涂仁杰，金文標(biāo)，韓松芳，陳洪一(哈爾濱工業(yè)大學(xué)深圳研究生院，廣東 深圳 518055)

生物工程

植物生長調(diào)節(jié)劑對城市污水中小球藻生長和油脂積累的影響

涂仁杰，金文標(biāo)，韓松芳，陳洪一
(哈爾濱工業(yè)大學(xué)深圳研究生院，廣東 深圳 518055)

研究了不同質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑(IAA、TRIA、6-BA、2,4-D)對蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)生長和油脂積累的影響，并從藻細(xì)胞形態(tài)，脂肪酸組成及元素含量等方面對機(jī)理進(jìn)行了探討。結(jié)果表明：2,4-D對城市污水中小球藻生長的促進(jìn)作用最為顯著，當(dāng)2,4-D的質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時(shí)小球藻干重和油脂產(chǎn)量分別達(dá)到最大值，比空白對照組分別提高了30.77%和51.43%。利用掃描電鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)處理組小球藻個(gè)體大小略大于空白對照組。通過對生成的脂肪酸甲酯進(jìn)行氣相色譜分析，結(jié)果顯示植物生長調(diào)節(jié)劑的投加對小球藻脂肪酸組成影響不大，但提升了單不飽和脂肪酸含量，有利于提高所得生物柴油的品質(zhì)。

植物生長調(diào)節(jié)劑；城市污水；小球藻；油脂產(chǎn)量

隨著能源危機(jī)與環(huán)境污染的加劇，微藻生物柴油越來越受到各國研究者的關(guān)注[1-3]。就整體工藝而言，微藻生物柴油的生產(chǎn)包括藻種選育、微藻培養(yǎng)、微藻收獲、油脂提取與轉(zhuǎn)脂。微藻培養(yǎng)是其中一個(gè)重要環(huán)節(jié)，在微藻培養(yǎng)過程中，利用淡水培養(yǎng)微藻需消耗大量淡水資源。同時(shí)，營養(yǎng)物質(zhì)的投加進(jìn)一步提高了微藻的培養(yǎng)成本[4-5]。城市污水中含有大量的氮、磷營養(yǎng)物質(zhì)，利用城市污水培養(yǎng)微藻，可在水質(zhì)凈化的同時(shí)，為微藻的生長提供豐富的氮、磷，同時(shí)污水中的細(xì)菌可分解污水中的有機(jī)物產(chǎn)生CO2，為微藻提供生長所需碳源。

在目前實(shí)驗(yàn)室條件下，微藻的生長速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于理論條件下的生長速率[6]，如何提高微藻的生長速率，在最短時(shí)間內(nèi)收獲更多的藻體是目前研究的熱點(diǎn)，也是難點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，使用植物激素是一種有效的方法，其優(yōu)點(diǎn)是成本較低，容易吸收，可以明顯提高植物的生長速率。植物激素是由植物自身代謝產(chǎn)生，在極低濃度下就有明顯生理效應(yīng)的活性物質(zhì)。植物生長調(diào)節(jié)劑是一類人工合成的具有與植物激素類似的生理效應(yīng)，但比天然植物激素有更高活性的激素類化學(xué)物質(zhì)。由于微藻有著與植物相類似的特性，因此考慮將具有促進(jìn)植物生長與分裂的植物生長調(diào)節(jié)劑運(yùn)用在微藻培養(yǎng)，以期增加微藻干重及油脂產(chǎn)量。郝宗娣等[7]研究了不同植物激素對原始小球藻生長的影響，結(jié)果顯示2,4-D在低質(zhì)量濃度時(shí)對藻類生長促進(jìn)作用最佳。鄧曉東等[8]研究了激素IAA及ABA對小球藻生長及油脂積累的影響，結(jié)果顯示ABA對小球藻的生長具有抑制作用，對油脂積累具有促進(jìn)作用。

