鄭媛媛，丁國芳,2,*，楊最素，余方苗，賈盈露，吳宗澤，陳 銳

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品重點(diǎn)工程技術(shù)研究中心，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021）

雙齒圍沙蠶抗凝血肽的制備及其抗血栓作用

鄭媛媛1，丁國芳1,2,*，楊最素1，余方苗1，賈盈露1，吳宗澤1，陳 銳1

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品重點(diǎn)工程技術(shù)研究中心，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021）

目的：探討雙齒圍沙蠶抗凝血肽（anticoagulant peptides from Perinereis aibuhitensis，PAAP）的制備及其抗血栓作用。方法：以抗凝活力為檢測指標(biāo)，篩選最佳酶對沙蠶進(jìn)行酶解。酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾、陰離子交換層析、凝膠過濾層析和反相高效液相色譜法分離純化，得到具有最強(qiáng)抗凝活力的沙蠶寡肽，將此肽命名為PAAP并測定其急性毒性作用。采用角叉菜膠所致的小鼠尾部血栓形成實(shí)驗(yàn)、三氯化鐵所致的大鼠動(dòng)脈血栓形成實(shí)驗(yàn)及二磷酸腺苷（adenonisine disphosphate，ADP）誘導(dǎo)的血小板聚集實(shí)驗(yàn)，研究PAAP的抗血栓作用。結(jié)果：選取堿性蛋白酶作為最佳酶對沙蠶進(jìn)行酶解，經(jīng)過分離純化后得到一條氨基酸序列：脯氨酸-纈氨酸-谷氨酸-精氨酸-賴氨酸（Pro-Val-Glu-Arg-Lys）。經(jīng)測定，該寡肽的體外抗凝活力可達(dá)（1 320.0±20.3）U/g。PAAP的最大耐受量為11.0 g/（kg·d）且未出現(xiàn)小鼠異常及死亡現(xiàn)象，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明PAAP對小鼠尾部血栓的形成、大鼠動(dòng)脈血栓的形成及ADP誘導(dǎo)的血小板聚集均有明顯抑制作用。結(jié)論：從雙齒圍沙蠶中提取出的抗凝肽PAAP具有抗血栓作用。

雙齒圍沙蠶；抗凝血肽；堿性蛋白酶；分離純化；抗血栓

血栓形成是缺血性心臟病、缺血性中風(fēng)及靜脈栓塞常見的病理學(xué)基礎(chǔ)，嚴(yán)重危害人類健康且近年來還有漸增之勢[1-3]。抑制血小板的聚集與釋放、抑制凝血酶系統(tǒng)、激活抗凝血酶及纖溶酶系統(tǒng)均可抑制血栓的形成[4]。雙齒圍沙蠶（Perinereis aibuhitensis）隸屬于動(dòng)物界、環(huán)節(jié)動(dòng)物門、多毛綱、游行多毛目、沙蠶科，俗稱海蜈蚣，與陸地生物蚯蚓具有很近的親緣關(guān)系。從蚯蚓體內(nèi)獲得的蚯激酶已被證明能夠有效溶解血栓，改善微循環(huán)，加強(qiáng)心、腦血管側(cè)支循環(huán)，蚯激酶的成功開發(fā)使科研工作者將目光轉(zhuǎn)向沙蠶[5]。國內(nèi)外學(xué)者先后從沙蠶中提取出具有溶栓活性的絲氨酸類纖溶酶[6]，但通過酶解的方法從沙蠶體內(nèi)提取抗凝成分以抑制體內(nèi)血栓，鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從舟山朱家尖地區(qū)的雙齒圍沙蠶中分離純化獲得具有抗凝活力的沙蠶寡肽，并探討其對實(shí)驗(yàn)性血栓形成及血小板聚集率的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

健康雄性清潔級(jí)ICR小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，年齡4～5 周；健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量（140±10）g，年齡4～5 周，購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001。

