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        沉默P-REX2a對胃癌細(xì)胞SGC7901增殖、阿霉素敏感性的影響及其機(jī)制

        2017-12-12 00:44:47周巧輝艾耀偉潘志紅郭明文
        山東醫(yī)藥 2017年40期
        關(guān)鍵詞:阿霉素磷酸酶試劑盒

        周巧輝,艾耀偉,潘志紅,郭明文

        (三峽大學(xué)人民醫(yī)院 宜昌市第一人民醫(yī)院,湖北宜昌443000)

        沉默P-REX2a對胃癌細(xì)胞SGC7901增殖、阿霉素敏感性的影響及其機(jī)制

        周巧輝,艾耀偉,潘志紅,郭明文

        (三峽大學(xué)人民醫(yī)院 宜昌市第一人民醫(yī)院,湖北宜昌443000)

        目的觀察沉默P-REX2a對胃癌細(xì)胞SGC7901增殖、阿霉素敏感性的影響,并探討其機(jī)制。方法將胃癌細(xì)胞SGC7901分為正常培養(yǎng)組(NM組)、陰性對照組(NC組)、干擾組(siRNA組)。NM組正常培養(yǎng),NC組細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對照序列,siRNA組轉(zhuǎn)染P-REX2a siRNA,轉(zhuǎn)染24 h時采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測各組P-REX2a mRNA,轉(zhuǎn)染24、48、72 h時用MTT法觀察各組細(xì)胞增殖情況(以O(shè)D570表示)。另取胃癌細(xì)胞SGC7901同法分組并轉(zhuǎn)染48 h后加入0.3 μmol/L阿霉素培養(yǎng)24 h,用流式細(xì)胞術(shù)測算各組細(xì)胞凋亡率,用Western blotting法檢測各組Bcl-2、Bax、PTEN、Akt、p-Akt蛋白,用基于PIP3底物的定磷比色法測定PTEN磷酸酶活性。結(jié)果siRNA組P-REX2a mRNA低于NC組、NM組(P均<0.05),轉(zhuǎn)染24、48、72 h時OD570高于NC組、NM組(P均<0.05),加入阿霉素培養(yǎng)后細(xì)胞凋亡率高于NC組、NM組(P均<0.05),Bax蛋白表達(dá)量、PTEN磷酸酶活性高于NC組、NM組(P均<0.05),Bcl-2、p-Akt蛋白表達(dá)量低于NC組、NM組(P均<0.05)。三組PETN、Akt蛋白表達(dá)量相比P均>0.05。結(jié)論沉默P-REX2a可以抑制胃癌細(xì)胞SGC7901增殖,提高胃癌細(xì)胞SGC7901對阿霉素的敏感性。這可能是由于沉默P-REX2a可以提高PTEN磷酸酶活性、抑制PI3K/Akt通路活化、抑制Bcl-2表達(dá)、促進(jìn)Bax表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡

        胃癌;P-REX2a;基因沉默;小干擾RNA;阿霉素 ;第10號染色體同源缺失性張力蛋白

        胃癌是人類四大惡性腫瘤之一,其病死率位于世界第二[1]。由于早期不易發(fā)現(xiàn),就診時多已進(jìn)入中晚期,因此胃癌的預(yù)后在較大程度上依賴于輔助化療。隨著分子機(jī)制不斷深入研究,多種有利的化療方案已在臨床實(shí)施或在探索中。傳統(tǒng)化療藥物在綜合化療中仍占主要地位,但逐年提高的耐藥率導(dǎo)致化療效率低下。因此,胃癌耐藥機(jī)制的探索成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。近年文獻(xiàn)[2~5]報(bào)道,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路在化療過程中被誘導(dǎo)激活從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的耐藥。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,可以特異性使肌醇環(huán)上的3位羥基磷酸化,使4,5二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙攀?,4,5三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3),后者將蛋白激酶B(PKB,又稱Akt)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上,并改變Akt的構(gòu)象使之能被3-磷脂酰肌醇依賴蛋白激酶1/2(PDK1/2)磷酸化和激活,從而傳遞抗凋亡信號[6]。第10號染色體同源缺失性張力蛋白(PTEN)具有脂質(zhì)磷酸酶活性,可將膜PIP3的D3 位的磷酸而拮抗PI3K的活化效應(yīng)[7]。P-REX2a蛋白具有DHPH結(jié)構(gòu)域(與GEF的活性有關(guān)),此結(jié)構(gòu)域可直接與PTEN結(jié)合,從而抑制PTEN磷酸酶活性,促進(jìn)PI3K/Akt的活化[8,9]。沉默P-REX2a應(yīng)該對胃癌細(xì)胞的增殖和耐藥性產(chǎn)生影響,但是研究甚少。2014年5月~2016年2月,本研究采用siRNA技術(shù)沉默胃癌細(xì)胞SGC7901中P-REX2a的表達(dá),并觀察胃癌細(xì)胞SGC7901增殖情況和阿霉素敏感性的變化,以及PTEN/PI3K/Akt調(diào)節(jié)軸的變化,探討通過沉默P-REX2a提高胃癌細(xì)胞化療敏感性的可行性及其機(jī)制?,F(xiàn)報(bào)告如下。

