王宇光， 李海英

(黑龍江大學 a. 農(nóng)作物研究院; b．生命科學學院; c．黑龍江省普通高等學校分子生物學重點實驗室; d.農(nóng)業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150080)

甜菜BvBHLH92基因組織表達及亞細胞定位研究

王宇光a， 李海英b，c，d，*

(黑龍江大學 a. 農(nóng)作物研究院; b．生命科學學院; c．黑龍江省普通高等學校分子生物學重點實驗室; d.農(nóng)業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150080)

BHLH蛋白家族是一類含有BHLH結構域，并廣泛存在于植物中的一類重要轉(zhuǎn)錄因子。前期從甜菜中克隆得到了甜菜BvBHLH92基因，本研究對BvBHLH92基因的蛋白序列、組織表達及亞細胞定位進行分析。研究發(fā)現(xiàn)甜菜BvBHLH92蛋白包含225個氨基酸，并具有BHLH轉(zhuǎn)錄因子基因家族的典型功能結構域。同時，系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)BvBHLH92蛋白與甜菜BvBHLH93及擬南芥AtBHLH92親緣關系較近。組織特異性表達檢測表明BvBHLH92基因在甜菜花中表達量最高，而在根部位表達量最低，進一步研究發(fā)現(xiàn)BvBHLH92基因在甜菜根和葉部位響應鹽脅迫誘導表達。此外，亞細胞定位分析證明BvBHLH92蛋白定位在細胞核，推測BvBHLH92蛋白在細胞核中調(diào)控相關基因的表達，進而調(diào)節(jié)甜菜對鹽脅迫的響應變化。

BHLH; 轉(zhuǎn)錄因子；亞細胞定位；鹽脅迫

轉(zhuǎn)錄因子又稱反式作用因子，它是一類可結合在基因上游的啟動子區(qū)段，并調(diào)控目的基因轉(zhuǎn)錄表達的蛋白質(zhì)[1]。通常植物通過一系列的信號感知途徑，進行轉(zhuǎn)錄因子激活，促使轉(zhuǎn)錄因子與下游調(diào)控基因的順式作用元件相結合，調(diào)控目的基因在特異的組織部位以特定的強度進行表達。已報道的大約植物基因組中7%的序列可能參與編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白，而其中很大部分轉(zhuǎn)錄因子是植物響應非生物鹽脅迫的早期應答反應基因[2-5]。目前已報道的與植物鹽脅迫響應及耐鹽相關轉(zhuǎn)錄因子家族有BHLH、MYB、WRKY、bZIP及NAC類等[6]。

BHLH蛋白家族是一類含有BHLH結構域，并廣泛存在于植物中的一類重要轉(zhuǎn)錄因子。迄今已在不同植物物種中鑒定得到600余個BHLH轉(zhuǎn)錄因子，如在擬南芥和水稻中分別鑒定出162和167個BHLH轉(zhuǎn)錄因子[7-8]。已報道BHLH轉(zhuǎn)錄因子家族參與調(diào)控植物根毛形成、花青素積累、表皮發(fā)育及逆境響應等生物學過程[9-10]?，F(xiàn)今關于BHLH轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物鹽脅迫響應及耐鹽性的相關研究已有一些報道。如已報道番茄中的BHLH類轉(zhuǎn)錄因子SlICE1a鹽脅迫誘導表達，將該基因在番茄中過量表達，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株現(xiàn)體內(nèi)可溶性糖、脯氨酸和LEA蛋白含量增加，耐鹽性得到增強[11]。野生稻中克隆得到了兩個鹽脅迫誘導的BHLH類轉(zhuǎn)錄因子OrbHLH2和OrbHLH001，分別將其在擬南芥中過量表達發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫及滲透脅迫有較好抗性[12-14]。前期從甜菜中克隆得到了甜菜BvBHLH92基因，本研究對BvBHLH92基因的系統(tǒng)發(fā)育、組織表達以及亞細胞定位進行了分析，為進一步確定BvBHLH92基因的功能奠定了重要基礎。

1 實驗部分

1.1 BvBHLH92蛋白的序列分析

利用序列分析軟件DNAMAN及BIOEDIT對BvBHLH92的基因及蛋白序列進行分析，主要分析內(nèi)容為BvBHLH92蛋白的分子量、等電點。通過Genbank和SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫對BvBHLH92蛋白的功能結構域進行預測。