雙齒圍沙蠶購自浙江舟山朱家尖，并由浙江海洋大學(xué)趙盛龍教授進(jìn)行種類鑒定。

胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶 中國亞太恒信公司；纖維蛋白原、凝血酶、角叉菜膠、二磷酸腺苷（adenonisine disphosphate，ADP） 美國Sigma公司；阿司匹林腸溶片 拜耳醫(yī)藥保健有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Cogentu Scale超濾系統(tǒng) 德國默克密理博公司；AKTA purifier UPC 100快速蛋白液相色譜系統(tǒng) 美國GE Healthcare公司；ALPHA1-4冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國安捷倫公司；752FC紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；CF16RXⅡ低溫離心機(jī) 日本日立公司；LG-PABER-1半自動(dòng)凝血分析儀 北京世帝科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料制備

將新鮮雙齒圍沙蠶用清水清洗數(shù)次，瀝干后稱質(zhì)量，高速組織搗碎機(jī)勻漿，加3 倍體積預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（0.02 mol/L，pH 7.0），4 ℃靜置2 h以上。8 000 r/min離心15 min，收集上清液。上清液用醫(yī)用脫脂棉過濾出去脂肪組織及其他不溶物，分裝，-20 ℃凍存?zhèn)溆肹7]，此為沙蠶抗凝血肽（anticoagulant peptides from Perinereis aibuhitensis，PAAP）原料。

1.3.2 最佳酶選擇

將預(yù)處理好的PAAP原料按濕質(zhì)量3 倍加水。選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶作供選酶。參考不同酶的使用說明書，按照蛋白酶各自的最適作用溫度和pH值（堿性蛋白酶45.0 ℃、pH 10.0，中性蛋白酶45.0 ℃、pH 7.0，胃蛋白酶37.0 ℃、pH 2.0，木瓜蛋白酶60.0 ℃、pH 6.0，胰蛋白酶37.0 ℃、pH 8.0），參考本實(shí)驗(yàn)室前期研究及預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇加酶量1 500 U/g，反應(yīng)時(shí)間5 h，料液質(zhì)量比1∶3對PAAP原料進(jìn)行酶解。酶解完畢后，100 ℃滅酶10 min，過濾后冷凍干燥。進(jìn)行抗凝活力測定，選出抗凝活力最高的酶作為最佳酶。

1.3.3 抗凝活力的測定

依據(jù)鐘超[8]的方法和《中國藥典》（2010版）[9]，精密取樣品粉末（過3號(hào)篩）1 g，精密加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%氯化鈉溶液5 mL，充分?jǐn)嚢?，浸?0 min，并時(shí)時(shí)振搖，于10 000 r/min離心10 min。精密量取上清液100 μL，置于試管（8 mm×38 mm）中，加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%牛纖維蛋白原的Tris-HCl緩沖液200 μL，搖勻，于（37.0±0.5）℃水浴中溫浸5 min，滴加12 U/mL的凝血酶溶液，每1 min滴加1 次，每次5 μL，邊滴加邊輕輕搖勻，直至凝固。按照公式（1）計(jì)算抗凝活力。

式中：U為抗凝活力/（U/g）；c為凝血酶濃度/（U/mL）；ρ為樣品液質(zhì)量濃度/（g/mL）；V1為消耗凝血酶體積/μL；V2為樣品液體積/μL。

1.3.4 PAAP的分離純化

1.3.4.1 超濾分離

取在最佳酶的最優(yōu)酶解條件下酶解的上清液，用截留分子質(zhì)量分別為8、5、3 kD的超濾膜進(jìn)行超濾，將各分子段超濾獲得的酶解液經(jīng)冷凍干燥后進(jìn)行抗凝活力測定，篩選出對抗凝活力最高分子段的超濾組分并進(jìn)行凍干備用，并按照1.3.3節(jié)的方法進(jìn)行抗凝活力測定。

1.3.4.2 快速瓊脂糖凝膠陰離子交換層析分離純化

將1.3.4.1節(jié)獲得的抗凝活性最優(yōu)組分的樣品離心過濾后上樣，上樣質(zhì)量濃度為0.1 g/mL，樣體積為柱體積的1%。洗脫過程：預(yù)先用0.02 mol/L Tris-HCl平衡緩沖液（pH 7.4）充分平衡陰離子交換柱3～5 個(gè)柱體積，然后上樣。上樣后用平衡緩沖液將穿透峰洗脫至接近基線，隨后，采用線性梯度洗脫方式進(jìn)行洗脫，使NaCl濃度由0 mol/L上升至1 mol/L，按峰收集流出液的液體。檢測波長為280 nm，流速為1.5 mL/min，每管收集2 min，將各個(gè)洗脫峰凍干后備用，并按照1.3.3節(jié)的方法進(jìn)行抗凝活力測定。