        1 材料與方法

        1.1 細(xì)胞與主要試劑 人胃腺癌細(xì)胞SGC7901購自上海賽百慷生物技術(shù)股份公司。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自Gibco公司,胎牛血清購自杭州四季青公司,Lipofectamine2000和TRIzol購自Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR Premix Ex Taq購自TaKaRa公司。一抗中P-REX2a(ab169027)購自Abcam公司,PTEN(9188P)、Akt(4691P)、p-Akt(S473,4060P)、Bax(2772S)、Bcl-2(2870P)均購自美國CST公司。MTT檢測試劑盒購自美國Sigma,阿霉素購自美國Selleckchem公司。AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司。GENMED定磷比色法法測定試劑盒購自美國Genmed 公司。siRNA片段定制于由上海吉瑪公司,P-REX2a-Homo-883(siRNA)序列為5′-GGCAUCUA-CAGAUGGACAUTT-3′/5′-AUGUCCAUCUGUAGAU-GCCTT-3′。由上海吉瑪公司合成。

        1.2 胃腺癌細(xì)胞SGC7901分組及siRNA轉(zhuǎn)染 人胃腺癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞貼壁生長,培養(yǎng)用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱,培養(yǎng)基中加入1%的雙抗(青霉素與鏈霉素),隔天觀察、換液1次。取處于對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的SGC7901細(xì)胞,以每孔2×105個接種于6孔板,置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。設(shè)正常培養(yǎng)組(NM組)、陰性對照組(NC組)、干擾組(siRNA組)。待細(xì)胞生長12 h后開始轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染前2 h,換為2 mL無血清DMEM培養(yǎng)基。按照Lipofectamine2000說明書操作,轉(zhuǎn)染時RNA與轉(zhuǎn)染試劑的比例為2∶1。

        1.3 P-REX2a mRNA檢測 轉(zhuǎn)染24 h后收集各組細(xì)胞放入1.5 mL EP管中,加入1 mL TRIzol,按TRIzol試劑操作說明書逐步提取總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作,在PCR儀中合成cDNA。用cDNA行實(shí)時熒光定量PCR,參照試劑盒SYBR qPCR mix(TaKaRa)說明書操作,P-REX2a上游引物序列為5′-TGGGAGGGGTCCAACATCA -3′,下游引物序列為5′-TCTTCAACCGTCTGTGTTTTCTT-3′; GADPH上游引物序列為5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′,下游引物序列為5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s,然后95 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s,共重復(fù)40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算P-REX2a mRNA相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        1.4 細(xì)胞增殖情況觀察 采用MTT法。轉(zhuǎn)染24、48、72 h后,每孔分別加入100 μL MTT,37 ℃培養(yǎng)4 h,吸出培養(yǎng)基,加入1 500 μL DMSO,震蕩10 min,各取100 μL放入96孔板中,酶標(biāo)儀在570 nm處測定各孔吸光度值(OD)。每組設(shè)5個平行孔,各平行孔取均值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        1.5 細(xì)胞阿霉素敏感性觀察 另取胃癌細(xì)胞SGC7901同法分組并轉(zhuǎn)染48 h后加入終濃度為0.3 μmol/L的阿霉素繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞,按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作,加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞,加入5 μL AnnexinV-FITC混勻,再加入5 μL 碘化丙啶混勻,室溫避光反應(yīng)5~15 min,1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀測算細(xì)胞凋亡率。

        1.6 細(xì)胞Bcl-2、Bax、PTEN、Akt、p-Akt蛋白檢測 采用Western blotting法。收集1.5中阿霉素處理后的細(xì)胞,加入100 μL的RIPA蛋白裂解液冰上裂解30 min,離心取上清,按BCA試劑盒操作說明測定蛋白濃度。用5%濃縮膠與10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE,恒流轉(zhuǎn)膜,用含5%脫脂奶的TBST溶液室溫封閉1.5 h,加一抗4 ℃孵育過夜,取出用TBST洗10 min ,重復(fù)3次然后浸入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h,TBST液洗3次,化學(xué)發(fā)光法顯影。Image J 軟件測算條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參,用目的蛋白條帶和β-actin條帶灰度值之比表示目的蛋白相對表達(dá)量。

