盧海亭，喬 軍，孟慶玲，彭葉龍，陳 誠，劉田莉，才學(xué)鵬，陳創(chuàng)夫

(1.石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.阿克蘇地區(qū)動物疫病控制診斷中心，新疆 阿克蘇 843000；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)屬于李斯特菌屬革蘭氏陽性無芽胞胞內(nèi)寄生菌，屬人獸共患的重要病原菌，人及動物感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜腦炎、流產(chǎn)和單核細(xì)胞增多等癥狀，引起較高的死亡率，是世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)規(guī)定的四大食源性致病菌之一[1-2]。

非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)能夠通過轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平調(diào)節(jié)細(xì)菌環(huán)境應(yīng)激及毒力相關(guān)基因表達(dá)以調(diào)節(jié)細(xì)菌眾多的生理代謝及致病過程。目前，研究表明革蘭氏陰性菌中大部分ncRNA發(fā)揮作用依賴于Hfq蛋白，該蛋白通過分子伴侶的方式參與大部分ncRNA對毒力基因及環(huán)境應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控過程。革蘭氏陽性菌中大部分ncRNA發(fā)揮作用時并不需要Hfq蛋白的參與，甚至在一些革蘭氏陽性菌中并不存在Hfq蛋白的同系物，這就表明在不同細(xì)菌中Hfq蛋白發(fā)揮作用的方式并不相同[3-6]。在LM中目前只鑒定到LhrA、LhrB、LhrC 3種可以與Hfq蛋白結(jié)合的ncRNA[7-8]，而其余眾多的ncRNA與Hfq蛋白的相互作用關(guān)系及Hfq蛋白在LM中發(fā)揮的具體作用及作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。因此，本試驗通過對LMhfq基因缺失株毒力、溶血活性、生物被膜生成能力的檢測，以期進(jìn)一步了解hfq基因在LM毒力及生物被膜生成中的作用。

1 材料和方法

1.1 菌株與試驗動物

單核細(xì)胞增生李斯特菌野毒株LM-SB5由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院動物疾病防控兵團(tuán)重點實驗室從發(fā)病綿羊體內(nèi)分離鑒定后保存；單核細(xì)胞增生李斯特菌hfq基因缺失株LM-Δhfq由本實驗室構(gòu)建保存；8周齡的昆明系小鼠由石河子大學(xué)實驗動物中心提供；綿羊全血采自石河子大學(xué)試驗站。

1.2 小鼠半數(shù)致死量LD50檢測

將LM-SB5及LM-Δhfq分別接種于BHI液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，當(dāng)OD600至0.6時，12 000 r/min離心2 min收集菌體，棄去上清后用PBS緩沖液將菌體清洗2遍，10倍梯度稀釋。將100只8周齡昆明系小鼠隨機(jī)平均分成2組，每組分為5個梯度，分別給每只小鼠腹腔注射0.5 mL不同稀釋梯度的菌液，觀察小鼠精神狀態(tài)及臨床癥狀，連續(xù)觀察7 d后統(tǒng)計各組小鼠死亡率，利用寇氏法計算LM-SB5及LM-Δhfq對小鼠的半數(shù)致死量LD50。

1.3 肝臟、脾臟載菌量及病理變化檢測

將8周齡昆明系小鼠隨機(jī)分成3組，通過腹腔注射亞致死劑量的LM-SB5及LM-Δhfq菌液各0.5 mL，同時設(shè)置對照組，對照組腹腔注射0.5 mL PBS緩沖液，以注射菌液當(dāng)天開始，計為t=0 d，每組分別在t=1～5 d各取1只小鼠摘取其肝、脾，加入1.0 mL PBS充分研磨，10倍梯度稀釋后吸取不同稀釋梯度的組織研磨液涂布于BHI平板固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h計數(shù)，每個稀釋梯度設(shè)置3個重復(fù)，最后以平均值作為肝、脾載菌量。在t=5 d時分別摘取3組小鼠的肝、脾、腎，經(jīng)4%甲醛溶液固定制備切片，HE染色后觀察其組織病理學(xué)變化。