1.3.4.3 葡聚糖凝膠G-25層析分離純化

將1.3.4.2節(jié)得到抗凝活性最優(yōu)組分，用蒸餾水配制為0.1 g/mL的溶液，過濾后進(jìn)行上樣，上樣體積為柱體積的1%。洗脫過程：以蒸餾水作為洗脫液，將凝膠柱進(jìn)行平衡洗脫；調(diào)節(jié)恒流泵流速為1.1 mL/min，每管收集3.5 min，收集各峰的洗脫液，280 nm波長處檢測其吸光度。將各個(gè)洗脫峰凍干后備用，并按照1.3.3節(jié)的方法進(jìn)行抗凝活力測定。

1.3.4.4 RP-HPLC分離純化

上樣樣品為1.3.4.3節(jié)經(jīng)凝膠過濾層析得到的樣品，利用反相（reversed-phase，RP）-HPLC法進(jìn)行進(jìn)一步純化。色譜條件：色譜柱為Zorbax SB-C18（4.6 nm×250 mm，5 μm）；進(jìn)樣體積為100 μL；流動(dòng)相A為超純水（含0.06%三氟乙酸），流動(dòng)相B為乙腈（含0.05%三氟乙酸），流動(dòng)相A洗脫4 min，0%～100%流動(dòng)相B梯度洗脫25 min，100%流動(dòng)相B洗脫6 min；流速為0.8 mL/min；紫外檢測波長280 nm。收集洗脫峰并進(jìn)行凍干后備用，并按照1.3.3節(jié)的方法進(jìn)行抗凝活力測定。

1.3.4.5 目標(biāo)肽的氨基酸序列測定

委托北京億譜生物科技有限公司，采用N末端降解檢測法進(jìn)行測定。

1.3.5 PAAP的急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)

雄性ICR小鼠20 只，體質(zhì)量（20±2）g，24 h禁食不禁水，將小鼠分為實(shí)驗(yàn)組與空白組。實(shí)驗(yàn)組采用國標(biāo)中最大耐受劑量（maximum tolerated dose，MTD）法[10]，根據(jù)PAAP的溶解性及其在注射器中的可流動(dòng)性為指標(biāo)[11]，確定其最高使用質(zhì)量濃度為550 mg/mL，按0.2 mL/10 g灌胃7 d，每天2 次，故實(shí)驗(yàn)組最終累計(jì)給予的最大沙蠶抗凝肽的劑量為11.0 g/（kg·d）。對照組灌胃同等體積的生理鹽水。記錄小鼠體質(zhì)量、外觀、食欲、活動(dòng)行為、死亡等不良反應(yīng)情況。7 d后稱質(zhì)量處死，解剖觀察。

1.3.6 PAAP對小鼠尾部血栓形成的影響

1.3.6.1 小鼠分組及造模

40 只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為5 組，每組8 只，分別為模型組、陽性對照組（阿司匹林100 mg/kg）、PAAP低劑量組（50 mg/kg）、PAAP中劑量組（100 mg/kg）和PAAP高劑量組（200 mg/kg）[12-16]。小鼠預(yù)防性灌胃給藥14 d，模型組給予等量生理鹽水，造模前24 h禁食不禁水，在第14天末，給藥1 h后參考文獻(xiàn)[17]造模，腹腔注射0.2%角叉菜膠，注射量為50 mg/kg（由生理鹽水配制），15 ℃過夜。

1.3.6.2 小鼠尾部血栓長度的計(jì)算

用游標(biāo)卡尺分別測定在注射角叉菜膠24、48 h和72 h后小鼠的尾部血栓總長及未形成血栓的長度，小鼠尾部血栓形成長度為小鼠尾部總長與未形成血栓長度之差。

