邸 銳，楊春燕

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，河北 石家莊 050035)

大豆(GlycinemaxL.) 是我國(guó)主要的糧食與油料作物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有不可替代的重要地位[1-2]。河北省常年種植大豆46.7萬(wàn)～53.3萬(wàn)hm2，是我國(guó)大豆生產(chǎn)大省[3]。因?yàn)榉柿稀⑥r(nóng)藥等投入不足，造成植株抗逆、抗病性差，產(chǎn)量不穩(wěn)定是當(dāng)前影響河北大豆生產(chǎn)的重要因素[4]。如何通過(guò)新技術(shù)方法提高大豆植株的抗逆性、增加大豆產(chǎn)量，是河北大豆生產(chǎn)研究的一個(gè)重要方面。

植物免疫誘抗劑能夠通過(guò)級(jí)聯(lián)放大作用調(diào)節(jié)植物的新陳代謝，增強(qiáng)植物抗病和抗逆能力，最終可以達(dá)到作物增產(chǎn)效果，同時(shí)可以減少農(nóng)藥的過(guò)度使用對(duì)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品帶來(lái)的污染。真菌激活蛋白(Activator protein)是新型的植物免疫誘抗劑，廣泛存在于真菌孢子和菌絲體中[5]，其代表產(chǎn)品是中國(guó)農(nóng)科院邱德文教授研發(fā)的“3%極細(xì)鏈格孢激活蛋白可濕性粉劑”、“普綠通植物免疫蛋白粉劑”等[6]。在蔬菜、糧食作物以及大田經(jīng)濟(jì)作物施用研究表明，激活蛋白不僅能夠通過(guò)誘導(dǎo)、激發(fā)、調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的一系列功能蛋白，啟動(dòng)植物防衛(wèi)反應(yīng)，激活植物的免疫系統(tǒng)，提高植物自身免疫力，而且通過(guò)調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)代謝系統(tǒng)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高作物產(chǎn)量和產(chǎn)品品質(zhì)[6-7]。

有關(guān)激活蛋白對(duì)大豆生長(zhǎng)發(fā)育研究較少。前人研究分析了激活蛋白處理大豆幼苗后對(duì)根系生理、葉片生理影響，證實(shí)了一定濃度的激活蛋白處理可增強(qiáng)大豆幼苗根系活力和硝酸還原酶活性，提高葉片葉綠素含量及可溶性糖、可溶性蛋白的含量[8]。由于光合作用是植物生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，闡明激活蛋白對(duì)植物光合特性的影響具有重要的理論和實(shí)踐意義。然而，有關(guān)激活蛋白對(duì)大豆光合特性以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響至今尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，以極細(xì)鏈格孢激活蛋白作為植物免疫誘抗劑，在受控環(huán)境下開(kāi)展了不同濃度植物激活蛋白對(duì)大豆光合特性、葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及產(chǎn)量的影響，探討激活蛋白在促進(jìn)大豆生長(zhǎng)發(fā)育、增加植株產(chǎn)量的生理功能基礎(chǔ)，以期為應(yīng)用激活蛋白實(shí)現(xiàn)大豆增產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理設(shè)置

大豆種子冀豆17由河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油所提供，挑選大小一致、形狀飽滿且均勻、無(wú)蟲(chóng)蛀或劣變發(fā)霉的種子，浸泡在80 mmol/L過(guò)氧化氫溶液中6 h進(jìn)行表面消毒，取出后用雙蒸水進(jìn)行沖洗，重復(fù)3～5遍[9]。然后將種子播于澆足水裝有清水洗凈后沙子的塑料花盆中，種植密度5苗/盆，然后將花盆移置于溫室中。溫室內(nèi)光源系統(tǒng)是由紅∶白=4∶1的LED提供，植物冠部光強(qiáng)為(500±50)μmol/(m2·s)光照周期為12 h(光)/12 h (暗)，溫度26 ℃(光)/22 ℃(暗)±1 ℃，相對(duì)濕度(55±10)%。每2 d每盆澆Hoagland營(yíng)養(yǎng)液500 mL，EC值和pH值分別為2.0 dS/m和 5.5[10]。

極細(xì)鏈格孢激活蛋白購(gòu)自北京中保綠農(nóng)科技集團(tuán)有限公司。先用蒸餾水將3%激活蛋白可濕性粉劑稀釋成1，2，3，4，5，6 μg/mL 6個(gè)濃度。在大豆開(kāi)花期時(shí)，分別用上述6個(gè)濃度的激活蛋白溶液噴霧處理，以同齡期噴清水(0 μg/mL的激活蛋白)處理為對(duì)照。在處理后的第7天進(jìn)行取樣，同時(shí)對(duì)大豆進(jìn)行光合特性與葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)量。在80 d后收獲大豆，測(cè)量不同處理組的總生物量以及大豆產(chǎn)量。

