于新海++李濛++周紅昕++才源

摘 要：通過實驗發(fā)現(xiàn)由吉林省生物研究所提供的耐寒月季其核型組成為K（2n）=2x=14m，通過閱讀文獻(xiàn)確定薔薇屬植物的染色體基數(shù)為7，即該材料為具有14條染色體的2倍體植株。目前普遍的現(xiàn)代栽培觀賞月季均為四倍體植株，無法與該耐寒月季進(jìn)行雜交育種。而該耐寒月季具有耐寒性直立性好、抗病性強(qiáng)、花期長、花型優(yōu)美等寶貴特點，所以通過生物技術(shù)手段進(jìn)行染色體倍數(shù)確定，為后續(xù)獲得四倍體植株和與現(xiàn)代四倍體觀賞月季雜交育種奠定理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

關(guān)鍵詞：耐寒月季；染色體；核型分析

中圖分類號：K915 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20171132013

月季花屬于薔薇屬（Rosa L.）植物，由于其花期長、花色豐富，品種多樣，深得人們的喜愛[1]。在很久之前就已成為世界著名的觀賞植物，同時在園林綠化方面也得到廣泛的應(yīng)用。但由于東北很多地區(qū)的氣候條件的特殊性，冬季寒冷干燥、春季經(jīng)常出現(xiàn)倒春寒等氣候，所以具有優(yōu)良的抗旱性、抗寒性同時兼具觀賞性的月季品種少之又少[2]。本實驗中的薔薇屬植物耐寒月季，由吉林省生物研究所提供，此品種月季耐寒性極好，具有與野生薔薇資源共同的有點：抗病性和直立性生長強(qiáng)，并且其花期可以從5月份延續(xù)到10月中旬左右，花色為粉色，多瓣，在冬季可完全裸露過冬，在第2年春季又可從地上部分繼續(xù)生長[3]。但品種過于單一，像這種花量大、花期長、耐寒性好、抗病性強(qiáng)的優(yōu)良月季，其花色只有粉色花一種。為了豐富這種優(yōu)良性狀月季的品種，特此做了雜交試驗的基礎(chǔ)研究：染色體倍數(shù)分析[5]。

由于月季花的須根木質(zhì)化程度高，根尖部分很難找到處于分生期的嫩芽，所以本次實驗采用的實驗材料為未形成花蕾的嫩莖部分[6]。

1 材料與方法

1.1 取材時間、地點

本次所取材料均為生長年齡長達(dá)5a以上的樹狀粉花耐寒月季的未形成花蕾的嫩莖[3]，分別與上午09：00、10：00、11：00點進(jìn)行取材[7]，取材地點為吉林省生物研究所實驗園區(qū)。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗儀器與藥品

8-羥基喹啉25g，無水乙醇分析純 500mL，冰醋酸 分析純500ml，鹽酸分析純 500ml，堿性品紅，石碳酸分析純500g，甲醛分析純 500ml，山梨醇 25g，奧林巴斯顯微鏡cx31，METTLER TOLEDO 電子天平，海爾4℃恒溫冰箱。

2mmol/L的8-羥基喹啉水溶液：準(zhǔn)確稱取0.29g8-羥基喹啉，用5ml5mol/L的鹽酸進(jìn)行溶解，然后在1L的容量瓶中用蒸餾水進(jìn)行定容。

卡諾固定液：量取無水乙醇750mL、冰乙酸250mL溶于一起。

卡寶品紅溶液：先分別配成3種原液，再配成染色液[8]。

A液：準(zhǔn)確稱取堿性品紅3g，溶解于100mL的70%乙醇溶液中。可放于4℃恒溫冰箱內(nèi)長期保存，以備以后使用。

B液：量取A液10mL，加入 90mL的5%苯酚水溶液中。B液在2周內(nèi)使用。

C液：量取B液55mL，分別加入6mL的乙酸和甲醛溶液。

染色液：量取C液25mL，加入到75mL，45%的乙酸溶液中。稱取1.8g山梨醇溶解于染色液中（此染色液可長期保存，以備后續(xù)使用）[9]。

1.2.2 實驗材料處理

1.2.2.1 取材

本次實驗是在7月份中選擇天氣晴朗的上午09：00、10：00和11：00不同時間段取樣。所取樣均為生長旺盛枝條未形成花蕾的莖尖部分，約0.5cm左右。將索取嫩莖去皮處理后切成薄片[10]。

1.2.2.2 預(yù)處理

將切好的嫩莖段用2mmol/L的8-羥基喹啉水溶液分別處理2～3h。

1.2.2.3 樣品固定

將經(jīng)過預(yù)處理后的嫩莖切片用蒸餾水水洗2～3次后放入卡諾固定液中進(jìn)行固定。固定條件為4℃，60min[11]。

1.2.2.4 樣品解離

本次實驗是通過酸解法進(jìn)行樣品解離，用5mol/L的鹽酸常溫解離10min，也可用1mol/L的鹽酸在60℃水浴鍋中解離10min，經(jīng)試驗對比效果一致[12]。

1.2.2.5 染色

將進(jìn)行解離后的嫩莖用蒸餾水反復(fù)沖洗3～5次后，放入卡寶品紅染色液中進(jìn)行染色2～3h。

1.2.2.6 制片

采用常規(guī)壓片法，用鑷子取經(jīng)過染色的嫩莖段至于載玻片上，用濾紙一段吸取多余的水分然后蓋上蓋玻片。在固定好蓋玻片后，用鑷子另一端輕輕敲打蓋玻片，使材料細(xì)胞分散均勻，以便于顯微鏡下觀看[13]。