1.4 溶血試驗

將LM-SB5及LM-Δhfq分別接于BHI液體培養(yǎng)基中于37 ℃條件下培養(yǎng)過夜，取1 mL菌液12 000 r/min離心5 min，取上清，用PBS緩沖液調(diào)整OD600至相同大小，取70 μL上清液用pH值6.0的PBS緩沖液倍比稀釋至2-8，加入30 μL 1% 紅細(xì)胞，觀察LM-SB5及LM-Δhfq溶解紅細(xì)胞情況，測定溶血效價。

1.5 hfq基因缺失對LM生物被膜生成能力的影響

將LM-SB5及LM-Δhfq菌液以1∶100的比例分別接于BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其OD600值達(dá)到0.2，吸取菌液200 μL加入到96孔微孔板中，每個樣品分2組，每組設(shè)置8個平行重復(fù)，將微孔板周圍封閉，靜置于37 ℃條件下分別培養(yǎng)24，48 h；棄去孔中的培養(yǎng)基，加入200 μL無菌蒸餾水洗滌3次，除去尚未形成生物被膜的浮游菌體，室溫干燥45 min，然后向每個孔中加入150 μL 1%的結(jié)晶紫溶液在室溫條件下染色30 min，棄去染色液，再用200 μL無菌蒸餾水洗滌微孔板4次，室溫條件下干燥30 min；再加入150 μL濃度為95%乙醇脫色30 min，用酶標(biāo)儀測定其OD570；將脫色后的微孔板直接放在倒置顯微鏡下觀察生物被膜的形態(tài)，選取最佳視野拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 LM-SB5及LM-Δhfq的LD50檢測結(jié)果

分別給小鼠腹腔注射LM-SB5和LM-Δhfq菌液后進(jìn)行觀察及LD50測定，在24 h后部分小鼠開始死亡，病理剖檢發(fā)現(xiàn)在2組小鼠中肝、脾明顯腫大，腸道黏膜脫落，部分腸道充血和出血，未死亡的小鼠出現(xiàn)結(jié)膜炎、消瘦、被毛雜亂等癥狀。觀察7 d后統(tǒng)計死亡率，根據(jù)寇氏法計算得到LM-SB5和LM-Δhfq對小鼠的LD50分別為105.560，106.343cfu(表1)，LM-Δhfq的LD50升高了6.067倍，說明了hfq基因缺失引起LM毒力顯著下降(P<0.05)，表明hfq基因?qū)M的毒力具有重要調(diào)控作用。

表1 LM-SB5與LM-Δhfq的LD50測定結(jié)果Tab.1 LD50 measurement results of LM-SB5 and LM-Δhfq

注：半數(shù)致死量LD50數(shù)值后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Values of 50% lethal dose with different small letters means the differences is significant.

2.2 小鼠肝臟、脾臟載菌量檢測結(jié)果

對2組小鼠肝、脾的細(xì)菌進(jìn)行平板計數(shù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第1天肝、脾載菌量差異不顯著(P>0.05)；在第2～5天，注射LM-SB5的小鼠肝、脾載菌量要顯著高于注射LM-Δhfq的小鼠肝、脾載菌量(P<0.05)，第3天差異極顯著(P<0.01)(圖1)；表明LM-Δhfq在宿主體內(nèi)生存增殖能力弱于LM-SB5，即hfq基因能夠在一定程度上影響LM在宿主體內(nèi)的生存增殖。

