孫瑛，劉一民，王玉，丁靜，陳紅兵

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院，山東濰坊262500)

miR-221在大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)損傷中的作用及其機制

孫瑛，劉一民，王玉，丁靜，陳紅兵

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院，山東濰坊262500)

目的探討miR-221在大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)損傷中的作用及其可能機制。方法選擇SD大鼠60只，隨機分為假手術(shù)組、模型組和agomiR-221組，每組20只。模型組、agomiR-221組建立局灶性腦缺血再灌注(MCAO)模型。假手術(shù)組僅手術(shù)，不阻斷血流。成模后agomiR-221組尾靜脈注射agomiR-221(miR-221激動劑)80 mg/kg，模型組尾靜脈注射等量agomiR-NC，假手術(shù)組不予處理。再灌注24 h，各組隨機取6只，留取腦組織，采用TTC染色法觀察腦梗死體積；另取6只，采用干濕重法計算腦組織含水量；剩余大鼠采用原位末端標記法計算細胞凋亡指數(shù)(AI)；Real-time PCR法檢測腦組織miR-221 mRNA表達；Western blotting法檢測腦組織炎癥因子IL-1β、TNF-α及凋亡相關(guān)蛋白Caspase3表達。結(jié)果假手術(shù)組和agomiR-221組腦組織miR-211 mRNA相對表達量明顯高于模型組，且agomiR-221組高于假手術(shù)組(P均<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組腦梗死體積、腦組織含水量及AI明顯升高(P均<0.05)，而agomiR-221組腦梗死體積、腦組織含水量及AI較模型組明顯降低(P均<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組炎癥因子IL-1β、TNF-α以及凋亡相關(guān)蛋白Caspse3表達明顯升高(P均<0.05)，而agomiR-221組炎癥因子IL-1β、TNF-α以及凋亡相關(guān)蛋白Caspse3表達較模型組明顯降低(P均<0.05)。結(jié)論過表達miR-221對大鼠腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護作用，其機制可能與調(diào)控炎癥反應(yīng)和細胞凋亡有關(guān)。

腦缺血再灌注損傷；微小RNA-221；細胞凋亡；炎癥因子；凋亡因子；大鼠

腦缺血再灌注損傷(CIR)是指各種原因?qū)е履X組織血流中斷，閉塞的腦血管再通后缺血性損傷卻進一步加重的現(xiàn)象，是一個由多因素參與的復(fù)雜病理生理過程。目前CIR的發(fā)生機制主要包括細胞凋亡學(xué)說、炎癥反應(yīng)學(xué)說、興奮性氨基酸學(xué)說以及自由基學(xué)說等[1]。炎癥反應(yīng)和細胞凋亡是誘導(dǎo)CIR后神經(jīng)細胞損傷的主要因素。微小RNA(miRNA)是一組廣泛存在于生物體中不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，能與特定基因的mRNA 3′非編碼區(qū)相結(jié)合，阻礙其翻譯或直接使其降解，從而對目的基因進行調(diào)節(jié)[2]。大量研究證實，miRNAs與缺血性腦血管病關(guān)系密切[3，4]。miR-221是較早發(fā)現(xiàn)的miRNA家族成員之一，目前有關(guān)miR-221的研究主要集中在惡性腫瘤方面[5]。近期研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者血清miR-221水平較健康者明顯下降[3]。因此推測，miR-221在CIR的發(fā)生、發(fā)展過程中可能具有一定作用。2016年3～7月，我們觀察了CIR大鼠腦組織miR-221表達變化，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠60只，清潔級，3月齡，體質(zhì)量280～300 g，由北京維通利華動物實驗中心提供，合格證號：SCXK(京)2006-0009。所有大鼠標準飲食、自由攝水，濕度55%～60%，溫度22～24 ℃，模擬正常晝夜交替的環(huán)境飼養(yǎng)。TRIzol試劑，美國Invitrogen公司；miR-221激動劑agomiR-221、陰性對照agomiR-NC，廣州銳博生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser)及熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq TM)，日本TaKaRa公司；所有引物由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計合成。IL-1β、TNF-α、Caspase3兔抗鼠多克隆抗體，美國Abcam公司；GAPDH兔抗鼠多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，武漢博士德生物工程有限公司；原位末端標記(TUNEL)檢測試劑盒、Light Cycler PCR儀，美國羅氏公司。

