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        HPLC法同時(shí)測定婦樂顆粒中4種成分的含量

        2017-12-13 09:49:19羅曉霞曾偲偲祁龍凱廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部廣州500廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院廣州50006
        中國藥房 2017年33期

        羅曉霞,曾偲偲,祁龍凱(.廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部,廣州500;.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,廣州50006)

        HPLC法同時(shí)測定婦樂顆粒中4種成分的含量

        羅曉霞1*,曾偲偲1,祁龍凱2(1.廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部,廣州510120;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,廣州510006)

        目的:建立同時(shí)測定婦樂顆粒中沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、丹皮酚含量的方法。方法:采用高效液相色譜法。色譜柱為月旭XB-C18,流動(dòng)相為甲醇-0.05%磷酸溶液(梯度洗脫),流速為1.0 mL/min,檢測波長為270 nm(沒食子酸、丹皮酚)、325 nm(綠原酸)、230 nm(芍藥苷),柱溫為30℃,進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果:沒食子酸、綠原酸、芍藥苷和丹皮酚檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.076 2~1.524 μg(r=0.999 7)、0.037 6~0.751 μg(r=0.999 9)、0.030 3~0.606 μg(r=0.999 7)、0.020 6~0.412 μg(r=0.999 8);定量限分別為0.353、0.276、0.421、0.540 μg/mL,檢測限分別為0.121、0.104、0.148、0.186 μg/mL;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD≤2.04%;加樣回收率分別為95.24%~100.47%(RSD=1.59%,n=9)、99.49%~103.70%(RSD=2.27%,n=9)、96.27%~101.09%(RSD=1.94%,n=9)、95.05%~98.90%(RSD=1.22%,n=9)。結(jié)論:該方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性良好,可用于婦樂顆粒中沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、丹皮酚含量的同時(shí)測定。

        婦樂顆粒;高效液相色譜法;沒食子酸;綠原酸;芍藥苷;丹皮酚;含量

        婦樂顆粒是由忍冬藤、大血藤、牡丹皮、赤芍、川楝子、熟大黃等中藥制成的復(fù)方制劑,具有清熱涼血、化瘀止痛的功效;常用于瘀熱蘊(yùn)結(jié)所致的帶下病,癥見帶下量多、色黃,小腹疼痛,慢性盆腔炎見上述證候者,為婦科常用藥[1]。目前婦樂顆粒收載于2015年版《中國藥典》(一部)[1]及部頒標(biāo)準(zhǔn)《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》(第18冊(cè))[2];前者僅要求測定大黃中大黃素和大黃酚的含量,后者也只要求測定牡丹皮中丹皮酚的含量,兩者均缺乏對(duì)忍冬藤主要活性成分綠原酸[3],大血藤主要活性成分沒食子酸、綠原酸等[4-5],赤芍、牡丹皮主要活性成分沒食子酸、芍藥苷、丹皮酚等的測定[6-9]。因此,筆者采用高效液相色譜法(HPLC)建立了測定婦樂顆粒中沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、丹皮酚含量的方法,以期為完善該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

        1 材料

        1.1 儀器

        E2695型HPLC儀,包括2998二級(jí)管陣列檢測器(美國Waters公司);BP211D型電子分析天平(德國Sartorius公司);KQ-200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Milli-Q型超純水機(jī)(德國Merck公司)。

        1.2 藥品與試劑

        婦樂顆粒(湖北襄陽隆中藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號(hào):151018、160404、160820、160918,規(guī)格:6 g/袋);沒食子酸對(duì)照品(批號(hào):110831-201630)、綠原酸對(duì)照品(批號(hào):110753-201716)、芍藥苷對(duì)照品(批號(hào):110736-201640)、丹皮酚對(duì)照品(批號(hào):110708-201407)均購自中國食品藥品檢定研究院,純度均≥98.0%;甲醇和磷酸均為色譜純,其余試劑均為分析純,水為純化水。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        色譜柱:月旭XB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇(A)-0.05%磷酸溶液(B),梯度洗脫(0~8 min,5%→11%A;8~18 min,11%→13%A;18~19 min,13%→15%A;19~27 min,15%→18%A;27~28 min,18%→53%A;28~38 min,53%→60%A);流速:1.0 mL/min;檢測波長:270 nm(沒食子酸、丹皮酚)、325 nm(綠原酸)、230 nm(芍藥苷);柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。

