支旭然，王覓，宋浩靜，董占軍（河北省人民醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊050051）

HPLC法同時(shí)測定舒肝寧注射液中5種成分的含量Δ

支旭然＊，王覓，宋浩靜，董占軍#（河北省人民醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊050051）

目的：建立同時(shí)測定舒肝寧注射液中5種成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Symmetry?C18，流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為238 nm（梔子苷、黃芩苷）、327 nm（綠原酸、野黃芩苷、黃芩素），柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.406 2～26.0 μg/mL（r＝0.999 9）、2.500 0～160.0 μg/mL（r＝0.999 9）、6.562 0～420.0 μg/mL（r＝0.999 9）、0.312 5～20.0 μg/mL（r＝0.999 6）、0.585 9～37.5 μg/mL（r＝0.999 8）；定量限≤31.20 ng，檢測限≤15.60 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為97.72%～101.10%（RSD＝1.21%，n＝ 6）、97.67%～102.40%（RSD＝1.87%，n＝6）、97.64%～101.10%（RSD＝1.31%，n＝6）、96.45%～100.10%（RSD＝1.47%，n＝6）、96.16%～101.10%（RSD＝1.69%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于舒肝寧注射液中5種成分含量的同時(shí)測定。

高效液相色譜法；舒肝寧注射液；綠原酸；梔子苷；黃芩苷；黃芩素；野黃芩苷；含量

舒肝寧注射液是一種用于治療急、慢性病毒性肝炎的純中藥復(fù)方注射制劑，具有清熱解毒、利濕退黃、益氣扶正和保肝護(hù)肝的功效[1-2]。舒肝寧注射液是依據(jù)《傷寒論》中茵陳蒿湯劑組方加減而成，經(jīng)臨床使用多年，療效顯著。作為全新的治療急慢性病毒性肝炎的純中藥制劑，舒肝寧注射液以其高效、安全的特點(diǎn)成為臨床保肝的較好選擇[3]，在保護(hù)肝臟正常結(jié)構(gòu)與功能方面有特效[4-5]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究證明，舒肝寧注射液含多種黃酮類成分，水溶性強(qiáng)，生物利用度好，但目前關(guān)于舒肝寧注射液成分研究的報(bào)道較少[6-7]，且相關(guān)報(bào)道也僅檢測了其中1～2種成分，顯然不利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）測定舒肝寧注射液中綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷的含量，以為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括2487雙通道紫外-可見檢測器（美國Waters公司）；BP211D型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；XW-80A型旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

舒肝寧注射液（貴州瑞和制藥有限公司，批號(hào)：20150912、20150711、20160919、20160311、20160910，規(guī)格：2 mL/支）；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：LYS2015041901）、黃芩素對(duì)照品（批號(hào)：HQS2015071302）、野黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：YHQG2015032301）均購自南京春秋生物工程有限公司；梔子苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-16020401）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-16031811）均購自成都曼思特生物科技有限公司，所有對(duì)照品純度均＞98%；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry?C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～23 min，25%→75%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：238 nm（梔子苷、黃芩苷）、327 nm（綠原酸、野黃芩苷、黃芩素）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱定待測成分對(duì)照品各適量，加甲醇制成綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷質(zhì)量濃度分別為1.3、1.6、1.2、1.0、1.5 mg/mL的單一對(duì)照品貯備溶液。分別量取上述單一對(duì)照品貯備溶液適量，加甲醇制成綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷質(zhì)量濃度分別為 26.0、160.0、420.0、20.0、37.5 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品200 μL，置于10 mL量瓶內(nèi)，加甲醇定容，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按舒肝寧注射液處方和工藝制備缺茵陳、梔子、黃芩苷、野黃芩苷、黃芩苷的陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成缺綠原酸、缺梔子苷、缺黃芩苷和缺野黃芩苷、黃芩素的陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，理論板數(shù)以綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷峰計(jì)均＞5 000；分離度＞1.5，各成分基線分離良好。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，采用倍比稀釋法，用甲醇逐級(jí)稀釋，制成系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。回歸方程與線性關(guān)系見表1。

2.5 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測限，詳見表1。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷峰面積的RSD分別為 1.80%、1.02%、0.59%、1.34%、0.85%（n＝6），表明儀器精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

表1 回歸方程、線性范圍與定量限、檢測限Tab 1 Regression equation，linear ranges and limits of quantify，limits of detection