1.2 BvBHLH92蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

首先從Genbank、SWISS-PROT及UniProt數(shù)據(jù)中下載水稻、擬南芥及甜菜中相關的BHLH轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)序列，將下載后的蛋白序列數(shù)據(jù)進行統(tǒng)一搜集整理，并利用ClustalX軟件進行多重序列比對，剔除系統(tǒng)發(fā)育構建中的無關冗余序列。利用MEGA 4 ( Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件對多重序列比對的數(shù)據(jù)進一步分析，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹(Neighbor-Joining法)。

1.3 BvBHLH92基因的組織表達分析

利用TRIZOL(Invitrogen) 試劑提取甜菜根、莖、葉及花等部位的總RNA，并利用紫外分光光度計對提取的總RNA的濃度及吸光值進行測定。提取的總RNA質(zhì)檢合格后，利用TAKARA公司的試劑盒1 μL 總RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應及合成cDNA第一鏈，具體實驗操作過程見說明書。 熒光定量PCR主要利用BioRed公司熒光定量PCR儀及試劑進行熒光定量PCR反應，以甜菜18SRNA基因作為內(nèi)參，分析BvBHLH92基因在甜菜各組織部位的相對表達量進行分析。18S-s: 5′-TGACGGAGAATTAGGGTTCG-3′，18S-as: 5′-CCCCAATGGATCCTCGTTA-3′。

1.4 BvBHLH92基因響應鹽脅迫的組織表達分析

將培養(yǎng)15 d的甜菜 (BetaVulgaris) 幼苗進行300 mM NaCl 脅迫培養(yǎng)，實驗中添加的NaCl共分3d加入甜菜幼苗培養(yǎng)液中。分別在甜菜幼苗進行300 mM NaCl 處理0、1、2、3、4、5、6、7 d后，收獲甜菜幼苗的根及葉，并進行總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR反應，具體步驟同上。

1.5 BvBHLH92基因的亞細胞定位分析

將BvBHLH92基因cDNA編碼區(qū)序列構建到N端帶有RFP熒光蛋白的pCAMBIA1300載體上。同時，將構建好的pCAMBIA1300-BvBHLH92-RFP植物表達載體電轉(zhuǎn)化進入農(nóng)桿菌EHA105，鑒定得到陽性克隆。將陽性轉(zhuǎn)化pCAMBIA1300-BvBHLH92-RFP農(nóng)桿菌菌株，于28 ℃震蕩培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)的菌液在4 000 r/min的條件下，離心15 min進行集菌收集，棄上清，用煙草轉(zhuǎn)化液(ddH2O 98 mL，1M MES 1mL，1 M MgCl21 mL，0.2 M乙酰丁香酮 100 μL pH=5.6)重懸菌，在2 mL的離心管中加入1 mL的煙草轉(zhuǎn)化液，接一定量的菌體重懸于煙草轉(zhuǎn)化液中，使菌體OD600于0.7～1.0。將重懸的菌液在28 ℃條件下靜置培養(yǎng)2 h后，進行煙草注射。注射完成后，將煙草置于空盤中，并澆上適量的水，在溫室中恢復培養(yǎng)2～4 d后進行熒光觀察。

2 結果與討論

2.1 BvBHLH92基因及蛋白的序列分析

BvBHLH92基因組序列全長為3 013 bp，其編碼區(qū)的cDNA全長為678 bp，編碼225個氨基酸。對編碼蛋白進行序列分析預測BvBHLH92蛋白的分子量為25 135.5 Da，等電點為pI=8.70。通過蛋白結構域分析，發(fā)現(xiàn)BvBHLH92蛋白的49～102位氨基酸可形成Helix-loop-helix DNA-binding (HLH)結構域，該結構域是BHLH轉(zhuǎn)錄因子基因家族的典型功能結構域，其主要功能是參與結合下游基因啟動子上游的E-box/G-box順式作用原件。此外，79～129位氨基酸還可形成Basic leucine zipper 結構域 (bZIP)，該結構域主要參與蛋白二聚體的形成以及下游DNA的結合。 通過以上分析可以明確BvBHLH92蛋白含有BHLH轉(zhuǎn)錄因子基因家族的典型結構功能域，表明該基因可能具有調(diào)控甜菜相關基因表達的功能。

圖1 甜菜BvBHLH92的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of sugar beet BvBHLH92

