陳敬祥，劉琪司，林 同

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510640)

松墨天牛(Monochamusalternatus)，又名松天牛、松褐天牛，鞘翅目( Coleoptera)，天?？? Cerambycidae)，墨天牛屬(Monochamus)，是林業(yè)上重要的蛀干害蟲，能危害多種松樹，幼蟲鉆蛀樹干和大枝條，取食其韌皮部與木質(zhì)部，同時(shí)其成蟲體內(nèi)能攜帶成千上萬的松材線蟲，這些松材線蟲對松樹能產(chǎn)生極其嚴(yán)重的病害—松材線蟲病，嚴(yán)重影響生態(tài)與經(jīng)濟(jì)[1-2]。

Hox基因，即同源異形盒基因(Homeoboxgene)，是生物發(fā)育調(diào)控基因中的一個古老的基因簇[3-4]。在生物體的體軸建立、胚胎發(fā)生、器官組織發(fā)育方面起著決定性的作用[5-7]。在Hox基因中都包含有一個保守的Hox功能結(jié)構(gòu)域，主要功能是與DNA相結(jié)合[8]。Homothorax基因(Hth)，是在對果蠅Hox基因的輔因子extradenticle研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的另一種輔因子[9-10]。作為Hox基因的輔因子，該基因同樣也包含Hox保守功能域，在對果蠅Hth的研究中，發(fā)現(xiàn)該基因在胚胎及成蟲發(fā)育中扮演重要的角色[11-12]。Hth是許多組織器官正常發(fā)育所必需的，是觸角發(fā)育的決定因子[13]，調(diào)控足與翅的末端形成[14-15]，對于眼睛發(fā)育具有一定的負(fù)調(diào)控作用[16]；在許多發(fā)育的進(jìn)程中，參與轉(zhuǎn)錄的激活[17-18]，既可以激活靶標(biāo)基因又可以抑制靶標(biāo)基因[19]，在許多細(xì)胞類型中表達(dá)、變異會對在胚胎及成蟲的發(fā)育具有巨大的影響，這也因此證實(shí)了Hth調(diào)控許多靶標(biāo)基因，比如激活誘導(dǎo)蛻皮激素相關(guān)的靶基因[20]。

松墨天牛生長發(fā)育都離不開Hox基因的調(diào)控，筆者推測，Hth基因作為Hox基因的輔因子，在松墨天牛生理活動中發(fā)揮重要作用。本研究克隆到了Homothorax基因，首次對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及表達(dá)分析，以期為闡明該基因在對松墨天牛生長發(fā)育中的調(diào)控作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試?yán)ハx 松墨天牛幼蟲由江蘇林科院饋贈，用人工飼料在避光的人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)至蛹、成蟲，飼養(yǎng)溫度為25 ℃，相對濕度為70%～ 75%。

1.1.2 主要試劑 E.Z.N.A.TMTotal RNA Kit Ⅱ總 RNA提取試劑盒購自 OMEGA公司，PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTM實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購自 TaKaRa 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理、RNA的提取及 cDNA的合成 選取20頭2日齡成蟲、30頭3齡幼蟲進(jìn)行清洗、消毒、麻醉后，解剖并獲取成蟲觸角、頭(去觸角)、前胸、具翅胸節(jié)、足、鞘翅、馬氏管、中腸、卵巢，幼蟲脂肪體、馬氏管、頭、體壁，用磷酸鹽緩沖液沖洗后，將樣本分別置于無菌去酶的EP管中，立即液氮冷凍，放入-70 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

用E.Z.N.ATMTotal RNA Kit Ⅱ總RNA提取試劑盒提取總RNA，具體操作按該試劑盒提供提取說明書進(jìn)行。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳與微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)檢測合格后置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩０碢rimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供說明書操作合成第一鏈cDNA，用于RT-qPCR的反應(yīng)模板，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因克隆 已構(gòu)建好的松墨天牛cDNA文庫中克隆出Homothorax基因完整編碼序列[21]。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 用 NCBI 在線工具 ORF finder(http；//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html )搜索開放閱讀框，ProtScale 程序分析疏水性，SignalP 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Signalp/ )預(yù)測信號肽，NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ )預(yù)測磷酸化修飾位點(diǎn)，Ne-tNGlye軟件分析N-糖基化修飾(http://www.cbs.dtu.dk/ser-vices/NetNGlyc/)，亞細(xì)胞定位( http://ipsort.hgc.ip/)，TMHMM 分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMH-MM/)，SMART 軟件(http://smart.embl-heidel berg.de/)分析蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域，COILS Server(http://embnet.vital-it.ch/software/COILS form.html)預(yù)測卷曲螺旋，SOPMA 軟件( http：// npsa-pbil.ibcp. fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，SWISSMODEL 軟件(http://beta.swiss-model.expasy.o-rg/)預(yù)測三級結(jié)構(gòu)和同源建模。從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索昆蟲Hth基因編碼序列，并下載昆蟲的Hth基因編碼序列(表1)，用于多序列同源性比對(DNAMAN軟件)，系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ法)用Clustal X和MEGA 4.0軟件構(gòu)建。