        1.7 細(xì)胞PTEN磷酸酶活性測定 收集1.5中阿霉素處理后的細(xì)胞,采用基于PIP3底物的定磷比色法檢測PTEN磷酸酶活性。參考GENMED定磷比色法法測定試劑盒說明書操作。

        2 結(jié)果

        2.1 細(xì)胞P-REX2a mRNA表達(dá)比較 siRNA組、NC組、NM組細(xì)胞P-REX2a mRNA相對表達(dá)量分別為0.54±0.06、0.96±0.07、1。siRNA組P-REX2a mRNA相對表達(dá)量與NC組、NM組相比,P均<0.05。NC組細(xì)胞P-REX2a mRNA相對表達(dá)量與NM組相比P>0.05。

        2.2 各組細(xì)胞增殖比較 轉(zhuǎn)染24、48、72 h各組細(xì)胞OD570見表1。轉(zhuǎn)染24、48、72 h時siRNA組細(xì)胞OD570高于NC組、NM組(P均<0.05),NC組細(xì)胞OD570與NM組相比P均>0.05。

        表1 轉(zhuǎn)染24、48、72 h各組細(xì)胞OD570比較

        注:與NC、NM組相比,*P<0.05。

        2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 siRNA組、NC組、NM組細(xì)胞凋亡率分別為(18.54±0.73)%、(17.37±0.33)%、(17.30±0.47)%。siRNA組細(xì)胞凋亡率與NC組、NM組相比,P均<0.05。NC組細(xì)胞凋亡率與NM組相比P>0.05。

        2.4 各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、PTEN、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)比較 各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、PTEN、Akt、p-Akt蛋白相對表達(dá)量見表2。三組細(xì)胞中PTEN、Akt蛋白相對表達(dá)量相比P均>0.05。siRNA組細(xì)胞Bax蛋白相對表達(dá)量高于NC組、NM組(P均<0.05),Bcl-2、p-Akt蛋白相對表達(dá)量低于NC組、NM組(P均<0.05)。NC組細(xì)胞Bcl-2、Bax、p-Akt蛋白相對表達(dá)量與NM組相比P均>0.05。

        表2 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、PTEN、Akt、p-Akt蛋白相對表達(dá)量比較

        注:與NC、NM組相比,*P<0.05。

        2.5 各組細(xì)胞PTEN磷酸酶活性比較 siRNA組、NC組、NM組細(xì)胞PTEN磷酸酶活性分別為0.41±0.01、0.30±0.08、0.29±0.06。siRNA組胞PTEN磷酸酶活性與NC組、NM組相比,P均<0.05。NC組細(xì)胞PTEN磷酸酶活性與NM組相比P>0.05。

        3 討論

        阿霉素是胃癌化療中的經(jīng)典藥物,近些年被報(bào)道出現(xiàn)了耐藥。PI3K/Akt信號通路與胃癌阿霉素耐藥密切相關(guān)[2]。P-REX2a是一種Rac鳥苷酸交換蛋白,可與PTEN直接結(jié)合并使其喪失脂質(zhì)磷酸酶活性,進(jìn)而導(dǎo)致PIP3的蓄積。在PI3K/Akt信號通路中,PI3K的活化將PIP2 轉(zhuǎn)化為PIP3,PIP3作為第二信使可將Akt進(jìn)行活化,最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖分化[8];而PTEN作為一個關(guān)鍵的負(fù)向調(diào)節(jié)因子,具有脂質(zhì)磷酸酶活性,可將PIP3去磷酸化為PIP2[7]。研究發(fā)現(xiàn),P-REX2a在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤中有高表達(dá)[8,10],因此,P-REX2a的表達(dá)可能促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖分化。由于95%以上的胃癌為胃腺癌,本次實(shí)驗(yàn)我們選擇中分化的胃腺癌細(xì)胞SGC7901進(jìn)行研究。本研究結(jié)果顯示,用siRNA沉默P-REX2a基因可以下調(diào)胃癌細(xì)胞SGC7901中P-REX2a mRNA并抑制細(xì)胞增殖,提示P-REX2a的表達(dá)促進(jìn)胃癌的增殖分化。

        PI3K/Akt信號通路在化療過程中常被激活而導(dǎo)致化療耐藥[2~5]。本課題組既往研究證實(shí),在胃腺癌細(xì)胞SGC7901中,應(yīng)用PI3K/Akt通路抑制劑與0.3 μmol/L阿霉素處理24 h時,可觀察到顯著的凋亡增加以及PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)的改變[11]。另外,在胃癌細(xì)胞中上調(diào)PTEN后,可抑制PI3K/Akt通路的異常激活,從而逆轉(zhuǎn)胃癌阿霉素的耐藥[12]。因此,P-REX2a參與PTEN/ PI3K/Akt通路的調(diào)節(jié),可能參與化療耐藥機(jī)制的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示,用siRNA沉默P-REX2a基因后再加入0.3 μmol/L阿霉素處理24 h,細(xì)胞凋亡率較NC組、NM組明顯升高,與此同時凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)升高,Bcl-2表達(dá)下降。這些結(jié)果表明P-REX2a可能通過調(diào)控Bcl-2、Bax表達(dá)影響細(xì)胞凋亡,進(jìn)而參與胃癌細(xì)胞的阿霉素耐藥。