本文研究了不同質(zhì)量濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑(IAA、TRIA、6-BA 、2,4-D)對城市污水中蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)生長和油脂積累的影響，并從藻細(xì)胞形態(tài)、脂肪酸組成、元素含量等方面對機(jī)理進(jìn)行了探討。以期提高微藻在城市污水中的生長速率和油脂產(chǎn)量，為微藻的規(guī)?；囵B(yǎng)提供實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藻種與培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)所用微藻為課題組前期經(jīng)離子注入法誘變篩選的蛋白核小球藻誘變株，藻種采用BG11培養(yǎng)基[9]進(jìn)行傳代培養(yǎng)保藏。

實(shí)驗(yàn)所用城市污水取自深圳大學(xué)城市政污水井，經(jīng)潛污泵抽取后使用。污水水質(zhì)見表1。

表1 深圳大學(xué)城生活污水水質(zhì)

1.1.2 主要試劑、設(shè)備

氯仿、甲醇、鹽酸、甲醇鈉、乙酸乙酯、乙酸異戊酯均為分析純，乙腈為色譜純(德國默克公司)。氣泡柱式光生物反應(yīng)器(直徑5 cm、長度50 cm、容積1 L)，賽里安456-GC氣相色譜儀，XD-1型二氧化碳臨界點(diǎn)干燥器(Eiko公司)，IB-3型離子鍍金儀(Eiko公司)，JSM-6390LV掃描電鏡(JEOL公司)，Vario EL cube元素分析儀(德國元素公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微藻培養(yǎng)

以BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的微藻為種子液，接種于600 mL城市污水，于氣泡柱式光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，以相應(yīng)的不加微藻的城市污水為空白對照，使扣除空白后藻液初始吸光度D680為0.1，按照初始質(zhì)量濃度0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L投加植物生長調(diào)節(jié)劑吲哚乙酸(IAA)、三十烷醇(TRIA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和腺嘌呤(6-BA)，于培養(yǎng)溫度(25±1)℃、光照強(qiáng)度100 μmol/(m2· s)、光暗比12 h∶12 h條件下，連續(xù)通氣培養(yǎng)(空氣流速120 mL/min，由底部通入)。每天取樣測定扣除空白后藻液的D680以監(jiān)測藻細(xì)胞生長情況，取培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定期的藻液測定藻細(xì)胞的干重、油脂產(chǎn)量。每組實(shí)驗(yàn)各設(shè)3個(gè)平行。

1.2.2 微藻生長與干重的測定

微藻細(xì)胞密度與藻種在特征波長下的吸光度之間存在著一定的線性關(guān)系[10]。因此，通過測定吸光度D680來監(jiān)測微藻的生長情況。微藻的干重采用重量法測定，取穩(wěn)定期藻液10 mL經(jīng)0.45 μm微孔濾膜(W1)過濾、洗滌，于105℃下烘至恒重 (W2)，計(jì)算微藻干重DW：DW=(W2-W1)/ 0.01。

1.2.3 微藻油脂產(chǎn)量與脂肪酸組成的測定

微藻油脂提取采用氯仿甲醇共溶劑提取法[11]。待提取結(jié)束后，收集氯仿相，轉(zhuǎn)移至預(yù)稱重的錫紙盤中，待有機(jī)溶劑揮發(fā)完全后，于80℃烘箱中烘至恒重，得到微藻油脂產(chǎn)量，微藻細(xì)胞油脂含量為微藻油脂產(chǎn)量與微藻干重的百分比。

微藻脂肪酸組成的測定，首先對提取的油脂進(jìn)行甲酯化[12]，將5 mL藻液中脂肪酸轉(zhuǎn)化成相對應(yīng)的脂肪酸甲酯。采用賽里安456-GC氣相色譜儀進(jìn)行分析，BR-2560色譜柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)，F(xiàn)ID檢測器，分流方式進(jìn)樣，分流比30∶1，進(jìn)樣量1 μL。

1.2.4 藻細(xì)胞的掃描電鏡觀察

樣品的前處理使用0.1 mol/L磷酸緩沖液離心漂洗3次。1%鋨酸固定90 min，0.1 mol/L磷酸緩沖液離心漂洗3次，0.2 μm微孔濾膜過濾。在乙醇梯度30%、50%、70%、80%、100%依次脫水，其中100%乙醇梯度脫水2次，每次10 min。乙酸異戊酯置換，50% 1次，100% 2次。XD-1型二氧化碳臨界點(diǎn)干燥器干燥，IB-3型離子鍍金儀噴金鍍膜，JSM-6390LV掃描電鏡觀察。