1.3.7 PAAP對大鼠頸動(dòng)脈血栓形成的影響

1.3.7.1 大鼠頸動(dòng)脈血栓模型的建立

雄性SD大鼠40 只，隨機(jī)分為5 組，每組8 只，分別為模型組、陽性對照組（阿司匹林100 mg/kg）、PAAP低劑量組（50 mg/kg）、PAAP中劑量組（100 mg/kg）、PAAP高劑量組（200 mg/kg）[18-20]。預(yù)防性灌胃給藥14 d，模型組給予等量生理鹽水，造模前24 h禁食不禁水，于末次給藥1 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉。參照Kurz等[21]的方法改良制作頸總動(dòng)脈血栓模型，滅菌器材沿頸中線縱向切開頸部皮膚，鈍性分離左側(cè)頸動(dòng)脈1 cm，在頸動(dòng)脈與周圍組織間放一塑料保鮮膜，用于保護(hù)血管周圍組織，用吸有20 μL 35% FeCl3溶液的濾紙片（1 cm×1 cm）環(huán)形包裹頸動(dòng)脈，模型組用等量生理鹽水濾紙包裹，30 min后去除濾紙片。

1.3.7.2 血栓質(zhì)量及其抑制率的測定

大鼠取血后，精確截取濾紙環(huán)抱處血管，吸干血管中殘留血液，電子天平稱其質(zhì)量m1，取出血栓后再稱血管質(zhì)量m2，m1-m2即為1 cm血管段內(nèi)血栓質(zhì)量m。按公式（2）計(jì)算各組抑制率[22]。

式中：m模型組為模型組血栓質(zhì)量/g；m實(shí)驗(yàn)組為實(shí)驗(yàn)組血栓質(zhì)量/g。

1.3.8 PAAP對大鼠體內(nèi)血小板聚集率的影響

雄性SD大鼠40 只，隨機(jī)分為5 組，每組8 只，分別為模型組、陽性對照組（阿司匹林100 mg/kg）、PAAP低劑量組（50 mg/kg）、PAAP中劑量組（100 mg/kg）和PAAP高劑量組（200 mg/kg）。預(yù)防性灌胃給藥14 d，模型組給予等量生理鹽水，造模前24 h禁食不禁水，于末次給藥1 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血。轉(zhuǎn)入裝有抗凝劑（枸櫞酸鈉質(zhì)量比1∶9）的采血管中，于1 000 r/min離心10 min，取上清液為富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）。余下血液于3 500 r/min繼續(xù)離心15 min，取上清液即為貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）[23-24]。使用半自動(dòng)凝血儀測定血小板聚集率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以 ±s表示，采用單因素分析進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳酶的選擇

表1 5 種蛋白酶酶解液的抗凝活力Table 1 Comparison of antithrombotic activity of hydrolysates produced with fi ve different proteases

由表1可知，在最適酶解條件下，堿性蛋白酶的酶解效果最好，抗凝活力達(dá)到了（69.0±2.3）U/g，胃蛋白酶次之。故選定堿性蛋白酶為本實(shí)驗(yàn)最佳酶。

2.2 PAAP的分離純化結(jié)果

2.2.1 超濾分離純化結(jié)果

圖1 酶解液的不同超濾截留組分抗凝活力Fig. 1 Antithrombotic activity of ultraf i ltration fractions from PAAP

取各個(gè)不同分子質(zhì)量范圍凍干樣品測定抗凝活力，由圖1可知，分子質(zhì)量≤3 kD的酶解物抗凝活力最高，為（84.0±2.3）U/g，故選定該分子質(zhì)量范圍的酶解物進(jìn)行下步分離純化。

2.2.2 快速瓊脂糖凝膠陰離子交換層析分離純化結(jié)果

圖2 快速瓊脂糖凝膠陰離子交換層析洗脫曲線Fig. 2 Elution curve of PAAP using Sepharose fast fl owion exchange chromatography

取分子質(zhì)量≤3 kD的酶解液進(jìn)一步分離純化，于280 nm波長處出現(xiàn)3 個(gè)峰，即峰1、峰2和峰3（圖2）。收集各峰組分，冷凍干燥后測定抗凝活力（圖3），峰3組分具有最高的抗凝活力，為（900±51）U/g，故選擇峰3對應(yīng)的組分進(jìn)行下一步分離純化。

圖3 洗脫峰樣品抗凝活力Fig. 3 Antithrombotic activity of elution peaks obtained from ion exchange chromatography

