張揚(yáng)武，羅偉生，康毅，禤傳鳳，王仕衍，張夏，陳姍，蔡碧蓮

(1廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院，南寧530001；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)；3廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

·基礎(chǔ)研究·

荔枝核總黃酮對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖及PPAR-γ、TGF-β1表達(dá)的影響

張揚(yáng)武1，羅偉生2，康毅3，禤傳鳳2，王仕衍2，張夏2，陳姍2，蔡碧蓮2

(1廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院，南寧530001；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)；3廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

目的探討荔枝核總黃酮(TFL)對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖及過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)表達(dá)的影響及其機(jī)制，為肝纖維化的臨床治療提供依據(jù)。方法將體外培養(yǎng)的HSC-T6細(xì)胞分為觀察1、2、3組和對(duì)照組。觀察1組加640 μg/mL的TFL，觀察2組加640 μg/mL的TFL和15 μmol/L的羅格列酮，觀察3組加640 μg/mL的TFL和2 μmol/L的GW9662，對(duì)照組加正常培養(yǎng)基。各組均繼續(xù)培養(yǎng)72 h。采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況(結(jié)果以O(shè)D450值表示)；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞PPAR-γ、TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量；采用免疫組化SP法檢測(cè)各組細(xì)胞PPAR-γ、TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率。結(jié)果培養(yǎng)72 h觀察1、2、3組OD450值均低于對(duì)照組(P均<0.05)，觀察2組OD450值低于觀察1組(P<0.05)，觀察3組OD450值高于觀察1組(P<0.05)。觀察1、2、3組PPAR-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組(P均<0.05)；TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均低于對(duì)照組(P均<0.05)；觀察2組PPAR-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于觀察1組(P<0.05)，TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于觀察1組(P<0.05)；觀察3組PPAR-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于觀察1組(P<0.05)，TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于觀察1組(P<0.05)。結(jié)論TFL能夠抑制大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖，該作用可能與其上調(diào)PPAR-γ表達(dá)、下調(diào)TGF-β1表達(dá)有關(guān)。

肝纖維化；荔枝核總黃酮；肝星狀細(xì)胞；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；大鼠

荔枝核味甘、微苦，歸肝腎兩經(jīng)，具有祛寒止痛、行氣散結(jié)的功效，荔枝核總黃酮(TFL)是荔枝核中藥理活性的主要成分之一。近年研究表明，TFL具有明顯的抗肝纖維化作用；TFL能夠上調(diào)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)、下調(diào)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)肝纖維化[1]；TFL可通過(guò)上調(diào)PPAR-γ/c-Ski、下調(diào)α激動(dòng)蛋白抑制肝星狀細(xì)胞的活化[2]。但其對(duì)PPAR-γ/TGF-β1信號(hào)通路有無(wú)交叉影響尚未可知。2016年1月～2017年2月，我們觀察了TFL對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖及PPAR-γ、TGF-β1表達(dá)的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機(jī)制，旨在為肝纖維化的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 HSC-T6細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫(kù)。TFL購(gòu)自南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司，純度85%；羅格列酮、GW9662購(gòu)自購(gòu)自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司；FBS、DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自加拿大維森特公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、PPAR-γ、TGF-β1、GAPDH內(nèi)參引物購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;PPAR-γ、TGF-β1一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔免疫組化SP試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞分組及干預(yù) 電子天平秤稱量20 mg TFL溶解于125 μL的DMSO中，加入完全培養(yǎng)基至25 mL，過(guò)濾配制成800 μg/mL的母液，然后用完全培養(yǎng)基稀釋成640 μg/mL的工作液[1]；用文獻(xiàn)[3，4]的方法制作羅格列酮工作液(濃度15 μmol/L)和GW9662工作液(濃度2 μmol/L)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HSC-T6細(xì)胞，胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/mL ,吹懸打勻后以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板。設(shè)觀察1、2、3組和對(duì)照組，每組5孔。細(xì)胞完全貼壁后棄去舊培養(yǎng)基，觀察1組加640 μg/mL的TFL，觀察2組加640 μg/mL的TFL和15 μmol/L的羅格列酮，觀察3組加640 μg/mL的TFL和2 μmol/L的GW9662，對(duì)照組加正常培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 組細(xì)胞增殖情況 采用CCK-8法。各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后棄培養(yǎng)基，加入新的完全培養(yǎng)基后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，多功能酶標(biāo)讀數(shù)儀上測(cè)定450 nm處的OD值(OD450值)。