1.2.5 微藻元素分析

取一定量藻液于離心機(jī)中以8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，將離心后的藻體置于烘箱60℃干燥5 h。利用Vario EL cube元素分析儀測定微藻細(xì)胞中的C、N、H含量，每次稱取2 mg左右藻粉樣品用鋁箔紙包住進(jìn)機(jī)測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對小球藻干重的影響

將小球藻按初始吸光度D680為0.1接種到投加植物生長調(diào)節(jié)劑的城市污水中。取穩(wěn)定期藻液測小球藻干重，結(jié)果如表2所示。

表2 植物生長調(diào)節(jié)劑對城市污水中小球藻干重的影響

從表2可以看出，除了三十烷醇(TRIA)，其余3種植物生長調(diào)節(jié)劑都能有效提高小球藻干重。在所設(shè)置的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，小球藻干重隨著植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度的升高而升高，達(dá)到最高值后，隨著植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度的升高有所降低，但仍比空白對照組的高。當(dāng)IAA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L、6-BA 質(zhì)量濃度為1.5 mg/L、 2,4-D 質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時(shí)小球藻干重分別達(dá)到最大值，比空白對照組分別提高了22.64%、23.64%和30.77%。培養(yǎng)過程中投加TRIA處理組藻液吸光度D680在3 d的時(shí)候開始下降，液體發(fā)黃，并出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，使測得的小球藻干重降低。

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對小球藻產(chǎn)脂的影響

4種植物生長調(diào)節(jié)劑下小球藻的油脂含量和油脂產(chǎn)量如表3、表4所示。

從表2和表3可以看出，投加TRIA處理組小球藻干重較低，油脂含量卻較高；投加2,4-D處理組小球藻干重較高，油脂含量卻較低，可見微藻生物量與油脂積累相矛盾。微藻生物量和油脂含量共同決定最終微藻油脂產(chǎn)量，而油脂才是制備生物柴油的原料，應(yīng)作為重要參考指標(biāo)。從表4可以看出，4種植物生長調(diào)節(jié)劑都能有效提高小球藻油脂產(chǎn)量。當(dāng)IAA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L、TRIA質(zhì)量濃度為 0.5 mg/L、6-BA質(zhì)量濃度為1.5 mg/L、2,4-D質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時(shí)油脂產(chǎn)量分別達(dá)到最大值，比空白對照組分別提高了17.85%、25.26%、33.29%、51.43%。后續(xù)選取對小球藻油脂產(chǎn)量促進(jìn)效果較明顯的植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA和2,4-D作為研究對象，探討相關(guān)機(jī)理。

表3 植物生長調(diào)節(jié)劑對城市污水中小球藻油脂含量的影響

表4 植物生長調(diào)節(jié)劑對城市污水中小球藻油脂產(chǎn)量的影響

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對小球藻形態(tài)的影響

利用掃描電鏡觀察處理組與空白對照組小球藻的形態(tài)差異，結(jié)果如圖1所示。

圖1投加植物生長調(diào)節(jié)劑處理組與空白對照組掃描電鏡照片

從圖1可以看出，處理組與空白對照組的小球藻細(xì)胞均為不規(guī)則球形，但形態(tài)上仍有一定的差異。在同等放大倍數(shù)下對比藻細(xì)胞大小，可以發(fā)現(xiàn)處理組小球藻個(gè)體大小略大于空白對照組的。對比藻細(xì)胞胞外物質(zhì)的情況，可以發(fā)現(xiàn)處理組的藻細(xì)胞之間黏附著許多不定型物質(zhì)，導(dǎo)致多個(gè)藻細(xì)胞團(tuán)聚在一起，有利于小球藻的收獲。而空白對照組藻細(xì)胞胞外不定型物質(zhì)較少，藻細(xì)胞較為分散。培養(yǎng)過程中也發(fā)現(xiàn)投加植物生長調(diào)節(jié)劑的處理組比空白對照組更容易沉淀，與電鏡觀察分析結(jié)果一致。