1.2 葉綠素含量測(cè)定

采用Arnon法測(cè)定葉綠素含量[11]。運(yùn)用紫外分光光度計(jì)(SP-752，上海光譜儀器有限公司，中國(guó))將葉綠素丙酮溶液在663，645，440 nm波長(zhǎng)下比色，所得的光密度(OD)值代入公式計(jì)算浸提液中葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)、葉綠素總量(Chla+b)以及類胡蘿卜素(Caro)含量的值。

1.3 光合特性測(cè)定

根據(jù)先前的文獻(xiàn)方法[12]，使用便攜式光合儀(LI-6400XT，LI-COR，USA)，環(huán)境 CO2濃度和光照強(qiáng)度均以培養(yǎng)條件設(shè)定為準(zhǔn)，在不同激活蛋白處理后的第7天上午10：00測(cè)定大豆第4片真葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間二氧化碳濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)等。

1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

使用LI-COR便攜式光合作用系統(tǒng)(LI-6400 XRT，LI-COR，USA)測(cè)量氣體交換的同時(shí)進(jìn)行葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量。所有葉綠素?zé)晒鈪?shù)均使用葉綠素?zé)晒鈽?biāo)準(zhǔn)葉室(m=2 cm2)完成測(cè)定，熒光測(cè)量前先將待測(cè)葉子暗適應(yīng)30 min。PS Ⅱ最大光化學(xué)量子效率(Optimal photochemical efficiency of PS Ⅱ，F(xiàn)v/Fm)是通過(guò)最大可變熒光(Fv)與暗條件下最大熒光(Fm)比值獲得。光系統(tǒng)Ⅱ潛在活性(Potential activity of PS Ⅱ，F(xiàn)v/Fo)是通過(guò)最大可變熒光(Fv)與暗條件下最小熒光(Fo)比值獲得。參考前人文獻(xiàn)所述方法計(jì)算獲得以下參數(shù)[13]：PS Ⅱ有效量子效率(Effective quantum yield of PS Ⅱ，ΦPSⅡ)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(Photochemistry quenching，qP)、非光化學(xué)猝滅系數(shù)(Nonphotochemistry quenching，NPQ)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每個(gè)處理重復(fù)3次，每次重復(fù)進(jìn)行3次平行測(cè)量。9次測(cè)量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差作為最終的結(jié)果，運(yùn)用Statistical Product and Service Solutions(SPSS 20.0)軟件分析，全部數(shù)據(jù)采用方差分析(ANOVA)P≤0.05，采用Turkey檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理對(duì)大豆光合色素含量的影響

光合作用是植物合成有機(jī)物的重要途徑，葉綠素a和葉綠素b是綠色植物光合作用的主要色素和輔助色素，它們含量高低可以反映植物光合能力的大小[14]。如圖1所示，隨著極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度的增加，葉綠素a、b與總量的變化均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，而且在3，4 μg/mL的激活蛋白濃度下，其值達(dá)到最大，與對(duì)照處理相比，葉綠素a、葉綠素b含量和葉綠素總量分別增加33%～40%，37%～39%和35%～40%。在施用較低濃度(1～2 μg/mL)的激活蛋白時(shí)，葉綠素a含量的增幅明顯大于葉綠素b含量(圖1-A、B)，這表明葉綠素a對(duì)極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度變化的響應(yīng)比葉綠素b更為敏感。當(dāng)施用極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度達(dá)到了6 μg/mL時(shí)，大豆的葉綠素含量迅速下降，極細(xì)鏈格孢激活蛋白對(duì)大豆葉綠素a、葉綠素b的含量促進(jìn)效果完全消失(圖1-A、B)。不同濃度的極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理下大豆胡蘿卜素含量變化很小，并不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，圖1-D)。

不同的字母表示不同處理間差異顯著，P<0.05。圖2-4同。Different letters are significantly different at P<0.05.The same as Fig.2-4.

