葉家欣，馬丹丹，王世杰，蔡遜，張智勇，張建新

(中國(guó)人民解放軍武漢總醫(yī)院, 武漢430070)

·臨床研究·

肝癌組織FAM96B表達(dá)變化及其意義

葉家欣，馬丹丹，王世杰，蔡遜，張智勇，張建新

(中國(guó)人民解放軍武漢總醫(yī)院, 武漢430070)

目的觀察肝癌組織96序列相似家庭成員B(FAM96B)mRNA和蛋白表達(dá)變化，并探討其臨床意義。方法選擇42例肝癌患者，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)肝癌組織及癌旁正常肝組織中FAM96B mRNA表達(dá),采用Western blotting法檢測(cè)FAM96B蛋白表達(dá)，并分析肝癌組織FAM96B蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果肝癌組織和癌旁正常肝組織FAM96B mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.423±0.096、1.649±0.268，F(xiàn)AM96B 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.845±0.131、1.548±0.234。肝癌組織和癌旁正常肝組織FAM96B mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，P均<0.05。肝癌組織FAM96B蛋白相對(duì)表達(dá)量與肝癌大小、門靜脈癌栓、肝外轉(zhuǎn)移、Child分級(jí)、BCLC分期有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤數(shù)目、乙肝、肝硬化、血清AFP無(wú)關(guān)(P均>0.05)。結(jié)論肝癌組織FAM96B mRNA和蛋白表達(dá)降低。檢測(cè)肝癌組織FAM96B蛋白表達(dá)量有助于判斷患者病情。

肝癌；96序列相似家庭成員B基因; 96序列相似家庭成員B蛋白

肝癌的發(fā)生、發(fā)展是包括癌基因激活或(和)抑癌基因失活在內(nèi)的多階段多步驟過(guò)程[1～3]。96序列相似家庭成員B (FAM96B) 又稱CGI-128、MIP18或HSPC118, 包含5個(gè)外顯子，編碼163個(gè)氨基酸，染色體定位于16q22.1～22.3，分子量約為18子量(約3D)，其生物學(xué)功能尚不明確[4～7]。目前尚未見(jiàn)關(guān)于FAM96B與肝癌關(guān)系的報(bào)道。本研究觀察了肝癌組織FAM96B mRNA和蛋白表達(dá)變化,分析肝癌組織FAM96B蛋白表達(dá)量與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并探討其臨床意義。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1～12月我院收治的肝癌患者42例，均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診。取手術(shù)切除的肝癌組織和癌旁正常肝組織標(biāo)本(距腫瘤邊緣>2 cm且病理檢查確定為正常肝組織)。本研究已經(jīng)獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者已簽署知情同意書。

1.2 FAM96B mRNA檢測(cè) 參照TRIzol試劑盒操作說(shuō)明書提取42例患者肝癌組織及癌旁正常肝組織的總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，低溫保存?zhèn)溆?。采用?shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)FAM96B mRNA。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中2×SYBR Green mix緩沖液10 μL，上下游引物各0.6 μL(濃度為10 μmol/L)，cDNA 2 μL，DEPC水補(bǔ)齊至20 μL。FAM96B上游引物序列為5′-GGAGTTGAACGTAGTAGAGCAGG-3′，下游引物序列為5′-GACAGACCAATAAGGGTGGC-3′；β-actin上游引物序列為 5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′，下游引物序列為5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′。引物均由上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)公司設(shè)計(jì)并合成。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。每個(gè)樣本均做3個(gè)復(fù)孔，并重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算FAM96B mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 FAM96B蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。稱取肝癌組織和癌旁正常肝組織各0.08 g，加800 μL全蛋白提取液提取蛋白，Bradford法蛋白定量。各取120 μg上樣于5%濃縮膠和15%分離膠，行SDS-PAGE分離。轉(zhuǎn)移蛋白于PVDF膜，給予5%脫脂奶粉稀釋的FAM96B及βAM96B一抗封閉，4 ℃過(guò)夜，HRP標(biāo)記二抗37 ℃溫育, 化學(xué)發(fā)光法顯影。以β-actin為內(nèi)參照。用灰度掃描儀獲得FAM96B蛋白條帶和β-actin條帶的灰度值，F(xiàn)AM96B蛋白相對(duì)表達(dá)量以FAM96B蛋白條帶和β-actin條帶灰度值之比表示。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織和癌旁正常肝組織FAM96BmRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 肝癌組織和癌旁正常肝組織FAM96B mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.423±0.096、1.649±0.268，F(xiàn)AM96B蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.845±0.131、1.548±0.234。肝癌組織和癌旁正常肝組織FAM96B mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較P均<0.05。