        2.2 溶液的制備

        2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取沒食子酸、綠原酸、芍藥苷和丹皮酚對(duì)照品各適量,精密稱定,置于同一100 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容,制成每1 mL含沒食子酸152.4 μg、綠原酸75.1 μg、芍藥苷60.6 μg、丹皮酚 41.2 μg的混合對(duì)照品溶液。

        2.2.2 供試品溶液 取樣品1袋,置于研缽中,研成細(xì)粉,真空干燥過夜后,精密稱取樣品粉末1.0 g,至于50 mL具塞錐形瓶中,加入甲醇25 mL,超聲(功率:150 W,頻率:40 kHz,下同)處理20 min,放冷后用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

        2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的制備工藝和處方比例,制備分別缺大血藤、赤芍、牡丹皮,缺忍冬藤、大血藤,缺赤芍、牡丹皮的陰性樣品,再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液,即得。

        2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

        精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜,詳見圖1。由圖1可知,在該色譜條件下,各成分均能達(dá)到基線分離,分離度>1.5;理論板數(shù)以沒食子酸峰計(jì)為5 500,保留時(shí)間為6.948 min。結(jié)果表明,其他成分對(duì)測定無干擾。

        圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

        2.4 線性關(guān)系考察

        取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.5、5.0、10 μL,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積。以待測成分進(jìn)樣量(x,μg)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸?;貧w方程與線性范圍見表1。

        表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

        2.5 定量限(LOQ)與檢測限(LOD)考察

        取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量,倍比稀釋,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次,記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí),得LOQ;當(dāng)信噪比為3∶1時(shí),得LOD。結(jié)果,沒食子酸、綠原酸、芍藥苷和丹皮酚的LOQ分別為 0.353、0.276、0.421、0.540 μg/mL,LOD 分別為0.121、0.104、0.148、0.186 μg/mL。

        2.6 精密度試驗(yàn)

        取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積。結(jié)果,沒食子酸、綠原酸、芍藥苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為1.27%、0.85%、1.04%、0.98%(n=6),表明儀器精密度良好。

        2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液(批號(hào):151018)適量,分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積。結(jié)果,食子酸、綠原酸、芍藥苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為1.39%、1.02%、1.50%、1.85%(n=6),表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

        取樣品(批號(hào):151018)適量,共6份,每份約1.0 g,精密稱定,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果,沒食子酸、綠原酸、芍藥苷和丹皮酚的含量平均值分別為 3.41、1.03、0.64、0.36 mg/g,RSD 分別為1.68%、2.04%、1.81%、1.70%(n=6),表明本方法重復(fù)性良好。

        2.9 加樣回收率試驗(yàn)

        取樣品(批號(hào):151018)適量,共9份,每份約0.5 g,精密稱定,分別置于50 mL具塞錐形瓶中,各加入低、中、高質(zhì)量的待測成分對(duì)照品,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見表2。

        表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab 2 Result of recovery tests(n=9)

        2.10 樣品含量測定

        取4批樣品各適量,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積并計(jì)算樣品含量,結(jié)果見表3。

        表3 樣品含量測定結(jié)果(n=3,mg/g)Tab 3 Result of contents determination of samples(n=3,mg/g)

        3 討論

        3.1 流動(dòng)相的選擇

        筆者曾考察了甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸溶液和甲醇-0.05%磷酸溶液為本試驗(yàn)的流動(dòng)相體系對(duì)色譜分離的影響。結(jié)果,當(dāng)采用甲醇-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí),待測成分達(dá)到基線分離,峰形良好,且分析時(shí)間短,故選擇上述溶液為流動(dòng)相。

        3.2 檢測波長的選擇

        通過二極管陣列檢測器在210~400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描發(fā)現(xiàn),沒食子酸丹皮酚在270 nm波長處、綠原酸在325 nm波長處、芍藥苷在230 nm波長處分別具有最大吸收峰,故采用波長切換技術(shù)最終確定本試驗(yàn)的檢測波長為270 nm(0~10 min,沒食子酸)、325 nm(10~20 min,綠原酸)、230 nm(20~30 min,芍藥苷)、270 nm(30~43 min,丹皮酚)。