2.2 BvBHLH92蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

為深入研究BvBHLH92蛋白的系統(tǒng)發(fā)育情況，構建了甜菜BvBHLH92蛋白及水稻和擬南芥其他BHLH轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖1)。發(fā)現(xiàn)甜菜BvBHLH92蛋白與甜菜BvBHLH93基因親緣關系最近。同時，BvBHLH92蛋白與擬南芥BHLH轉(zhuǎn)錄因子AtBHLH92同樣具有較近的親緣關系，表明該蛋白命名為BvBHLH92較為準確。此外，分析發(fā)現(xiàn)BvBHLH92、BvBHLH93及AtBHLH92單獨組成了一個clade，其中AtBHLH92基因被報道參與調(diào)控擬南芥的鹽脅迫響應變化，并且該基因在鹽脅迫下強烈誘導表達，因此推測BvBHLH92基因可能受到鹽脅迫誘導表達。

2.3 BvBHLH92基因的組織表達分析

圖2 BvBHLH92基因的組織表達分析Fig.2 Tissue location pattern of BvBHLH92

利用熒光定量PCR技術對BvBHLH92基因在甜菜根、莖、葉及花等組織部位的表達情況進行分析。研究發(fā)現(xiàn)BvBHLH92基因在甜菜花部位表達量最高，其次在甜菜葉中有一定量的表達，而在甜菜根和莖部表達量最低 (圖2)。BvBHLH92基因的表達情況與擬南芥AtBHLH92的表達情況較為相似，AtBHLH92基因在擬南芥的根部表達量最低，在花部位表達量最高。推測轉(zhuǎn)錄因子BvBHLH92參與調(diào)控花部位相關基因的表達，可能參與調(diào)控甜菜花部位響應鹽脅迫的生理響應變化。

2.4 BvBHLH92基因響應鹽脅迫的組織表達分析

為確定BvBHLH92基因是否與擬南芥AtBHLH92基因類似響應鹽脅迫誘導表達。采用熒光定量PCR技術分析BvBHLH92基因在鹽脅迫甜菜根和葉片中的表達情況(圖 3)。研究發(fā)現(xiàn)甜菜葉片鹽脅迫4 d后BvBHLH92表達量最高，而后隨著鹽脅迫時間的延長，BvBHLH92表達量逐漸降低(圖3(a))。然而甜菜根部鹽脅迫3 d后BvBHLH92基因的表達量最高(圖3(b))，以上結果表明甜菜根和葉片在鹽脅迫下BvBHLH92基因響應鹽脅迫的變化程度以及其響應時間均存在差異，推測在鹽脅迫下BvBHLH92基因在根和葉中行使的功能存在一定程度差異。

圖3 BvBHLH92基因鹽脅迫下表達變化分析Fig.3 Analysis of BvBHLH92 gene expression changes under salt stress

2.5 BvBHLH92基因的亞細胞定位分析

利用煙草瞬時表達體系發(fā)現(xiàn)BvBHLH92蛋白主要定位在細胞核(圖 4)，表明轉(zhuǎn)錄因子BvBHLH92蛋白的主要在細胞核中行使功能。目前報道的絕大多數(shù)BHLH類轉(zhuǎn)錄因子均定位在細胞核中，參與調(diào)控植物生長發(fā)育過程中的許多生命過程。推測BvBHLH92的主要功能是在細胞核中調(diào)控下游基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達，進而調(diào)控甜菜在鹽脅迫下的響應變化。

圖4 BvBHLH92蛋白的亞細胞定位分析Fig.4 Subcellular localization of BvBHLH92

3 結 論

1)BvBHLH92蛋白含有BHLH轉(zhuǎn)錄因子基因家族典型的HLH和bZIP結構域，屬于甜菜BHLH類轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。

2)BvBHLH92蛋白與甜菜及擬南芥BHLH類轉(zhuǎn)錄因子BvBHLH93及AtBHLH92親緣關系較近。

3)BvBHLH92基因在甜菜的花部位表達量較高，并且在甜菜的根和葉等部位響應鹽脅迫誘導表達，但BvBHLH92在甜菜根和葉部位的誘導表達在強度及時間上存在一定差異。

4)BvBHLH92蛋白主要定位在細胞核，這與BHLH類轉(zhuǎn)錄因子在細胞核中行使功能較為吻合，表明BvBHLH92在細胞核中參與調(diào)控下游基因表達。

[1] Williams C E， Grotewold E. Differences between plant and animal Myb domains are fundamental for DNA binding activity， and chimeric Myb domains have novel DNA binding specificities[J]. J Biol Chem， 1997， 272(1): 563-571.

[2] Udvardi M K， Kakar K， Wandrey M， et al. Legume transcription factors: global regulators of plant development and response to the environment[J]. Plant Physiol， 2007， 144(2): 538-549.