1.2.4 基因表達(dá) 用RT-qPCR( SYBR Green) 檢測基因的表達(dá)量。所用引物：上游：5′-CGGACTCAACATCACACAC-3′；下游：5′-GGACACCACTTGCCCATAG-3′。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性 5 min； 95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s， 進(jìn)行40 個循環(huán)。在LightCycler480 熒光定量 PCR 儀上進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，每個試驗(yàn)樣品設(shè) 3 次重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后采集目標(biāo)基因的 Ct 值和內(nèi)參基因(β-actin)的 Ct 平均值，采用 2-ΔΔCt相對定量法計(jì)算相對表達(dá)量。用 SPSS 18.0 軟件的 Duncan′s單因素方差分析法(ANOVA)對熒光定量所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列及其編碼氨基酸序列分析

從松墨天牛cDNA文庫中篩選一條具有完整 ORF 的序列，在 NCBI 的核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast 程序同源性比對，鑒定為松墨天牛Homothorax基因， 命名為MaHth(GenBank：KX364396 )，其開放閱讀框長度為1 347 bp，共編碼 448個氨基酸(圖1)，推測的編碼蛋白分子量為 48.99 kDa， 等電點(diǎn)pI為 4.66，不穩(wěn)定系數(shù)為53.82，脂肪系數(shù)為62.75。用ProtScale對蛋白進(jìn)行疏水性分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白氨基酸大部分為親水性的，說明此蛋白為親水蛋白。信號肽預(yù)測結(jié)果表明該蛋白無信號肽；跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明該蛋白為跨膜蛋白，有1個由外到內(nèi)、2個從內(nèi)到外的螺旋結(jié)構(gòu)；磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果為：有絲氨酸磷酸化位點(diǎn)22個，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)4個，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)4個， N-糖基化修飾位點(diǎn)1個。預(yù)測其存在2個獨(dú)立的核定位信息：KRDK、KKNQKKR。

表1 參與Hth氨基酸序列比對的16種昆蟲

2.2 功能結(jié)構(gòu)域及其亞細(xì)胞定位

通過SMART軟件對MaHth蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析，該蛋白有2個低復(fù)雜度區(qū)域(Low complexity regions，LCRs)，即TDARAATDAARR(284-295位)和GEGTGEEDDDT(318-328位)，在333-398位氨基酸處為Hox結(jié)構(gòu)域(圖2)。通過PSORT軟件在線預(yù)測MaHth蛋白在細(xì)胞中的位置，結(jié)果表明，定位在細(xì)胞核的可能性最大，為97%，據(jù)此推測MaHth蛋白定位于細(xì)胞核中。

LCR1與LCR2分別表示2個低復(fù)雜度區(qū)域。

2.3 二級和三級結(jié)構(gòu)

由軟件SOPMA對MaHth蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示該蛋白的二級結(jié)構(gòu)由α螺旋、無規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角與延伸鏈組成，分別占28.12%，50.22%，11.16%，10.49%。由此可推測MaHth蛋白的主要二級結(jié)構(gòu)元件為α螺旋和無規(guī)則卷曲。運(yùn)用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模，結(jié)果同樣顯示此基因編碼蛋白主要由α螺旋與無規(guī)則卷曲組成，該預(yù)測結(jié)果與其二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果一致。由預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)可知，MaHth蛋白有3個螺旋，被2個β轉(zhuǎn)角相連，構(gòu)成以α螺旋-β轉(zhuǎn)角-α螺旋為基元的結(jié)構(gòu)(圖3)。

圖中1、2、3表示3個α螺旋；N、C表示蛋白N端與C端。

2.4 同源序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹

MaHth與赤擬谷盜Hth蛋白同源性最高，為97%；與地中海實(shí)蠅、黑腹果蠅、銅綠蠅、家蠅4種雙翅目昆蟲同源性在70%～80%；與柑橘鳳蝶等10種昆蟲同源性在80%～90%(圖4)。基于MEGA 4.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示：松墨天牛與赤擬谷盜處于同一分支，與同源性分析的結(jié)果一致(圖5)。

圖4 MaHth與15種昆蟲Hth氨基酸序列同源性比對

圖5 基于昆蟲Hth氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 MaHth基因的表達(dá)