2.3 小鼠肝、脾、腎病理變化

與正常的小鼠肝、脾、腎(圖2-A～C)形態(tài)相比，LM-SB5及LM-Δhfq均可引起小鼠肝、脾、腎產(chǎn)生一定的病理變化，LM-SB5感染的肝臟切片有明顯的壞死灶，內(nèi)有藍(lán)染壞死的肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞，有的只留下細(xì)胞輪廓，肝細(xì)胞溶解壞死，組織結(jié)構(gòu)消失，含有大量的組織碎片，出現(xiàn)網(wǎng)狀絲狀結(jié)構(gòu)(圖2-D)；脾臟中脾小結(jié)體積增大，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)松散,有明顯的壞死灶，淋巴小結(jié)部位淋巴細(xì)胞壞死，淋巴組織出血(圖2-E)；腎臟中腎小球腫脹，腎小球內(nèi)細(xì)胞增多充血、出血，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生顆粒變性、壞死，部分腎小管間質(zhì)有大量的紅細(xì)胞(圖2-F)。LM-Δhfq感染的肝臟切片有的區(qū)域輕微肝淤血，肝索排列疏松，同樣有炎性細(xì)胞及壞死的肝臟細(xì)胞(圖2-G)；脾臟中有明顯的壞死灶，淋巴小結(jié)部位淋巴細(xì)胞壞死，淋巴組織出血(圖2-H)；腎臟有明顯的顆粒樣變性，腎小球充血、出血(圖2-I)。表明hfq基因缺失后LM對小鼠組織器官的損傷能力也有所減弱。

A.肝臟細(xì)菌計數(shù)結(jié)果；B.脾臟細(xì)菌計數(shù)結(jié)果；*.差異顯著；**.差異極顯著。圖4同。A.Bacterial count in the livers；B.Bacterial count in the spleens；*.The differences is significant；**.The differnces is extremely significant.The same as Tab.4.

A～C.正常肝、脾、腎；D～F.腹腔注射LM-SB5肝、脾、腎病理變化；G～I(xiàn).腹腔注射LM-Δhfq肝、脾、腎病理變化。A-C.The histopathological slices of the normal liver，spleen，and kidney；D-F.Histopathological changes in the liver， the spleen， and the kidney of mice injected with LM-SB5；G-I.Histopathological changes in the liver，the spleen，and the kidney of mice injected with LM-Δhfq.

2.4 溶血活性檢測結(jié)果

通過溶血試驗檢測LM-SB5及LM-Δhfq溶血活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LM-SB5的溶血效價為2-3，LM-Δhfq的溶血效價為2-2，其溶血能力下降了2倍。表明hfq基因?qū)M溶血能力具有一定的調(diào)節(jié)能力(圖3)。

圖3 LM-SB5 與 LM-Δhfq溶血活性測定Fig.3 Hemolysis activity assay of LM-SB5 and LM-Δhfq

2.5 hfq基因缺失對生物被膜生成能力的影響

在24 h時，LM-SB5和LM-Δhfq生物被膜生成能力差異顯著(P<0.05)，LM-Δhfq生物被膜生成能力顯著低于LM-SB5(圖4)；而在48 h時二者的生物被膜生成能力差異不顯著(P>0.05)。倒置顯微鏡觀察在24，48 h時LM-SB5與LM-Δhfq都生成了典型的生物被膜形態(tài)，在24 h LM-Δhfq生物被膜厚度明顯低于LM-SB5(圖5)。

圖4 生物被膜OD570檢測結(jié)果Fig.4 Biofilm determined by OD570

A與B.LM-SB5分別在24，48 h形成的生物被膜；C與D.LM-Δhfq分別在24，48 h形成的生物被膜。A and B.Formation of biofilm by LM-SB5 at 24，48 h；C and D.Formation of biofilm by LM-Δhfq at 24，48 h.

3 討論

LM作為WHO規(guī)定的四大食源性致病菌之一，通過污染飲水、食品、飼草料而引起人與動物食物中毒，對人類健康構(gòu)成了極大威脅，也給畜牧業(yè)發(fā)展帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。此外，LM還能夠產(chǎn)生生物被膜，生物被膜是細(xì)菌通過分泌胞外基質(zhì)粘附于生物或非生物表面形成具有一定立體結(jié)構(gòu)的微生物聚集群體，形成生物被膜的菌體在胞外基質(zhì)的保護(hù)下能夠阻止減緩抗菌藥物及殺菌物質(zhì)的滲透，從而使細(xì)菌有足夠的時間調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，以調(diào)節(jié)其對脅迫環(huán)境的應(yīng)激能力及動物機(jī)體致病力。由于產(chǎn)生生物被膜的細(xì)菌對抗菌藥物更不敏感，在臨床上通常會導(dǎo)致一些疾病呈現(xiàn)持續(xù)性感染發(fā)作[9]。