[3] Yamaguchi-Shinozaki K， Shinozaki K. Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses[J]. Annu Rev Plant Biol， 2006， 57: 781-803.

[4] Yu B， Li J， Koh J， et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of sugar beet monosomic addition line M14 in response to salt stress[J]. J Proteomics， 2016， 143:286-297.

[5] Li H， Pan Y， Zhang Y， et al. Salt stress response of membrane proteome of sugar beet monosomic addition line M14[J]. J Proteomics， 2015， 127(Pt A):18-33.

[6] Huang G T， Ma S L， Bai L P， et al. Signal transduction during cold， salt， and drought stresses in plants[J]. Mol Biol Rep， 2012， 39(2): 969-987.

[7] Bailey P C， Martin C， Toledo-Ortiz G， et al. Update on the basic helix-loop-helix transcription factor gene family in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell， 2003， 15(11): 2497-2502.

[8] Li X， Duan X， Jiang H， et al. Genome-wide analysis of basic helix-loop-helix transcription factor family in rice and Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2006， 141(4): 1167-1184.

[9] Zhao Q， Ren Y R， Wang Q J， et al. Ubiquitination-related MdBT scaffold proteins target a bHLH transcription factor for iron homeostasis[J]. Plant Physiol， 2016， 172(3): 1973-1988.

[10] Nakata M， Mitsuda N， Herde M， et al. A bHLH-type transcription factor， ABA-inducible BHLH-type transcriprion factor/JA associated MYC2-Lile1， acts as a repressor to negatively regulate jasmonate signaling in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2013， 25(5): 1641-1656.

[11] Feng H L， Ma N N， Meng X， et al. A novel tomato MYC-type ICE1-like transcription factor， SlICE1a， confers cold， osmotic and salt tolerance in transgenic tobacco[J]. Plant Physiol Biochem， 2013， 73: 309-320.

[12] Zhou J， Li F， Wang J L， et al. Basic helix- loop-helix transcription factor from wild rice (OrbHLH2) improves tolerance to salt-and osmotic stress in Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2009， 166(12): 1296-1306.

[13] Li F， Guo S， Zhao Y， et al. Overexpression of a homopeptide repeat-containing bHLH protein gene (OrbHLH001) from Dongxiang Wild Rice confers freezing and salt tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Cell Rep， 2010， 29: 977-986.

[14] Jiang D S，Li H Y，Yu B，et al.Expression analysis of BvM14-APX，BvM14-DHAR3 and BvM14-MDAR responsive to NaCl stress in sugar beet M14line[J].Journal of Engineering of Heilongjiang University，2016，7(2):64-71.

Sugar beet BvBHLH92 tissue expression and subcellular localization

WANG Yu-Guanga， LI Hai-Yingb，c，d，*

(HeilongjiangUniversitya.CropAcademy;b.CollegeofLifeSciences;c.KeyLaboratoryofMolecularBiology，CollegeofHeilongjiangProvince;d.EngineeringResearchCenterofAgriculturalMicrobiologyTechnology，Harbin150080，China)

TheBvBHLH92 gene was cloned from sugar beet. Meanwhile， the sequence， tissue expression and subcellular localization of the BvBHLH92 were analyzed. BvBHLH92 protein contains 225 amino acids and has a typical functional domain of BHLH transcription factor gene family. Furthermore， phylogenetic analysis showed that BvBHLH92 protein was close to BvBHLH93 and AtBHLH92， and tissue expression analysis indicated that the expression ofBvBHLH92 gene was highest in the flower， and the lowest expression in the root. At the same time，BvBHLH92 gene was induced by salt stress in sugar beet roots and leaves. Finally， we found that BvBHLH92 protein localized in the nucleus， suggesting that BvBHLH92 gene would regulate the related genes expression， and then participate in the regulation of salt stress response in sugar beet.

BHLH; transcription factor; subcellular localization；salt stress

10.13524/j.2095-008x.2017.03.040

Q943.2

A

2095-008X(2017)03-0045-05

2017-08-17

國家自然科學基金資助項目(31471552， 31701487)；黑龍江省自然科學基金資助項目(C2016048)

王宇光(1985-)，男，黑龍江齊齊哈爾人，助理研究員，博士，研究方向：植物分子生物學，E-mail：wangyuguang0920@hotmail.com;*

李海英(1968-)，女，黑龍江肇東人，教授，博士，博士研究生導師，研究方向：植物分子生物學， E-mail：lvzh3000@sina.com。