1.3.2 PPAR-γ、TGF-β1mRNA表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。培養(yǎng)72 h后用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參照。GAPDH上游引物5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAAC-3′，下游引物5′-GTGGTTCACACCCATCACAA-3′；PPAR-γ上游引物5′-CTGTTTTATGCTGTTATGGGT-3′，下游引物5′-GTCAAAGGAA-TGGGAGTGGTC-3′；TGF-β1上游引物5′-CTGGGGCCCTGCCCCTACAT-3′，下游引物5′-CTTGGGCTTGCG-ACCCACGT-3′。采用美國(guó)ABI 7300 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，兩步法反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s，44個(gè)循環(huán)。讀取Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 PPAR-γ、TGF-β1蛋白表達(dá) 采用免疫組化SP 法。培養(yǎng)72 h 后取各組細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，3% H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，正常血清封閉后分別加入鼠抗人PPAR-γ、TGF-β1單克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，隨后加入生物素二抗工作液及辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，經(jīng)DAB 顯色，脫水、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。每組隨機(jī)選取9個(gè)有意義的高倍鏡視野進(jìn)行觀察，可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)呈特異性棕褐色陽(yáng)性染色，計(jì)算每個(gè)視野下細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)，即陽(yáng)性表達(dá)率。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖情況比較 培養(yǎng)72 h時(shí)觀察1、2、3組和對(duì)照組OD450值分別為1.534± 0.016、1.318±0.006、1.846±0.017、2.244±0.084。觀察1、2、3組OD450值均低于對(duì)照組(P均<0.05)，觀察2組OD450值低于觀察1組(P<0.05)，觀察3組OD450值高于觀察1組(P<0.05)。

2.2 各組PPAR-γ、TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 觀察1、2、3組PPAR-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(P均<0.05)，TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P均<0.05)。觀察2組PPAR-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量高于觀察1組(P<0.05)，TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量低于觀察1組(P<0.05)。觀察3組PPAR-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量低于觀察1組(P<0.05)，TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量高于觀察1組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 各組PPAR-γ、TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較 觀察1、2、3組PPAR-γ蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組(P均<0.05)，TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均低于對(duì)照組(P均<0.05)。觀察2組PPAR-γ蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于觀察1組(P<0.05)，TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于觀察1組(P<0.05)。觀察3組PPAR-γ蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于觀察1組(P<0.05)，TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于觀察1組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)72 h后各組PPAR-γ、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與觀察1組比較，#P<0.05。