2.2.3 葡聚糖凝膠G-25層析分離純化結(jié)果

圖 4 葡聚糖凝膠G-25層析洗脫曲線Fig. 4 Elution curve of fraction Ⅲ on Sephadex G-25 column

取2.2.2節(jié)中峰3凍干樣品進(jìn)行凝膠過濾層析分離并在280 nm波長處檢測吸光度，結(jié)果如圖4所示，為單一峰，收集此峰組分并凍干備用。

2.2.4 RP-HPLC分離純化及氨基酸序列測定結(jié)果

圖5 葡聚糖凝膠G-25洗脫峰的RP-HPLC分離純化結(jié)果Fig. 5 Elution curve of purif i ed fraction Ⅲ using RP-HPLC

G-25洗脫峰凍干樣品經(jīng)RP-HPLC色譜柱洗脫純化，共得到8 個(gè)單峰（圖5），由于峰1、8組分產(chǎn)率不高，多次收集后仍然很少，因此未進(jìn)一步收集，收集其他6 個(gè)峰組分并測定抗凝活力。其中峰4組分具有最高抗凝活力，將峰4組分繼續(xù)經(jīng)RP-HPLC色譜柱洗脫純化，得到1 個(gè)單峰（圖6），收集最高峰組分并將其命名為PAAP。經(jīng)檢測該目標(biāo)肽的氨基酸序列為Pro-Val-Glu-Arg-Lys（脯氨酸-纈氨酸-谷氨酸-精氨酸-賴氨酸），分子質(zhì)量為627.7 D。將該物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，所得分子質(zhì)量大小與該氨基酸序列的大小一致（圖7）。經(jīng)測定，PAAP的體外抗凝活力為（1 320.0±20.3）U/g。

圖6 4號(hào)峰的RP-HPLC分離純化結(jié)果Fig. 6 Elution curve of peak 4 from fraction Ⅲ further using RP-HPLC

圖7 PAAP的質(zhì)譜圖Fig. 7 Mass spectrum of PAAP

2.3 急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

給予小鼠PAAP后，實(shí)驗(yàn)中各組小鼠活動(dòng)正常、反應(yīng)靈敏、皮毛光澤、進(jìn)食和飲水等活動(dòng)正常，精神狀態(tài)良好且未出現(xiàn)死亡。解剖后發(fā)現(xiàn)，心、肺、肝、腎、胃和腸等器官肉眼觀察均無異常。實(shí)驗(yàn)期間，PAAP實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量和對照組相比較，實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量漲幅相對明顯（表2），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。可見，PAAP的攝入沒有誘使受試小鼠產(chǎn)生食欲不振等現(xiàn)象，不影響小鼠的正常生長發(fā)育，使用安全，基本無毒。

表2 急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量變化Table 2 Changes in body weights in mice during acute PAAP toxicity trials g

2.4 PAAP對體內(nèi)血栓的影響

2.4.1 PAAP對不同時(shí)間角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾部血栓長度的影響

由表3可知，小鼠注射角叉菜膠后，各組均形成明顯尾部血栓，隨著處理時(shí)間的延長，各組的尾部血栓長度均有不同程度的縮短。造模24 h時(shí)，高、中劑量組與模型組差異顯著，尾部血栓長度明顯較短（p＜0.05）。48 h及72 h時(shí)，PAAP各組均與模型組有顯著差異（p＜0.05）。陽性對照組與模型組差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明PAAP可有效減輕小鼠尾部血栓的形成，不但可以抑制血栓發(fā)展，同時(shí)對已形成的血栓有一定的溶解作用，且有量效關(guān)系。

表3 實(shí)驗(yàn)小鼠造模24、48 h和72 h尾部血栓長度Table 3 The length of black tail at 24, 48 and 72 h after tail thrombosis model establishment

2.4.2 PAAP對大鼠頸動(dòng)脈血栓的影響

表4 PAAP對大鼠頸動(dòng)脈血栓生成量的影響Table 4 Effect of PAAP on carotid arterial thrombosis

由表4可知，陽性對照組與PAAP組均可減輕血栓質(zhì)量。與模型組相比，PAAP中、高劑量大鼠的血栓質(zhì)量顯著下降（p＜0.05）。與陽性對照組相比，PAAP高劑量大鼠的血栓質(zhì)量也有所下降，表明PAAP能夠降低血栓質(zhì)量且有量效關(guān)系。

