣品含量測定

取10批藥材樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 藥材樣品含量測定結(jié)果（±s，n＝3，μg/g）Tab 4 Results of content determination of samples（±s，n＝3，μg/g）

表4 藥材樣品含量測定結(jié)果（±s，n＝3，μg/g）Tab 4 Results of content determination of samples（±s，n＝3，μg/g）

No.S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10柚皮苷467.5±6.428 162.6±2.378 277.0±3.037 314.9±3.928 186.5±2.122 435.9±3.601 339.6±4.694 278.5±4.350 147.5±2.706 114.8±2.077楊梅素706.2±7.959 220.6±3.857 343.3±5.164 449.2±5.311 178.4±3.105 331.3±5.764 306.2±3.467 761.1±10.85 212.5±4.122 356.3±3.816牛蒡苷161.4±2.610 305.8±3.499 120.4±1.680 68.68±0.686 179.0±2.150 114.0±1.058 145.8±1.779 148.6±1.442 186.9±3.027 140.1±2.230木犀草素299.5±5.701 408.2±5.623 107.9±2.193 258.3±2.691 227.0±2.558 217.2±2.606 270.0±2.120 225.7±3.301 162.5±3.053 283.3±3.055槲皮素940.7±10.900 964.2±11.620 726.1±10.700 661.8±8.099 991.5±9.403 699.2±11.690 971.7±11.650 928.2±8.924 831.3±12.580 862.2±12.140芹菜素126.3±1.550 115.1±1.650 80.44±1.338 115.4±2.311 95.35±1.616 92.31±1.294 74.57±1.307 76.56±1.275 85.20±1.640 95.42±1.404西瑞香素351.0±4.493 318.5±4.881 370.4±5.690 260.4±4.204 344.3±4.382 210.6±2.593 324.9±3.478 380.5±5.012 337.2±5.084 285.9±5.262

2.11 主成分分析

通過SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對10批藥材樣品的含量測定結(jié)果進行主成分分析[9-10]。結(jié)果，特征值＞1的主成分有3個，且累積方差貢獻率為84.074%，基本可以客觀反映藥材樣本信息。藥材樣品主成分分析結(jié)果見表5。由表5可見，牛蒡苷、槲皮素和西瑞香素對主成分1貢獻較大，木犀草素和芹菜素對主成分2貢獻較大，柚皮苷和楊梅素對主成分3貢獻較大。根據(jù)各主成分得分，以各主成分相應的方差貢獻率占累積方差貢獻率的百分比為權(quán)重，對3個主成分進行線性組合，可反映原樣本信息的綜合主成分得分[11]，用F值表示（即：F＝0.351×F1+0.341×F2+0.308×F3），F(xiàn)值越大說明了哥王藥材中各待測成分綜合含量越高，了哥王藥材質(zhì)量越好。綜合主成分評價結(jié)果見表6。由表6可知，S1、S8藥材樣品的質(zhì)量較好。

2.12 系統(tǒng)聚類分析

為評價不同產(chǎn)地的了哥王藥材的質(zhì)量差異，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對藥材樣品進行系統(tǒng)聚類分析，選用組間聯(lián)結(jié)法，采用歐式距離作為藥材樣品的測度，結(jié)果10個產(chǎn)地的了哥王藥材可分為2類，第一類：S1和S8；第二類：S2、S3、S4、S5、S6、S7、S9和S10。聚類分析樹狀圖見圖2。

表5 藥材樣品主成分分析結(jié)果Tab 5 Results of principal component analysis of medicinal materials samples

表6 綜合主成分評價結(jié)果Tab 6 Results of comprehensive principal component evaluation

圖2 聚類分析樹狀圖Fig 2 Cluster analysis tree diagram

3 討論

3.1 色譜條件的確定

筆者選擇有機相時考察了甲醇和乙腈，結(jié)果顯示，乙腈的洗脫效果和分離效果較好；選擇水相時考察了磷酸、甲酸、三氟乙酸、磷酸鹽、醋酸鹽、三乙胺等，結(jié)果顯示，加入三乙胺后，可明顯增加色譜峰的分離度并改善峰形。預試驗進行了三乙胺的加入量（0.1%、0.15%、0.2%）與pH（2.5～7）優(yōu)選，結(jié)果顯示，三乙胺的加入量為0.15%（pH 6.0）時，色譜峰分離度較大，峰形較好。

3.2 提取方法的優(yōu)化

本試驗對供試品的提取方式進行了優(yōu)化，結(jié)果，在加熱回流法下供試品的提取率為20.17%，超聲提取法下供試品提取率為11.46%，可見加熱回流法較超聲提取法的提取效率更高，提取更加完全。本試驗繼而考察了提取時間（1、2、3 h）、提取次數(shù)（1、2、3次）和料液比（1∶10、1∶20、1∶30），結(jié)果顯示，在料液比為1∶30，提取2次，2 h/次時供試品提取率較高，待測成分的響應值較大。筆者選擇復溶溶劑時分別考察了水和體積分數(shù)分別為25%、50%、75%和100%的甲醇，結(jié)果顯示采用75%的甲醇溶液復溶藥材樣品時，待測成分色譜峰的響應值較大。