2.2 肝癌組織FAM96B蛋白相對(duì)表達(dá)量與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 肝癌組織FAM96B蛋白相對(duì)表達(dá)量與肝癌大小、門靜脈癌栓、肝外轉(zhuǎn)移、Child分級(jí)、BCLC分期有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤數(shù)目、乙肝、肝硬化、血清AFP無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 肝癌組織FAM96B蛋白相對(duì)表達(dá)量與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

觀察某種基因在腫瘤組織及其相應(yīng)鄰近正常組織的差異性表達(dá)是分析基因與腫瘤關(guān)系的最常用方法，異常表達(dá)的基因可能在腫瘤的形成過(guò)程中扮演重要角色，可認(rèn)為是潛在的新一類控制細(xì)胞增殖和凋亡的癌基因或抑癌基因[8～10]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AM96B mRNA和蛋白在肝癌組織中的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于癌旁正常肝組織。提示FAM96B在肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色?？赡苁且职┗蚧蛘咄ㄟ^(guò)間接作用抑制肝癌和其他其他腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究證實(shí)，F(xiàn)AM96B在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，并指出其在人類結(jié)腸癌組織中低表達(dá)[11，12]。這與本研究結(jié)果基本一致。

本研究還觀察了肝癌組織FAM96B蛋白表達(dá)量與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示FAM96B在肝癌組織中低表達(dá)與肝癌患者的性別、年齡、腫瘤數(shù)目、乙肝、肝硬化、血清AFP無(wú)關(guān)。目前臨床上已經(jīng)明確肝癌的發(fā)生與乙肝和肝硬化密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AM96B表達(dá)與乙肝與否及有無(wú)肝硬化無(wú)相關(guān)性，此研究結(jié)果可能需要更加深入地研究來(lái)論證。目前，血清AFP在臨床上被用來(lái)篩查早期肝癌和評(píng)價(jià)患者預(yù)后。但只有40%～60%的肝癌患者血清AFP升高。因此單用血清AFP來(lái)診斷肝癌容易造成漏診[13]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AM96B有潛力成為不依賴AFP的肝癌標(biāo)記物。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因之一，腫瘤細(xì)胞離開(kāi)原發(fā)灶并侵入周圍組織和(或)侵襲血管與淋巴管進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)向遠(yuǎn)處組織擴(kuò)散形成新的轉(zhuǎn)移灶，在血供充分的情況下增殖形成轉(zhuǎn)移瘤。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AM96B在肝癌組織中低表達(dá)與腫瘤大小、門靜脈癌栓、肝外轉(zhuǎn)移、Child分級(jí)、BCLC分期顯著相關(guān)。提示FAM96B可能是一個(gè)與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子指標(biāo)，在肝癌發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中起到一定的抑癌基因作用。

綜上所述，肝癌組織FAM96B mRNA和蛋白表達(dá)降低。檢測(cè)肝癌組織FAM96B蛋白表達(dá)量有助于判斷患者病情。FAM96B可能是一個(gè)在肝癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮抑制作用的抑癌基因，并且可能成為一個(gè)新的肝癌生物學(xué)標(biāo)志物。然而本研究也存在一些不足，如樣本量不足、未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及靶基因探討。下一步將擴(kuò)大樣本量在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證 FAM96B在肝癌中的生物學(xué)作用、機(jī)制和臨床意義。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81350006)；湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012FFB06805)。

蔡遜(E-mail： caiwenqian@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.015

R735.7

B

1002-266X(2017)40-0053-03

2017-03-10)