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑對小球藻脂肪酸組成的影響

對投加植物生長調(diào)節(jié)劑處理組與空白對照組油脂進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，通過對生成的脂肪酸甲酯進(jìn)行氣相色譜分析，分析小球藻脂肪酸組成的差異，結(jié)果如表5所示。

表5 投加植物生長調(diào)節(jié)劑處理組與空白對照組脂肪酸組成及含量 %

從表5可以看出，處理組小球藻在脂肪酸組成上均以C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C18∶2和C18∶3為主，為綠藻中常見脂肪酸[13]。Song[14]、Ma[15]等的研究表明，適合制備生物柴油的原料應(yīng)含有較多的C16～C18脂肪酸，主要包括十六烷酸(C16∶0)、十六碳烯酸(C16∶1)、十八烷酸(C18∶0)、十八碳烯酸(C18∶1)、十八碳二烯酸(C18∶2)、十八碳三烯酸(C18∶3)。空白對照組與投加6-BA、2，4-D的處理組中該6種脂肪酸在總脂肪酸中的含量分別可達(dá)97.19%、97.29%、97.75%。此外，高品質(zhì)的生物柴油應(yīng)含有盡量多的單不飽和脂肪酸甲酯，以改善其十六烷值、低溫流動(dòng)性、氧化安定性、運(yùn)動(dòng)黏度等性能[16-18]。投加6-BA、2，4-D的處理組中單不飽和脂肪酸的含量分別為10.90%、11.51%，比對照組5.36%有大幅提高，有利于提高所得生物柴油的品質(zhì)。

2.5 植物生長調(diào)節(jié)劑對小球藻元素組成的影響

相同條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，將藻液離心烘干制成藻粉，測定不同藻細(xì)胞的元素成分，結(jié)果如表6所示。

表6 投加植物生長調(diào)節(jié)劑處理組與空白對照組元素含量 %

從表6可以看出，投加6-BA、2，4-D處理組與空白對照組在元素含量上有一定差異，投加2,4-D處理組的氮元素含量比空白對照組的有所降低，可能由于藻體油脂積累較多導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成較少。另外，分析藻細(xì)胞的H/C值發(fā)現(xiàn)，空白對照組的H/C值為1.75，而投加6-BA和2,4-D處理組的H/C值分別為1.75和1.83。投加2,4-D處理組的H/C值相比空白對照組的有所增加，說明藻株中不飽和度降低，與表5中投加2,4-D處理組多不飽和脂肪酸減少的結(jié)果相一致。

3 結(jié) 論

4種植物生長調(diào)節(jié)劑(IAA、TRIA、6-BA、2,4-D)都能有效促進(jìn)小球藻油脂積累，其中2,4-D對城市污水中小球藻生長和油脂積累促進(jìn)作用最為顯著，當(dāng)2,4-D的初始質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時(shí)，小球藻干重和油脂產(chǎn)量分別可達(dá)到0.68 g/L和0.132 5 g/L，比空白對照組分別提高了30.77%和51.43%。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示處理組小球藻個(gè)體大小略大于空白對照組，藻細(xì)胞團(tuán)聚在一起，有利于小球藻的收獲。脂肪酸組成結(jié)果顯示投加植物生長調(diào)節(jié)劑對小球藻脂肪酸組成影響不大，但提升了單不飽和脂肪酸含量，有利于提高所得生物柴油的品質(zhì)。

[1] CHISTI Y. Constraints to commercialization of algal fuels-tamuedu[J]. J Biotechnol, 2013, 167(3):201-214.

[2] HAN S F, JIN W B, TU R J, et al. Biofuel production from microalgae as feedstock: current status and potential[J]. Crit Rev Biotechnol, 2015, 35(2):255-268.

[3] ABOMOHRA A E, JIN W B, TU R J, et al. Microalgal biomass production as a sustainable feedstock for biodiesel: current status and perspectives[J]. Renew Sust Energ Rev, 2016, 64:596-606.

[4] YANG J, XU M, ZHANG X Z, et al. Life-cycle analysis on biodiesel production from microalgae: water footprint and nutrients balance[J]. Bioresour Technol, 2011,102:159-165.