2.2 不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理對(duì)大豆的光合特性影響

圖2表示的是不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理7 d后的大豆葉片光合特性參數(shù)的變化。從圖2-A 可以看出，隨著極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度的不斷升高，大豆光合速率(Pn)呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，大豆葉片噴灑極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度為1，2，3，4 μg/mL的 4個(gè)處理組，光合速率分別增加了13%，16%，52%，54%，而在使用濃度為5，6 μg/mL的2個(gè)處理組光合速率反而下降到對(duì)照水平甚至更低。各處理葉片的氣孔導(dǎo)度(Gs)變化與光合速率(Pn)基本相似，呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)(圖2-B)。施用3，4 μg/mL的極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理后大豆氣孔導(dǎo)度達(dá)到最高，比對(duì)照分別提高了30%和38%，這說(shuō)明合適濃度激活蛋白處理(2～4 μg/mL)明顯降低了大豆的葉片氣孔阻力，提高了氣孔導(dǎo)度。不同濃度激活蛋白處理后的大豆葉片胞間CO2濃度(Ci)的變化基本與光合速率(Pn)存在一定程度上相反的現(xiàn)象(圖2-C)。在3，4 μg/mL極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理組大豆光合速率達(dá)到最高，其Ci卻顯著降低了14%～20%。從圖2-D 可知，不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理后的大豆葉片蒸騰速率(Tr)的變化基本與氣孔導(dǎo)度(Gs)的變化類似，即隨著施用激活蛋白濃度的增加，呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明了大豆的蒸騰速率變化與氣孔導(dǎo)度有關(guān)。2～4 μg/mL的激活蛋白處理后大豆蒸騰速率有明顯的提高，與對(duì)照比分別增加13%，21%和25%。

圖2 不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理后的大豆葉片凈光合速率(A)、氣孔導(dǎo)度(B)、胞間CO2濃度(C)、蒸騰速率(D)Fig.2 Net photosynthetic rate (A)，stomatal conductance (B)，intercellular CO2 concentration (C) and transpiration rate (D) of soybean after spraying different concentrations of activator protein from Alternaria tenuissima

2.3 不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理對(duì)大豆葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

PS Ⅱ最大光化學(xué)量子效率(Fv/Fm)值越大，說(shuō)明PS Ⅱ反應(yīng)中心的能量捕捉效率越高[13]。PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率(ΦPS Ⅱ)值越高越有利于提高葉肉細(xì)胞的光合能力和植物的光合效率，為暗反應(yīng)的碳同化積累更多的能量[15]。如圖3-A、B所示，噴灑極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理組，大豆葉片的Fv/Fm和ΦPS Ⅱ值呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，3，4 μg/mL的激活蛋白處理組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其Fv/Fm和ΦPS Ⅱ值分別較對(duì)照提高了5.4%，28.0%以及5.6%，32.0%。而噴灑5，6 μg/mL的激活蛋白處理組與對(duì)照間不存在顯著性差異(P>0.05)。噴灑1，2 μg/mL激活蛋白處理效果介于3，4 μg/mL處理組與5，6 μg/mL處理組之間。光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)越大表明PS Ⅱ開(kāi)放的反應(yīng)中心所占比例越大，PSⅡ的電子傳遞活性越高；而非光化學(xué)猝滅系數(shù)(NPQ)越小，表明植物吸收的光能中以非輻射能量耗散越小[16-17]。如圖3-C、D所示，隨著施用極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度的提升，qP先升高后下降，而NPQ則是先下降后升高。qP與NPQ在中等濃度(3，4 μg/mL)的激活蛋白處理下分別達(dá)到最大值與最小值，與對(duì)照組之間的差異達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。施用低濃度(1，2 μg/mL)的激活蛋白也能提高qP，降低NPQ，但其效果明顯低于中等濃度的處理組。而施用高濃度(5，6 μg/mL)激活蛋白處理組其qP、NPQ與對(duì)照組之間不存在顯著性差異(P>0.05)。

圖3 不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理后的大豆葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fig.3 Chlorophyll fluorescence parameters of soybean after spraying different concentrations of activator protein from Alternaria tenuissima

2.4 不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理對(duì)大豆產(chǎn)量的影響

如圖4所示，與對(duì)照相比，噴施極細(xì)鏈格孢激活蛋白明顯增加了大豆的總生物量與大豆產(chǎn)量(以干質(zhì)量計(jì))。這說(shuō)明激活蛋白的施用確實(shí)促進(jìn)了大豆的生長(zhǎng)，有利于植株茁壯，最終提高了大豆種子的產(chǎn)量。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，不同的極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度對(duì)大豆的增產(chǎn)效果存在差異。與對(duì)照相比，大豆施用1～6 μg/mL的激活蛋白處理后的產(chǎn)量分別增加了6.89%，6.03%，11.21%，14.76%，4.83%以及3.43%(圖4-B)。這一結(jié)果也印證了本研究前面有關(guān)噴施極細(xì)鏈格孢激活蛋白對(duì)大豆光合特性、葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響的試驗(yàn)結(jié)果。