2.5 PAAP對大鼠體內(nèi)血小板聚集率的影響

表5 PAAP對大鼠體內(nèi)血小板聚集的影響Table 5 Effect of PAAP on platelet aggregation in rats

由表5可知，與模型組相比，陽性對照組和PAAP各劑量組對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集有非常顯著的抑制作用（p＜0.05），且隨著PAAP給藥劑量的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。

3 討 論

本研究以堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶作為供選酶來酶解雙齒圍沙蠶，以體外抗凝活力為檢測指標(biāo)，篩選出堿性蛋白酶為最佳酶解沙蠶酶，在此酶解基礎(chǔ)上進(jìn)一步分離純化。首先，酶解液經(jīng)超濾截留具有最高抗凝活力的分子段（分子質(zhì)量≤3 kD），接著利用快速瓊脂糖凝膠陰離子交換層析篩選出活性最高組分（峰3），并利用葡聚糖凝膠G-25層析對峰3進(jìn)行純化獲得單一峰，收集此峰并利用RPHPLC進(jìn)行分離純化。最后，將純化后的樣品進(jìn)行氨基酸序列測定，其氨基酸序列為Pro-Val-Glu-Arg-Lys，將該寡肽命名為PAAP。

血栓的形成是缺血性心腦血管疾病及血栓栓塞性疾病的主要病理過程，與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，抑制血小板聚集、抑制血栓的形成對心腦血管系統(tǒng)疾病及其他血栓栓塞性疾病的防治均有重要意義[25]。本研究通過小鼠尾部血栓形成實(shí)驗(yàn)、大鼠動(dòng)脈血栓形成實(shí)驗(yàn)及血小板聚集實(shí)驗(yàn)，對PAAP的抗血栓作用進(jìn)行了初步探討。

角叉菜膠是從紅藻類海草中提煉出來的親水性膠體，是一種較強(qiáng)的致炎因子[26]，可用于制備多種組織炎癥模型。胡三覺等[17]發(fā)現(xiàn)可用其制作小鼠尾部血栓形成模型，此種靜脈血栓形成是由局部炎癥與內(nèi)皮細(xì)胞的損壞所引起的混合型血栓，可依據(jù)皮膚顏色的顯著變化，從體表直接測量血栓的形成范圍與程度，觀察其發(fā)展全過程，具有簡便、直觀、無創(chuàng)傷等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，注射角叉菜膠后期，部分小鼠會(huì)出現(xiàn)斷尾現(xiàn)象，為準(zhǔn)確測量尾部血栓長度，在實(shí)驗(yàn)過程中選擇測量未形成血栓的長度，用尾部總長度減去未形成血栓長度，即為小鼠尾部血栓長度，發(fā)現(xiàn)PAAP能夠顯著降低小鼠尾部形成血栓長度（p＜0.05），對角叉菜膠所致的小鼠尾部血栓具有一定的抑制作用。

Lockyer等[27]發(fā)現(xiàn)利用FeCl3外敷可使血管內(nèi)膜損傷，膠原暴露，引起血小板黏附、聚集和釋放活化等，導(dǎo)致內(nèi)源性凝血系統(tǒng)激活，在動(dòng)脈損傷的區(qū)域形成復(fù)合性血栓，與人類血栓性疾病的發(fā)病機(jī)制相似且制作方法簡單、容易控制、重復(fù)性好[28]，因而在國內(nèi)外研究中被廣泛使用[29-31]。本實(shí)驗(yàn)選用此模型來評(píng)價(jià)PAAP抑制血栓形成的作用，研究結(jié)果顯示，PAAP各劑量組均能延長FeCl3誘導(dǎo)的大鼠頸總動(dòng)脈血栓形成時(shí)間，且中、高劑量作用效果明顯（p＜0.05），表明PAAP具有抑制動(dòng)脈血栓形成的作用。