1.2.2.7 觀察

將壓好的載玻片置于低倍鏡下進(jìn)行觀察，選擇好合適的區(qū)域后再轉(zhuǎn)入高倍鏡下進(jìn)行染色體計數(shù)。

2 實驗結(jié)果與分析

選擇10個分散良好且處于中期細(xì)胞的材料進(jìn)行觀察計數(shù)，確定上午10：00，11：00所取樣中均有處于分裂中期的細(xì)胞且本品種耐寒月季共有14條染色體。核型公式為 K（2n）=2x=14m，未發(fā)現(xiàn)有隨體。染色體形態(tài)見圖1。

由吉林省生物研究所提供的耐寒月季為2倍體植株，無法進(jìn)行與現(xiàn)代栽培的4倍體月季植株的雜交育種實驗。所以需要通過染色體加倍技術(shù)，獲得此品種的4倍體植株后再進(jìn)行雜交育種實驗，從而可以完成新品種的選育工作[14]。

3 總結(jié)

經(jīng)過染色體倍數(shù)分析得出該品種耐寒月季為2倍體，而現(xiàn)代月季多為4倍體，在后續(xù)實驗中可通過秋水仙素處理等方法使染色體加倍，得到4倍體植株。從而可以與花色豐富的現(xiàn)代月季進(jìn)行雜交實驗，并篩選出理想的耐寒、花色豐富、抗病性與直立性好的月季花[15]。本次實驗為克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和性和不可育性奠定基礎(chǔ)；染色體倍數(shù)及形態(tài)在一定條件下可以影響該物種的進(jìn)化過程，例如染色體加倍就是一個重要因素，這對于種群與種間雜交后代的鑒定以及親緣關(guān)系研究具有重要意義[16]。此外此種耐寒月季的種子萌發(fā)率極低，無法實現(xiàn)與觀賞性較好的4倍體優(yōu)良月季品種進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交。因此，如何克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性及不育性，培育出觀賞性好且抗性強(qiáng)的品種是當(dāng)前育種工作亟待解決的關(guān)鍵問題。endprint

參考文獻(xiàn)

[1]羅玉蘭，張冬梅，蔡潤.紅刺玫染色體的觀察和核型分析[J].山東林業(yè)科技，2007（3）.

[2]賀海洋，朱金啟，高琪潔，上田善弘，蕓學(xué)部，高俊平，胡建芳.單葉薔薇的花芽形態(tài)分化[J].園藝學(xué)報，2005（2）.

[3]胡鳳榮，王斐，鮑仁蕾，謝蔚然.風(fēng)信子根尖預(yù)處理及核型分析[J].西北植物學(xué)報，2012（10）.

[4]于雪，張銘芳，封紫，袁曉娜，賈桂霞.6個東方百合品種的染色體核型分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（10）.

[5]洪培培，楊建玉，陳洪偉，劉克鋒，王紅利，智利婷.一串紅染色體制片技術(shù)優(yōu)化與計數(shù)[J].西北植物學(xué)報，2011（10）.

[6]顧翠花，孫明哲，王守先，王敏.3個紫薇品種花粉離體培養(yǎng)與萌發(fā)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（23）.

[7]勞世輝，魏岳榮，盛鷗，梁國魯.菠蘿蜜的染色體制片優(yōu)化及核型分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2011（16）.

[8]畢曉穎，趙芷唯，鄭洋，李東升.粗根鳶尾染色體制片技術(shù)及核型分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2011（13）.

[9]王先宏，楊清輝，李富生，何麗蓮，何順長.基于GISH的甘蔗與蔗茅屬間雜交F1后代染色體組成及核型分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（6）.

[10]王先宏，楊清輝，李富生，何麗蓮，何順長.基于GISH的甘蔗與蔗茅屬間雜交F1后代染色體組成及核型分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（6）.

[11]李真，陳素梅，陳發(fā)棣，王海濱，湯訪評，劉兆磊，房偉民.45SrDNA在蒿屬5種植物染色體中的分布[J].園藝學(xué)報，2011（2）.

[12]周燕，高華，高自旸，高述民，胡青.染色體原位雜交技術(shù)與植物顯微技術(shù)實驗探索[J].生物學(xué)通報，2011（2）.

[13]翁天均.基于45SrDNA-FISH與GISH分析的草莓屬（Fragaria）野生種親緣關(guān)系與系統(tǒng)分類研究[D].西南大學(xué)， 2011.

[14]徐川梅.普通小麥—簇毛麥2V染色體端體異附加系和易位系的選育與鑒定及分子原位雜交技術(shù)的應(yīng)用[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[15] R.L.Jarret，M.Newman.Phylogenetic relationships among species of Citrullus and the placement of C. rehmii De Winter as determined by Internal Transcribed Spacer（ITS）sequence heterogeneity[J].Genetic Resources and Crop Evolution，2000（2）：215-222.

[16] S.Hinnisdaels，A.Mouras，G.Salesses，J.Veuskens，C. Taylor，G.B.Gharti-Chhetri，I.Negrutiu，M. Jacobs.Translocation events demonstrated by molecular，in situ hybridization and chromosome pairing analyses in highly asymmetric somatic hybrid plants[J]. Transgenic Research，1992（4）：170-176.

[17] T.H.N.Ellis，D.Lee，C.M.Thomas，P.R.Simpson，W.G. Cleary，M.-A.Newman，K.W.G.Burcham.5S rRNA genes in Pisum：Sequence，long range and chromosomal organization[J].MGG Molecular & General Genetics，1988（2）：333-342.endprint