MaHth基因在松墨天牛各蟲態(tài)、組織、部位中廣泛表達(dá)。在卵中表達(dá)量最高，成蟲表達(dá)量最低，幼蟲與蛹的表達(dá)量分別為卵的0.76，0.95倍，卵與幼蟲、成蟲之間基因表達(dá)差異顯著(P<0.05)，與蛹表達(dá)差異不顯著(P>0.05)(圖6)。幼蟲各組織中，MaHth在頭部表達(dá)量最高，為對照表達(dá)量的13倍，體壁次之，為對照的3.18倍，脂肪體、馬氏管的表達(dá)量分別是對照的1.88，0.91倍，幼蟲各組織之間MaHth基因表達(dá)均有顯著差異(P<0.05)(圖7)。在成蟲中，MaHth在馬氏管與頭中表達(dá)量相對較高，分別為對照的2.87，2.75倍，兩者差異不顯著(P>0.05)，在足、翅、觸角中的表達(dá)量低于對照，分別為對照的0.74，0.19，0.07倍，三者表現(xiàn)差異顯著(P<0.05)，在前胸、具翅胸、中腸、卵巢中的表達(dá)量分別是對照的1.1，1.32，1.72，1.41倍(圖8)。

圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)；圖7-8同。Data in the figure are represented as mean±SE；Different letters meansignificant difference on the bar(P<0.05)；The same as Fig.7-8.

圖7 MaHth基因在松墨天牛幼蟲中的表達(dá)

圖8 MaHth基因在松墨天牛成蟲中的表達(dá)

3 討論

Hox基因?qū)儆谕串愋秃屑易宄蓡T之一，在大多數(shù)Hox基因中，會包含一段約180個核苷酸的同源異型盒，可以轉(zhuǎn)錄出約60個氨基酸序列，稱為Hox保守區(qū)段[22]。Hth是Hox基因輔因子之一，屬于Meis家族，該家族也有大概60個氨基酸序列的Hox保守區(qū)。本研究發(fā)現(xiàn)，16種昆蟲Hth蛋白都有相同序列的Hox保守結(jié)構(gòu)域，即66個氨基酸序列的同源異型盒，且在Hox結(jié)構(gòu)域里有3個螺旋，在第一個螺旋與第2個螺旋之間有proline(P)-tryosin(Y)-tryosin(P)3個氨基酸延伸環(huán)[23]；通過MaHth蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，MaHth也是由3個螺旋構(gòu)成，在第1個與第2個螺旋中也找到了該延伸環(huán)。因此，MaHth屬于Meis家族成員。

在大部分真核生物蛋白中會存在低復(fù)雜度區(qū)域(Low-complexity regions，LCRs)[24-26]，低復(fù)雜度區(qū)域包含單個氨基酸或者是一段短的氨基酸重復(fù)[27]，許多LCRs是高度不穩(wěn)定的，或丟掉，或重組[28]。在本研究中，MaHth蛋白有2個LCRs，分別位于284-295位氨基酸(TDARAATDAARR)和318-328位氨基酸(GEGTGEEDDDT)，它們的存在可能會促進(jìn)自身表型的變化來適應(yīng)環(huán)境的變化[29]，同時(shí)也可能會促進(jìn)新蛋白序列的形成[27]。

蛋白質(zhì)經(jīng)折疊、修飾、組裝成熟后必須要分揀到特定的細(xì)胞部位才能真正發(fā)揮其特有的生物學(xué)功能，其亞細(xì)胞定位信息會暗示蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能[30]。Jaw等[31]認(rèn)為在Hth蛋白序列中可能存在2個獨(dú)立的核定位信號：KRDK、KKNQKKR。我們的研究發(fā)現(xiàn)MaHth蛋白同樣含有這2個獨(dú)立的核定位信號，分別定位于73-76位氨基酸，331-337位氨基酸，由此我們認(rèn)為MaHth蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)。研究核定位信號一方面可以幫助揭示新的大分子物質(zhì)核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，另一方面也有助于發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)的新功能[32]。

松墨天牛MaHth在卵、蛹中的表達(dá)量高于幼蟲、成蟲，推測MaHth與胚胎期、蛹期中器官組織形成與分化有關(guān)；在幼蟲中，MaHth頭部表達(dá)量最高，為對照的13倍，體壁為對照的3.18倍，推測MaHth與松墨天牛頭部生長、體壁的生成相關(guān)；在成蟲中，MaHth在馬氏管中表達(dá)量最高，為對照的2.87倍，而在幼蟲體內(nèi)馬氏管的表達(dá)量相對較低，可能由于在蛹期里馬氏管不斷進(jìn)行更新改造[30]，所以推測該基因與馬氏管的發(fā)育有一定關(guān)系。在松墨天牛的一些附肢，如足、翅、觸角，MaHth表達(dá)量相對較低，而在其他一些昆蟲體內(nèi)證實(shí)，作為Hox基因輔助因子的Hth基因與足的近端、翅、觸角[13-15]的發(fā)育也相關(guān)，但是本研究對這些附肢的基因表達(dá)分析，并沒有得到在這些部位大量表達(dá)的結(jié)果，可能相比于成蟲，MaHth基因?qū)β雅c蛹期的調(diào)控作用更加明顯，MaHth基因?qū)@些附肢的調(diào)控作用主要可能作用于蛹。