1.2 模型制備及分組干預(yù) 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、agomiR-221組，每組20只。模型組、agomiR-221組采用改良尼龍線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注(MCAO)模型[6]：10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頸正中切口縱行剪開皮膚，分離皮下組織，結(jié)扎右側(cè)頸總動脈近心段，于頸總動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈，用微動脈夾暫時夾閉頸內(nèi)動脈，在距離頸總動脈分叉部2 mm處，剪開一小口，將前端包裹石蠟的魚線插入頸內(nèi)動脈，插入深度從頸總動脈分叉部算起約18 mm，固定線栓，松開微動脈夾。假手術(shù)組基本操作同模型組和agomiR-221組，但不插入線栓，不阻斷血流。模型組和agomiR-221組阻斷血流120 min，將線栓拔除，恢復(fù)血流灌注。再灌注24 h，按Zea-Longa 5分制評分標準[7]評價神經(jīng)功能，評分1～3分為模型制備成功。模型組和agomiR-221組各成模18只。成模后agomiR-221組阻斷血流同時尾靜脈注射agomiR-221 80 mg/kg，模型組阻斷血流同時尾靜脈注射等量agomiR-NC，假手術(shù)組不予處理。

1.3 相關(guān)指標觀察

1.3.1 腦梗死體積及腦組織含水量 ①腦梗死體積：采用TTC染色法[8]。再灌注24 h，各組隨機取6只，10%水合氯醛800 mg/kg麻醉后，斷頸處死，完整取出腦組織，以視交叉前4 mm開始每間隔2 mm做連續(xù)冠狀切片，每個腦組織切片5張，迅速浸入2% TTC染液，37 ℃恒溫水浴中孵育30 min，4%多聚甲醛固定24 h，拍照，利用Image J圖像分析軟件測定腦梗死面積(紅色區(qū)域為正常腦組織，蒼白色區(qū)域為梗死區(qū))，腦梗死體積=各層梗死面積之和×層間隔。②腦組織含水量：采用干濕重法。各組隨機另取6只，快速斷頸處死，取大腦組織，沿腦中線切取缺血側(cè)腦半球，用濾紙將腦組織表面的液體吸干，立即在電子分析天平上稱濕重；置入110 ℃烤箱中烘烤24 h，稱干重，計算腦組織含水量。腦組織含水量=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%。

1.3.2 大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡情況 采用TUNEL法。各組剩余大鼠10%水合氯醛800 mg/kg麻醉，斷頸處死，取大腦組織常規(guī)制作石蠟切片，并按TUNEL試劑盒說明書操作進行染色。凋亡細胞TUNEL染色陽性，呈棕黃色，橢圓形或圓形，核固縮，偶見核碎裂。在光學(xué)顯微鏡下，選取不重復(fù)的5個400倍視野，應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)計數(shù)每個視野中凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算細胞凋亡指數(shù)(AI)。AI=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.3.3 腦組織miR-221 mRNA表達 采用Real-time PCR法。取各組剩余大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)100 mg，TRIzol法提取腦組織總RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度，OD260/OD280為1.8～2.1。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列：miR-221上游引物：5′-CAGCATACATGATTCCTTGTGA-3′，下游引物：5′-CTTTGGTGTTTGAGATGTTTGG-3′。參照Real-time PCR試劑盒說明書配置PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性3 s，56 ℃退火34 s，72 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-221 mRNA相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 腦組織IL-1β、TNF-α、Caspase3蛋白表達 采用Western blotting法。取各組剩余大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)100 mg，加入裂解液，充分研磨裂解，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法蛋白定量后加入上樣緩沖液混勻，100 ℃水浴15 min，使蛋白充分變性。蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗(IL-1β 1∶1 000，TNF-α 1∶1 000，Caspase3 1∶1 000，GAPDH 1∶2 000)4 ℃搖床孵育過夜，次日洗膜，加入HRP標記的二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光，曝光顯影。采用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組腦梗死體積、腦組織含水量比較 見表1。