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20150912）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷峰面積的RSD分別為0.89%、1.03%、1.89%、1.20%、1.25%（n＝7），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號(hào)：20150912）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷峰面積的RSD分別為0.78%、0.69%、1.54%、1.13%、1.18%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（批號(hào)：20150912）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取5批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，μg/g）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3，μg/g）

3 討論

查閱文獻(xiàn)[8-9]可知，綠原酸檢測波長為327 nm，梔子苷為238 nm，黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷可在275 nm檢測定量。通過預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芩苷和野黃芩苷在238 nm和327 nm均可被檢測，但黃芩苷在327 nm響應(yīng)太高，標(biāo)準(zhǔn)曲線受影響；黃芩素在238 nm響應(yīng)比較低，含量少時(shí)不易被檢測。因此，本研究選用雙波長238 nm（梔子苷、黃芩苷）和327 nm（綠原酸、黃芩素、野黃芩苷）檢測，在此條件下，所需檢測的各成分色譜峰分離度及峰形均佳，靈敏度較高。

舒肝寧注射液是由茵陳提取物、梔子提取物、黃芩苷、板藍(lán)根提取物、靈芝提取物組合而成的中藥注射液。茵陳藥材中主要成分為綠原酸[10]；梔子藥材中主要成分為梔子苷[11]；板藍(lán)根藥材中含有表依告春和腺苷[12]，預(yù)試驗(yàn)中表依告春沒有檢測到，腺苷同時(shí)也是靈芝的有效成分，不具有專一代表性[13]；本研究在測定黃芩苷的同時(shí)也檢測到了野黃芩苷和黃芩素，從樣品測定結(jié)果可以看出，野黃芩苷和黃芩素在不同批次中含量變化不大，猜測原料藥黃芩苷不純。因此，經(jīng)過篩選，確定本試驗(yàn)檢測綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷作為舒肝寧注射液質(zhì)量控制的主要研究成分。

本試驗(yàn)分別以甲醇-磷酸（0.05%、0.1%、0.4%）、甲醇-甲酸為流動(dòng)相進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，采用甲醇-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，待測成分的分離效果和峰形良好，干擾成分少，基線平穩(wěn)。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于舒肝寧注射液中5種成分含量的同時(shí)測定。

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[2]關(guān)妮.舒肝寧注射液臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2014，27（10）：1291-1295.

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[4]張斌，趙巍，王立蓉.舒肝寧注射液對(duì)慢性乙型病毒性肝炎高膽紅素血癥患者肝功能及膽紅素的影響[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，20（16）：71-73.

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Simultaneous Determination of 5 Components in Shuganning Injections by HPLC

ZHI Xuran，WANG Mi，SONG Haojing，DONG Zhanjun（Dept.of Pharmacy，Hebei Provincial People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China）

OBJECTIVE：To develop a method for the simultaneous determination of 5 components in Shuganning injections.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Symmetry?C18column with mobile phase consisted of methanol-0.4%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavlengths were set at 238 nm（geniposide，baicalin）and 327 nm（chlorogenic acid，baicalein，scutellarin）.The column temperature was 30 ℃ and the sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges were 0.406 2-26.0 μg/mL for chlorogenic acid（r＝0.999 9），2.500 0-160.0 μg/mL for geniposide（r＝0.999 9），6.562 0-420.0 μg/mL for baicalin（r＝0.999 9），0.312 5-20.0 μg/mL for baicalein（r＝0.999 6），0.585 9-37.5 μg/mL for scutellarin（r＝0.999 8）.The limits of quantify were no higher than 31.20 ng，limits of detection were no higher than 15.60 ng.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；the recoveries were 97.72%-101.10%（RSD＝1.21%，n＝6），97.67%-102.40%（RSD＝1.87%，n＝6），97.64%-101.10%（RSD＝1.31%，n＝6），96.45%-100.10%（RSD＝1.47%，n＝6），96.16%-101.10%（RSD＝1.69%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，precise，stable and reproducible，and can be used for simultaneous determination of 5 components in Shuganning injection.

HPLC；Shuganning injections；Chlorogenic acid；Geniposide；Baicalin；Baicalein；Scutellarin；Content

R917

A

1001-0408（2017）33-4702-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.26

政府資助省級(jí)臨床醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才項(xiàng)目

＊藥師，碩士。研究方向：藥物分析與藥動(dòng)學(xué)。E-mail：zhixuran@163.com

#通信作者：主任藥師，碩士生導(dǎo)師。研究方向：醫(yī)院藥事管理、中藥質(zhì)量控制。電話：0311-85988604。E-mail：hbghyxb123@163.com

（編輯：張 靜）

2017-02-28

2017-04-25）