血小板聚集誘導(dǎo)劑主要包括ADP、凝血酶、膠原、血栓烷A2、腎上腺素和血清素等。各種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)血小板活化的能力不盡相同，凝血酶、膠原和血栓烷A2都是強(qiáng)誘導(dǎo)劑，ADP屬中等強(qiáng)度的血小板聚集誘導(dǎo)劑[32-34]，其誘導(dǎo)的血小板活化的信號(hào)通路是血小板聚集過程中最為重要的信號(hào)通路[23]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇ADP誘導(dǎo)的血小板聚集進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，PAAP能夠有效抑制由ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集。

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)使用堿性蛋白酶酶解雙齒圍沙蠶，經(jīng)分離純化后，所獲得的寡肽（PAAP）氨基酸序列為Pro-Val-Glu-Arg-Lys，體外抗凝活力達(dá)到（1 320.0±20.3）U/g。急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PAAP的最大耐受量為11.0 g/（kg·d），實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)小鼠異常及死亡現(xiàn)象，提示該樣品使用安全。PAAP可明顯抑制角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠尾部血栓及FeCl3引起的大鼠頸動(dòng)脈血栓（p＜0.05），同時(shí)對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集也具有抑制作用。

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Enzymatic Preparation and Antithrombotic Activity of Anticoagulant Peptides from Perinereis aibuhitensis

ZHENG Yuanyuan1, DING Guofang1,2,*, YANG Zuisu1, YU Fangmiao1, JIA Yinglu1, WU Zongze1, CHEN Rui1
(1. Engineering Research Centers of Marineorganisms Medical Products, School of Food and Medicine, Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022, China; 2. Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province, Zhoushan 316021, China)

The present study was intended to investigate the enzymatic preparation and antithrombotic activity of anticoagulant peptides from Perinereis aibuhitensis (PAAP). The optimum enzyme was determined based on anticoagulant activity. Ultraf i ltration, anion-exchange chromatography, gel chromatography and reversed phase high-performance liquid chromatography were used sequentially to separate and purify peptides with the strongest anticoagulant activity from the protein hydrolysate of Perinereis aibuhitensis, named as PAAP. Then, the acute toxicity of PAAP was determined. Furthermore, the antithrombotic activity of PAAP was observed by carrageenan-induced tail thrombosis in mice, FeCl3-induced arterial thrombosis in rats and platelet aggregation induced by adenosine diphosphate (ADP). Alkaline protease was selected as the optimal protease to digest Perinereis aibuhitensis. An anticoagulant peptide was then obtained after separation and purif i cation, and identif i ed as Pro-Val-Glu-Arg-Lys. The anticoagulant activity of PAAP could reach up to (1 320.0 ± 20.3) U/g. The maximum tolerance dose of PAAP was 11.0 g/(kg·d) without the occurrence of abnormality and death in mice. The in vivo experiments also showed that PAAP could prevent the formation of carrageenan-induced tail thrombosis in mice, FeCl3-induced arterial thrombosis in rats and platelet aggregation induced by ADP. Thus PAAP has an antithrombotic effect.

Perinereis aibuhitensis; anticoagulant peptides; alkaline protease; separation and purif i cation; antithrombosis

10.7506/spkx1002-6630-201723027

R282.77

A

1002-6630（2017）23-0171-07

鄭媛媛, 丁國芳, 楊最素, 等. 雙齒圍沙蠶抗凝血肽的制備及其抗血栓作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(23): 171-177.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723027. http://www.spkx.net.cn

2016-09-13

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81001393）；2015年度國家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2015GA700044）；

國家海洋局重大計(jì)劃項(xiàng)目（2015862）；浙江省科技廳重大科技專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（2013C03036）；

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LS15H30001）；浙江省自然科學(xué)基金青年資金項(xiàng)目（LQ16H300001）；舟山市公益類科技項(xiàng)目（2015C31012）

鄭媛媛（1990—），女，碩士，研究方向?yàn)楹Ｑ笏幬?、海洋功能食品。E-mail：337132216@qq.com

*通信作者：丁國芳（1958—），男，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)楹Ｑ笏幬?、海洋功能食品。E-mail：dinggf2007@163.com

ZHENG Yuanyuan, DING Guofang, YANG Zuisu, et al. Enzymatic preparation and antithrombotic activity of anticoagulant peptides from Perinereis aibuhitensis[J]. Food Science, 2017, 38(23): 171-177. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723027. http://www.spkx.net.cn