表1 各組腦梗死體積及腦組織含水量比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 各組大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡情況比較 假手術(shù)組腦組織切片偶見TUNEL染色陽性細胞，AI為(2.38±0.41)%；模型組可見大量TUNEL染色陽性細胞，AI為(38.46±5.89)%；agomiR-221組TUNEL染色陽性細胞較模型組明顯減少，AI為(22.71±4.67)%。agomiR-221組和模型組AI均高于假手術(shù)組，且模型組高于agomiR-221組(P均<0.05)。

2.3 各組腦組織miR-221表達比較 假手術(shù)組、模型組和agomiR-221組腦組織miR-211 mRNA相對表達量分別為1.01±0.03、0.44±0.09、3.11±0.18。假手術(shù)組和agomiR-221組腦組織miR-211 mRNA相對表達量明顯高于模型組，且agomiR-221組高于假手術(shù)組(P均<0.05)。

2.4 各組腦組織IL-1β、TNF-α、Caspase3蛋白表達比較 見表2。

表2 各組腦組織IL-1β、TNF-α、Caspase3蛋白相對表達量比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

腦缺血可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)大量神經(jīng)細胞的缺失和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)受損，在短期內(nèi)恢復(fù)血流灌注，神經(jīng)系統(tǒng)損傷卻進一步加重，這種現(xiàn)象被稱為CIR。CIR對機體造成的損傷遠遠超過缺血損害，其作用機制尚不完全清楚。

近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可能參與調(diào)控CIR的病理過程。有學(xué)者采用microarray方法對腦卒中患者和正常人的外周血檢測發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在腦卒中急性期出現(xiàn)變異[9，10]；在缺血再灌注模型大鼠腦組織內(nèi)也發(fā)現(xiàn)多種miRNA的變異[11]。Yin等[12]研究發(fā)現(xiàn)，MCAO模型大鼠腦組織miR-497表達升高，抑制miR-497表達可明顯減少腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積。Jeyaseelan等[13]利用基因芯片技術(shù)檢測腦缺血再灌注大鼠腦組織miRNA表達，發(fā)現(xiàn)30余種miRNA表達發(fā)生明顯變化，并認為這些miRNA可能參與了CIR過程。miR-221基因位于染色體Xp11.3附近，在血管生成過程中具有重要作用[14]，且與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[8]。目前，國內(nèi)外關(guān)于miR-221與CIR關(guān)系的研究甚少。Tsai等[3]研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者血清miR-221表達降低，提示miR-221可能與腦缺血性損傷有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，模型組腦組織miR-221表達明顯低于假手術(shù)組，表明miR-221表達降低可能與CIR的發(fā)生有關(guān)。為進一步明確miR-221在CIR大鼠中的作用，本研究通過尾靜脈注射miR-221激動劑agomiR-221，成功構(gòu)建體內(nèi)過表達miR-221的MCAO大鼠模型；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，agomiR-221組CIR后AI、腦梗死區(qū)體積及腦組織含水量均明顯低于模型組，表明過表達miR-221可顯著改善CIR。

CIR的發(fā)生機制尚不完全明確，涉及氧自由基、鈣超載、能量代謝異常、炎癥反應(yīng)及細胞凋亡等方面。炎癥反應(yīng)和細胞凋亡可能是CIR后神經(jīng)細胞損傷的主要原因，其中關(guān)系最為密切的炎性因子有IL-1β、IL-6和TNF-α等。本研究結(jié)果顯示，模型組腦組織IL-1β、TNF-α蛋白表達較假手術(shù)組明顯升高，而agomiR-221組較模型組明顯降低，表明miR-221可能通過調(diào)控炎性因子IL-1β、TNF-α表達，繼而抑制CIR。Caspases是細胞凋亡的啟動者和執(zhí)行者，Caspase3是Caspases家族最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶。本研究結(jié)果顯示，模型組腦組織Caspase3蛋白表達較假手術(shù)組明顯升高，而agomiR-221組Caspase3蛋白表達較模型組明顯降低，表明miR-221可能通過調(diào)控Caspase3表達繼而抑制CIR。以上結(jié)果表明，miR-221可能通過調(diào)控炎癥反應(yīng)和細胞凋亡參與抑制CIR進程。

綜上所述，miR-221過表達對大鼠CIR具有神經(jīng)保護作用；其機制可能與調(diào)控炎癥反應(yīng)和細胞凋亡有關(guān)。

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陳紅兵(E-mail： chb0536@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.012

R743

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1002-266X(2017)40-0045-03

2016-12-16)