圖4 不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理組的大豆總生物量(A)與產(chǎn)量(B)Fig.4 Total biomass (A) and seed yield (B) of soybean after spraying different concentrations of activator protein from Alternaria tenuissima

3 討論與結(jié)論

隨著極細(xì)鏈格孢激活蛋白施用濃度的增加，大豆的葉綠素含量變化明顯，胡蘿卜素含量并不明顯。先前的研究已經(jīng)證明了施用多效唑、細(xì)胞分裂素等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可以增加葉綠素合成速率，降低葉綠素降解速率，在延緩葉片衰老以及生理功能方面發(fā)揮了重要作用[18-20]。本研究表明，施用具有抗病促生作用的極細(xì)鏈格孢激活蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)處理同樣可以有效地提高大豆的葉綠素含量。激活蛋白本身具有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的功能，能夠誘導(dǎo)影響細(xì)胞內(nèi)的激素平衡，從而調(diào)節(jié)生長(zhǎng)代謝，并在一定程度上延緩葉片的衰老和光合功能衰退，延長(zhǎng)葉片的光合功能期[21-22]。這可能是極細(xì)鏈格孢激活蛋白使用后大豆葉綠素提高的原因。武廣衍等[8]的研究表明，與對(duì)照組相比，當(dāng)施用2，5 μg/mL激活蛋白處理后大豆幼苗葉綠素含量分別增加了17.32%和5.32%，高濃度的激活蛋白處理反而降低了激活蛋白對(duì)葉綠素含量的增加效果。本試驗(yàn)結(jié)果再一次印證了這一觀點(diǎn)：在適當(dāng)濃度條件下，激活蛋白可以提高植物的葉綠素含量，增強(qiáng)其光合作用，濃度過(guò)高這種效果將消退。大多的研究結(jié)果表明，胡蘿卜素對(duì)外源誘導(dǎo)處理的響應(yīng)敏感程度低于葉綠素[23-25]。因此，大豆胡蘿卜素對(duì)激活蛋白低敏感度可能是造成其含量并未發(fā)生明顯變化的原因。

隨著施用的極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度的增加，大豆的光合特性出現(xiàn)了明顯的變化。大豆的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)的變化一致，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而胞間二氧化碳濃度(Ci)則是呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。由此我們可以發(fā)現(xiàn)，一定濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白不僅可以提高葉綠素的含量而且也可以增加葉片Gs，從而促進(jìn)了葉片Pn的上升。先前的研究表明，在有光暗周期下，Tr的上升與增大的Gs緊密相關(guān)，Tr隨氣孔開(kāi)度增大而線性增加[26]。本研究結(jié)果與先前有關(guān)Tr的變化主要受Gs的控制等結(jié)果一致。當(dāng)Pn提高時(shí)，葉肉細(xì)胞固定的CO2增多，從而造成了Ci 降低[27-28]。這種現(xiàn)象表明了施用一定濃度(3～4 μg/mL)激活蛋白對(duì)大豆積累有機(jī)物的能力產(chǎn)生了明顯的促進(jìn)作用，為大幅增產(chǎn)奠定了光合生理基礎(chǔ)。然而，隨著激活蛋白濃度的進(jìn)一步提高，則會(huì)減弱這種促進(jìn)效應(yīng)。這與先前的研究報(bào)道類似：隨激活蛋白濃度的增加，大豆幼苗的根系活力、硝酸還原酶活性、葉綠素含量等各生理指標(biāo)的活性或含量呈先上升后下降的趨勢(shì)[8]。但是，具有明顯拋物線式的光合作用調(diào)節(jié)效果背后的機(jī)理仍然需要進(jìn)一步的研究解析。

此外，隨著施用的極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度的增加，最大光化學(xué)量子效率(Fv/Fm)、有效量子效率(ΦPSⅡ)和光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)等葉綠素?zé)晒鈪?shù)指標(biāo)均呈先上升后下降的趨勢(shì)。其中以中濃度(3，4 μg/mL)的處理效果最好，這些結(jié)果表明，施用適當(dāng)濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白為大豆的生長(zhǎng)提供了非常好的生長(zhǎng)環(huán)境，降低了植株生長(zhǎng)的逆境脅迫壓力。這與施用與微生物肥料的效果類似[29]，有利于大豆的茁壯生長(zhǎng)，最終提高了大豆種子的產(chǎn)量。

總體上，在開(kāi)花期，噴灑3，4 μg/mL濃度的極細(xì)鏈格孢激活蛋白能夠顯著地促進(jìn)大豆光合特性與葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)，降低外界環(huán)境對(duì)大豆植株的光合生理脅迫，最終提高了大豆的產(chǎn)量，是一種促進(jìn)大豆增產(chǎn)的有效措施。