        研究證實(shí),在無PTEN表達(dá)的細(xì)胞中導(dǎo)入PTEN基因后可減少Akt的活化;若僅有P-REX2a的表達(dá),Akt的活化水平基本不變,但同時高表達(dá)PTEN與P-REX2a時,則可檢測到Akt在S473與T308位點(diǎn)均被激活[8]。這表明P-REX2a調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路依賴于PTEN。本研究結(jié)果顯示,與NC、NM組相比,siRNA組細(xì)胞PTEN、Akt蛋白表達(dá)基本不變,而PTEN脂質(zhì)磷酸酶活性上升,p-Akt蛋白表達(dá)水平降低。提示在化療過程中沉默P-REX2a的表達(dá)可增強(qiáng)PTEN的脂質(zhì)磷酸酶活性,降低Akt的活化,從而提升化療效果。

        綜上所述,沉默P-REX2a可以抑制胃癌細(xì)胞SGC7901增殖,提高胃癌細(xì)胞SGC7901對阿霉素的敏感性。這可能是由于沉默P-REX2a可以提高PTEN磷酸酶活性、抑制PI3K/Akt通路活化、抑制Bcl-2表達(dá)、促進(jìn)Bax表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。未來我們可以通過抑制P-REX2a的表達(dá)或使其失活,在一定程度上提升阿霉素對胃癌的綜合化療效果。

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        EffectsofsilencingP-REX2aonproliferationandsensibilitytodoxorubicinofgastriccancercellsSGC7901

        ZHOUQiaohui,AIYaowei,PANZhihong,GUOMingwen

        (TheFirstPeople′sHospitalofYichang,ChinaThreeGorgesUniversity,Yichang443000,China)

        ObjectiveTo observe the effects of silencing P-REX2a on the proliferation and sensibility to doxorubicin of gastric cancer cells SGC7901 and to investigate its mechanism.MethodsSGC7901 cells were randomly divided into the normal group (NM group), negative control group (NC group), and interference group (siRNA group). The cells in the NM group were cultured as normal, the cells in the NC group were transfected with negative control sequences, and cells in the siRNA group were transfected with P-REX2a siRNA. We detected the mRNA of P-REX2a by real-time fluorescent quantitative PCR at 24 h after the transfection. MTT was used to observe cell proliferation in each group (OD570) at 24, 48, and 72 h after the transfection. Some other gastric cancer SGC7901 cells were divided into three groups as before, after 48-hour transfection, they were treated with 0.3 mol/L doxorubicin for 24 h, then we measured the apoptotic rate by using flow cytometry and detected the Bcl-2, Bax, phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 (PTEN), Akt, and p-Akt protein by using Western blotting. PTEN phosphatase activity detected by phosphorus PIP3 substrates-based colorimetric method.ResultsP-REX2a mRNA of the siRNA group was lower than that of NC group and NM group (P<0.05), but the OD570was higher than that of the NC group and NM group at 24, 48, and 72 h after the transfection (allP<0.05). After adding doxorubicin, the apoptosis rate was higher in the siRNA group than in the NC group and NM group (P<0.05); the Bax protein expression and phosphatase activity of PTEN was higher but the Bcl-2 and p-Akt protein expression was lower in the siRNA group than in the NC group and NM group (allP<0.05). No significant difference was found in the protein expression of PTEN and Akt between the three groups (bothP>0.05).ConclusionsSilencing P-REX2a can inhibit the proliferation and improve the sensitivity to adriamycin of gastric cancer SGC7901 cells. This may be due to that silencing P-REX2a can improve the phosphatase activity of PTEN, inhibit the activation of PI3K/Akt pathway and the expression of Bcl-2, promote the expression of Bax, and thus promote the apoptosis.

        gastric carcinoma; P-REX2a; gene silencing; siRNA; doxorubicin; phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 (PTEN)

        周巧輝(1989-),女,碩士,醫(yī)師,主要研究方向:消化道腫瘤的發(fā)病機(jī)制及治療。E-mail: zqh19890902@163.com

        艾耀偉(1971-),男,博士,主任醫(yī)師,主要研究方向:消化道腫瘤的發(fā)病機(jī)制及治療。E-mail: aiyw2001@sohu.com

        10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.005

        R735.2

        A

        1002-266X(2017)40-0018-04

        2016-04-10)

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