隨著生物信息學(xué)發(fā)展以及對微生物基因組整體水平研究不斷深入，LM成為研究革蘭氏陽性菌Hfq蛋白以及ncRNA的模式細(xì)菌。Hfq是一種熱穩(wěn)定蛋白調(diào)控因子，其分子量大小和功能在不同細(xì)菌中有所不同[10-12]。對革蘭氏陰性菌Hfq蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究比較深入，并已證實該蛋白是一種重要的環(huán)境應(yīng)激和毒力調(diào)控因子，然而對革蘭氏陽性菌Hfq蛋白研究相對較少，其主要作為ncRNA的分子伴侶發(fā)揮作用。ncRNA按照作用機(jī)制可以分為反義RNA(anti-sense RNA，asRNA)，順式作用RNA(Cis-acting RNA)和反式編碼小RNA(Trans-encoded small RNA，sRNA)，在革蘭氏陰性菌中Hfq蛋白作為大部分sRNA的分子伴侶發(fā)揮作用，能夠通過影響sRNA與目的mRNA的結(jié)合，進(jìn)而影響基因的表達(dá)。而在革蘭氏陽性菌中只有少量sRNA與Hfq蛋白發(fā)生互作，在LM中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的200多種sRNA，通過免疫共沉淀鑒定只得到3種sRNA可以與Hfq蛋白發(fā)生互作。眾多的研究表明，Hfq蛋白在不同細(xì)菌中具有不同的作用，在同種細(xì)菌中參與不同sRNA調(diào)控細(xì)菌基因表達(dá)過程中的作用方式也有所區(qū)別[13-16]。

Christiansen等[17]研究表明，Hfq蛋白參與了LM對高滲及乙醇環(huán)境壓力的應(yīng)激過程和對小鼠的致病性。本研究通過動物感染試驗證實hfq基因缺失引起LM對小鼠的毒力、肝脾中的生存增殖能力、溶血能力顯著減弱，表明hfq基因缺失能夠?qū)е翷M毒力相關(guān)生物學(xué)特性的降低。同時通過結(jié)晶紫染色的方法制備了生物被膜，結(jié)果顯示在24 h時生物被膜的生成量顯著降低，而在48 h時生物被膜的生成量沒有顯著差異。Huang等[18]通過插入失活的方式發(fā)現(xiàn)gltB、gltC基因的缺失是引起LM生成量顯著降低的主要原因。Peng 等[19]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在缺失sRNArli60基因時，LM的生物被膜生成量顯著降低，且rli60基因缺失引起生物被膜生成相關(guān)基因gltB、gltC的表達(dá)量顯著下降。Zhou等[20]研究發(fā)現(xiàn)PrfA基因缺失引起LM生物被膜生成能力顯著降低。表明生物被膜的生成能力受到自身眾多基因的調(diào)控作用。目前的研究發(fā)現(xiàn)與生物被膜生成相關(guān)的因素眾多：外在因素包括附著面的理化性質(zhì)、溫度、培養(yǎng)基pH、金屬離子等，內(nèi)在因素主要包括眾多基因表達(dá)的開啟及關(guān)閉[9，20]。通過缺失hfq基因LM生物被膜的生成量顯著降低，表明LM生物被膜的生成在一定程度上直接或間接受到hfq基因表達(dá)的影響。但是生成生物被膜的細(xì)菌只是具有了對外界脅迫環(huán)境更強(qiáng)的適應(yīng)能力而存活下來，進(jìn)而具備了感染宿主的先決條件。而處于生物被膜狀態(tài)下的細(xì)菌突破機(jī)體免疫系統(tǒng)的能力及致病能力是否得到相同程度的提高，即本研究中hfq基因缺失引起LM毒力及生物被膜生成能力的同時降低，這二者之間是否具有對應(yīng)的因果關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。總之，本研究表明hfq基因缺失對LM的毒力及生物被膜生成具有一定的調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步開展針對Hfq蛋白調(diào)控機(jī)理的研究奠定了理論基礎(chǔ)。