3.3 不同產(chǎn)地了哥王藥材中7種成分含量的差異

主成分分析是使用較廣泛的多指標線性降維變換的多元統(tǒng)計分析方法。它是將原來具有一定相關(guān)關(guān)系的較多指標重新組合成一組新的相互無關(guān)的綜合指標來概括原指標信息，從而以最少的主成分數(shù)盡可能多地反映原來指標信息的方法。由研究結(jié)果可知，不同產(chǎn)地藥材樣品中7種化學成分的含量具有較大差異，其中槲皮素的含量相對于其他6種成分的含量在10個產(chǎn)地中較高；芹菜素的含量較低，與文獻[7]報道的了哥王藥材中芹菜素質(zhì)量分數(shù)明顯高于木犀草素、楊梅素的結(jié)果不同，原因可能為二者的提取方式與提取溶劑不同，供試品提取率也不同；而西瑞香素在各個產(chǎn)地中的含量較穩(wěn)定，與文獻[12]報道的不同產(chǎn)地了哥王藥材中西瑞香素的含量差異較小相一致。

本研究通過系統(tǒng)聚類分析將10個產(chǎn)地的藥材樣品分為2類，S1和S8被聚為一類，結(jié)合主成分分析，在綜合主成分得分排序中分別為第1、2位，且有效成分含量較高，表明廣東清遠、貴州貴陽產(chǎn)地的藥材樣品質(zhì)量較好；其余藥材樣品被聚為另一類，在綜合主成分得分排序中為第3～10位，這與主成分分析結(jié)果一致，表明該類藥材質(zhì)量稍差，二者相互驗證，共同評價不同產(chǎn)地了哥王藥材的質(zhì)量。造成以上藥材質(zhì)量不同的原因可能與藥材生長的氣候條件、土壤質(zhì)量、采收時間、儲存條件等因素有關(guān)。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復性好，可用于了哥王藥材中7種成分含量的同時測定；不同產(chǎn)地的了哥王藥材質(zhì)量差異較大。

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Content Determination of 7 Constituents in Wikstroemia indica and Its Principal Component and Cluster Analysis

JIA Lili1，WEI Lan1，ZHAO Jian1，JIA Yudi2，QIU Yu2，DU Chaoying1，SUN Lixin1（1.School of Pharmacy，Shenyang Pharmaceutical University，Liaoning Benxi 117004，China；2.Wuya College，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of 7 constituents in Wikstroemia indica，and to conduct principal component analysis and cluster analysis.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Diamonsil Platisil ODS column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.15%triethylamine solution（pH adjusted to 6.0 with phosphoric acid，gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 280 nm，and column temperature was 40 ℃.The sample size was 10 μL.The principal component analysis and cluster analysis were conducted for the results of content determination by SPSS 22.0 statistical software.RESULTS：The linear ranges were 2.688-53.76 μg/mL for naringin（r＝0.999 8），5.052-101.00 μg/mL for myricetin（r＝0.999 9），2.052-41.04 μg/mL for arctiin（r＝0.999 9），2.108-42.16 μg/mL（r＝0.999 9），5.112-102.20 μg/mL（r＝0.999 9），0.820-16.42 μg/mL（r＝0.999 9），2.070-41.40 μg/mL（r＝0.999 9），respectively.The limits of quantitation were no higher than 1.072 0 μg/mL，the limits of detection were no higher than 0.331 8 μg/mL.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoveries were 97.8%-102.5%（RSD＝1.8%，n＝6），97.2%-102.0%（RSD＝2.0%，n＝6），95.2%-100.1%（RSD＝1.7%，n＝6），95.2%-99.3%（RSD＝1.6%，n＝6），97.0%-100.8%（RSD＝1.3%，n＝6），95.5%-98.6%（RSD＝1.1%，n＝6），95.0%-99.3%（RSD＝1.8%，n＝6），respectively.Three main components were belong to the samples of 10 batches of medicinal materials.The samples of medicinal materials from 10 producing area could be divided into 2 categories.The quality of W.indica from Qingyuan Guangdong and Guiyang Guizhou were better than others.CONCLUSIONS：The method is simple，precise，stable and reproducible，and it can be used for simultaneous determination of 7 constituents in medicinal material.The quality of W.indica from different regions are quite different.

Wikstroemia indica；HPLC；Content determination；Principal component analysis；Cluster analysis

R917

A

1001-0408（2017）33-4706-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.27

遼寧省教育廳“遼寧特聘教授”項目（No.遼教發(fā)〔2014〕187號）

＊碩士研究生。研究方向：藥物分析。電話：024-43520599。E-mail：827227389@qq.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：藥物分析。電話：024-43520600。E-mail：sunlixin67@yahoo.com

（編輯：張 靜）

2017-03-12

2017-06-25）