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病轉(zhuǎn)化成肝硬化的必經(jīng)階段。逆轉(zhuǎn)肝纖維化是阻斷肝臟疾病轉(zhuǎn)化成肝硬化的惟一方法[5]。肝纖維化的形成是由于肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活從而導(dǎo)致大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積于肝內(nèi)，而HSC激活的同時(shí)又可分泌大量的TGF-β1，這種自分泌的正反饋機(jī)制使TGF-β1加強(qiáng)儲(chǔ)脂細(xì)胞合成膠原，促進(jìn)大量ECM合成，從而促進(jìn)肝纖維化不斷進(jìn)展[6]。研究證實(shí)，PPAR-γ通路可抑制HSC的活化而延緩肝纖維化進(jìn)程；PPAR-γ可能是一種新的治療纖維化疾病的藥理學(xué)靶點(diǎn)[7]。PPAR-γ活性降低與HSC纖維母細(xì)胞樣活化關(guān)系密切，而給予活化的HSC多種內(nèi)源或外源性PPAR-γ配體可顯著抑制HSC纖維生成活性[8]；PPAR-γ可通過(guò)阻斷TGF-β1信號(hào)通路抑制ECM的生成，從而抑制肝星狀細(xì)胞的活化和增殖[9]。PPAR-γ/TGF-β-Smad信號(hào)通路共同介導(dǎo)肝纖維化，姜黃素通過(guò)減少PPAR-γ的表達(dá)，從而減少ECM產(chǎn)生，PPAR-γ基因啟動(dòng)子內(nèi)有兩個(gè)Smad結(jié)合元件(SBEs)，Smad3/4蛋白復(fù)合物可特異性結(jié)合至SBEs，Smad4過(guò)度表達(dá)可消除姜黃素對(duì)PPAR-γ啟動(dòng)子的負(fù)調(diào)節(jié)作用，減弱其對(duì)TGF-β信號(hào)通路的抑制作用[10]。

PPAR-γ作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)細(xì)胞的活化和增殖具有重要的調(diào)節(jié)作用。羅格列酮除了具有降糖作用外，還可以作為PPAR-γ的激動(dòng)劑。研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮能夠通過(guò)上調(diào)PPAR-γ的表達(dá)從而抑制Ⅰ型膠原的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)[11]；羅格列酮干預(yù)后大鼠的肝纖維化程度減輕，PPAR-γ信號(hào)通路的變化與TGF-β1的表達(dá)存在某種關(guān)聯(lián)，PPAR-γ信號(hào)的激活可能通過(guò)TGF-β1途徑調(diào)節(jié)肝纖維化的進(jìn)程[12]。GW9662是PPAR-γ選擇性不可逆拮抗劑。當(dāng)羅格列酮激動(dòng)PPAR-γ的表達(dá)時(shí)，HSC細(xì)胞的活化和增殖受到抑制，采用GW9662干預(yù)后，其PPAR-γ的表達(dá)受到抑制，抑制肝纖維化的作用減弱，從而證明GW9662可作為羅格列酮激動(dòng)PPAR-γ表達(dá)的特異性阻斷劑[13～15]。

TFL是從荔枝核提取出來(lái)的一種化合物。研究證實(shí)，TFL有明顯的抗肝纖維化作用，涉及參與的信號(hào)通路主要有PPAR-γ、TGF-1、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、Toll樣受體(TLR)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)等[1，2，16，17]。肝纖維化進(jìn)程不是單一信號(hào)通路作用的結(jié)果，其中存在多個(gè)途徑的相互交叉和疊加，這一過(guò)程非常復(fù)雜。本研究結(jié)果顯示，TFL能抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖，加入羅格列酮?jiǎng)tHSC-T6細(xì)胞增殖活性進(jìn)一步下降，加入GW9662則HSC-T6細(xì)胞增殖活性有所恢復(fù)。應(yīng)用TFL聯(lián)合羅格列酮的觀察2組PPAR-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于單純應(yīng)用TFL的觀察1組，TGF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于單純應(yīng)用TFL的觀察1組；而應(yīng)用TFL聯(lián)合GW9662的觀察3組PPAR-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于單純應(yīng)用TFL的觀察1組，TGF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于單純應(yīng)用TFL的觀察1組。提示TFL抑制HSC-T6細(xì)胞增殖的作用可能是通過(guò)上調(diào)PPAR-γ表達(dá)、下調(diào)TGF-1表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。激活PPAR-γ信號(hào)通路、進(jìn)而抑制TGF-1表達(dá)可以抑制肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞的增殖，可能有助于逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360530，81660779)；廣西中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生科研創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目(YJS201617)。

羅偉生(E-mail: 4011188@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.008

R575

A

1002-266X(2017)40-0029-03

2016-10-27)