        3.3 提取溶劑的選擇

        筆者曾考察了水、50%甲醇溶液、75%甲醇溶液、甲醇作為提取溶劑進(jìn)行超聲提取時(shí)待測成分的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),50%甲醇溶液、75%甲醇溶液、甲醇溶液3種提取溶劑的提取效果無明顯差異,但50%甲醇和75%甲醇溶液較難過濾,故采用甲醇作為提取溶劑。

        綜上所述,本方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性良好,可用于婦樂顆粒中沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、丹皮酚含量的同時(shí)測定。

        [1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:一部[S].2015年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:896-897.

        [2]衛(wèi)生部.衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn):中藥成方制劑:第18冊(cè)[S].WS3-B-3403-98.

        [3]于曉,李松濤,劉建升,等.RP-HPLC法同時(shí)測定忍冬藤中綠原酸、馬錢苷、芍藥苷含量的研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,47(9):124-126、145.

        [4]劉曉涵,祁龍凱.UPLC法同時(shí)測定大血藤中4種成分的含量[J].中藥新藥與臨床藥理,2016,27(5):689-692.

        [5]馬瑞麗,于小鳳,徐秀泉,等.大血藤的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國野生植物資源,2012,31(6):1-5.

        [6]陸小華,馬驍,王建,等.赤芍的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥,2015,46(4):595-602.

        [7]鄧開英,朱必越,朱照靜.改良RP-HPLC法同時(shí)測定牡丹皮藥材中芍藥苷和丹皮酚的含量[J].中國藥房,2013,24(15):1406-1408.

        [8]范旭航,馬天成,沈旭,等.UPLC法測定不同產(chǎn)地不同部位牡丹皮中6種活性成分[J].中成藥,2012,34(2):317-320.

        [9]劉杰,陳琳,范彩榮,等.基于HPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS的白芍和赤芍主要成分定性定量研究[J].中國中藥雜志,2015,40(9):1762-1770.

        Simultaneous Determination of 4 Components in Fule Granules by HPLC

        LUO Xiaoxia1,ZENG Caicai1,QI Longkai2(1.Dept.of Pharmacy,Guangdong Provincial Hospital of TCM,Guangzhou 510120,China;2.College of TCM,Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510006,China)

        OBJECTIVE:To establish a method for simultaneous determination of gallic acid,chlorogenic acid,paeoniflorin and paeonol in Fule granules.METHODS:HPLC method was adopted.The determination was performed on Ultimate XB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05%phosphoric acid(gradient elution)at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelengths were 270 nm(gallic acid,paeonol),325 nm(chlorogenic acid)and 230 nm(paeoniflorin).The column temperature was 30 ℃,and sample size was 10 μL.RESULTS:The linear ranges of gallic acid,chlorogenic acid,paeoniflorin and paeonol were 0.076 2-1.524 μg(r=0.999 7),0.037 6-0.751 μg(r=0.999 9),0.030 3-0.606 μg(r=0.999 7),0.020 6-0.412 μg(r=0.999 8),respectively.The limits of quantification were 0.353,0.276,0.421,0.540 μg/mL,and the limits of detection were 0.121,0.104,0.148,0.186 μg/mL.RSDs of precision,stability and reproducibility tests were all no more than 2.04%.The recoveries were 95.24%-100.47%(RSD=1.59%,n=9),99.49%-103.70%(RSD=2.27%,n=9),96.27%-101.09%(RSD=1.94%,n=9),95.05%-98.89%(RSD=1.22%,n=9),respectively.CONCLUSIONS:The method is simple,accurate and reproducible,and can be used for the simultaneous determination of gallic acid,chlorogenic acid,paeoniflorin and paeonol in Fule granules.

        Fule granules;HPLC;Gallic acid;Chlorogenic acid;Paeoniflorin;Paeonol;Content

        R927.2

        A

        1001-0408(2017)33-4732-03

        DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.34

        *主管藥師。研究方向:醫(yī)院藥學(xué)。E-mail:Yuerluo@qq.com

        (編輯:劉 柳)

        2017-06-07

        2017-08-12)

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