[5] JIANG L L, LUO S J, FAN X L, et al. Biomass and lipid production of marine microalgae using municipal wastewater and high concentration of CO2[J]. Appl Energ, 2011,88:3336-3341.

[6] 封麗,張君，穆斌，等. 小球藻生長動(dòng)力學(xué)特征研究[J].三峽環(huán)境與生態(tài)，2011,33(5):6-8.

[7] 郝宗娣,劉平懷,時(shí)杰,等. 不同植物激素對原始小球藻生長及油脂含量的影響[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(8): 104-107.

[8] 鄧曉東,吳小霞,范新照,等.激素IAA和ABA對小球藻(Chlorellasp.)生長和油脂積累的影響[J].中國油料作物學(xué)報(bào),2013,35(1):58-63.

[9] STAINIER R Y, KUNISAWA R, MANDEL M, et al. Purification and properties of unicellular blue-green algae (orderChroococcales)[J]. Bacteriol Rev, 1971,35(2): 171-205.

[10] 國家環(huán)?？偩帧端蛷U水監(jiān)測分析方法》編委會(huì). 水和廢水監(jiān)測分析方法[M]. 北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社, 2002:200-284.

[11] FOLCH J, LEES M, STANLEY G H S. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues[J]. J Biol Chem, 1957, 226:497-509.

[12] KACZMARZYK D, FULDA M. Fatty acid activation in cyanobacteria mediated by acyl-acyl carrier protein synthetase enables fatty acid recycling[J]. Plant Physiol, 2010,152(3):1598-1610.

[13] GOUVEIA L, OLIVEIRA A C. Microalgae as a raw material for biofuels production[J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2009,36(2):269-274.

[14] SONG M M, PEI H Y, HU W R, et al. Evaluation of the potential of 10 microalgal strains for biodiesel production[J]. Bioresour Technol, 2013,141:245-251.

[15] MA Y B, WANG Z Y, YU C J, et al. Evaluation of the potential of 9Nannochloropsisstrains for biodiesel production[J]. Bioresour Technol, 2014, 167:503-509.

[16] 胡健華. 生物柴油的脂肪酸組成對其性能的影響[J]. 武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào), 2010,29(4):26-28.

[17] 方利國,林璟. 脂肪酸甲酯對生物柴油十六烷值影響的研究[J]. 化工新型材料, 2008,36(11):94-96.

[18] 陳秀,袁銀南,孫平,等. 脂肪酸甲酯結(jié)構(gòu)對生物柴油十六烷值的影響[J]. 石油與天然氣化工, 2007,36(6):481-484.

EffectsofplantgrowthregulatorongrowthandoilaccumulationofChlorellapyrenoidosacultivatedinmunicipalwastewater

TU Renjie, JIN Wenbiao, HAN Songfang, CHEN Hongyi
(Harbin Institute of Technology Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055, Guangdong, China)

Effects of different mass concentrations of plant growth regulator (IAA、TRIA、6-BA、2,4-D) on growth and oil accumulation ofChlorellapyrenoidosawere studied. The mechanism was also discussed from algal cell morphology, fatty acid composition and element content, etc. The results showed that 2,4-D significantly promoted growth ofChlorellapyrenoidosain municipal wastewater. The dry weight and lipid yield ofChlorellapyrenoidosareached the maximum when mass concentration of 2,4-D was 1.5 mg/L, and increased by 30.77% and 51.43% compared with control group, respectively. It was found that the size ofChlorellapyrenoidosain treatment group was slightly larger than that in control group by scanning electron microscope. According to the GC analysis of the lipids, plant growth regulator exerted a relatively low influence on the fatty acid composition ofChlorellapyrenoidosa, but it increased the content of monounsaturated fatty acid, which was helpful to improve the quality of biodiesel.

plant growth regulator; municipal wastewater;Chlorellapyrenoidosa; oil yield

2017-02-17；

2017-08-02

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20150529114024234)

涂仁杰(1985)，男，博士研究生，研究方向?yàn)槲⒃迳锬茉?E-mail)turenjie@stmail.hitsz.edu.cn。

金文標(biāo)，教授，博士(E-mail)jinwb@hit.edu.cn。

Q949;TQ642

A

1003-7969(2017)10-0110-05