俞 明，錢俊青，龔 峰，郭 輝(浙江工業(yè)大學 藥學院, 杭州 310014)

油料蛋白

乳液顆粒度對中性蛋白酶酶解反應影響的研究

俞 明，錢俊青，龔 峰，郭 輝
(浙江工業(yè)大學 藥學院, 杭州 310014)

探索了1398中性蛋白酶酶解大豆乳液的反應速率受乳液顆粒度的影響。以1398中性蛋白酶在溫度45 ℃、pH 7.0、加酶量120 U/mL(以乳液計)條件下，發(fā)現(xiàn)隨著篩網目數(80～160目)增大，即顆粒度減小，其反應速率逐漸增大，200 目與160 目的乳液參與酶促反應的速率相近。根據反應起始至5 h內反應速率隨乳液顆粒度變化的實驗數據，擬合了不同酶解時間段乳液顆粒度與反應速率的關系式，由關系式曲線與實驗值符合情況可知，在反應1 h之內及4～5 h之間，乳液顆粒度對反應速率影響的規(guī)律基本一致，而在反應1～4 h間為另一種規(guī)律。根據擬合關系式，可指導和優(yōu)化大豆水相酶法提取大豆油的工藝。

蛋白酶；反應速率；顆粒度；大豆乳液；水相酶法

為同時利用油料的油脂和蛋白質，1956年Suganman[1]創(chuàng)立了以水作為溶劑，按照濃縮蛋白的生產工藝，分別將油和蛋白質從花生中分離出來的工藝，其中蛋白質含油9%～10%，且總提油率不高。在此之后，研究人員經過進一步的研究，可使提油率達到70%以上，蛋白質中的含油量下降到了4.0%[2]。此方法適用于含油量高的油料，如芝麻、油菜籽、花生等。對于含油量低的油料，如大豆，得到的油非常少[3]。

為此，有學者提出在水相體系中用酶提取油脂的方法，解決含油量低油料提油率低的問題，而且能夠分離低變性蛋白質，達到提取油脂和獲得無毒蛋白質二者的兼顧。Sharma等[4]研究了水酶法提取米糠油以提高油脂的得率。錢志娟等[5]建立了玉米胚芽水酶法提取油脂及蛋白質的新工藝，對熱處理工藝進一步優(yōu)化，在酶最適條件下依次加入酸性蛋白酶和纖維素酶，提油率可達到91.0%。

以酶法加工天然產物，大多在乳液體系中進行， Tano-Debrah等[6-7]研究了可可豆乳液及牛油果乳液酶解提取油脂工藝。Sengupta等[8]研究了米糠與芥菜籽水酶法提油的方法。劉志強等[9]在花生蛋白乳液中酶法提取蛋白質及油脂。趙大慶等[10]研究了榛子仁乳液分離蛋白酶解提取油脂的工藝，并采用正交實驗對工藝進行優(yōu)化。趙國華[11]、肖凱軍[12]等分別研究了酶解玉米蛋白及大豆分離蛋白乳液對其性能的改善。以上研究中，涉及了工藝條件對酶促反應速率的影響，但乳液顆粒度對酶促反應速率的影響卻未展開研究。因此，研究乳液顆粒度對酶促反應速率的影響具有非常必要的意義。

本文以1398中性蛋白酶在大豆乳液中的酶解反應為例，開展了乳液顆粒度對酶解反應速率影響的研究工作?？疾?0～200 目的大豆乳液對酶促反應速率影響，根據反應起始至6 h內的實驗數據，擬合各時間段中乳液顆粒度與反應速率的關系式，以期指導和優(yōu)化大豆水相酶法提取大豆油的工藝。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大豆：市售(浙江產)，水分12.4%，粗脂肪18.6%，粗蛋白質40.5%。1398中性蛋白酶：食用級，酶活120 000 U/g，無錫酶制劑廠。HH5214-B型電熱恒溫水浴鍋，ZF40型自分離磨漿機，pH-2型酸度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆乳液制備

大豆粗粉碎至20目，固液比為1∶4，調pH為9.0，在50 ℃浸泡1.5 h，水磨，調節(jié)不同磨漿細度，以80～200目的篩網壓濾，濾渣用大豆等質量的水沖洗并壓濾，沖洗兩次，濾液合并，得不同顆粒度的乳液，其中固形物含量最終均控制為8.57%。

1.2.2 不同顆粒度對乳液體系中酶促反應速率的影響

不同顆粒度的大豆乳液按1398中性蛋白酶在大豆乳液中酶解的最佳條件，即調pH為7.0，1398中性蛋白酶加酶量為120 U/mL，在溫度45℃的水浴條件下反應，在不同的時間段可測得對應的蛋白質水解度，通過公式求得酶促反應速率[13]，反應速率的變化可通過考察顆粒度體現(xiàn)。

1.2.3 大豆乳液固形物含量的測定

大豆乳液的固形物含量按每100 mL溶液中含有多少克干固物表示，固形物質量由烘干后重量法測得。

1.2.4 蛋白質水解度的測定

水解度的測定采用文獻[14]的方法。

水解度=游離—NH2的含N量/樣品總含N量×100%，游離—NH2含N量測定可用甲醛滴定法[15]，采用凱氏定氮法測定樣品總含N量。

2 結果與討論

2.1 乳液顆粒度對酶促反應速率的影響

按照1.2.2實驗方法，酶解固形物含量相同但顆粒度不同的大豆乳液，反應持續(xù)6 h，在不同酶解時間條件下，蛋白質水解度及通過水解度計算相應的酶促反應速率，結果分別見圖1、圖2。

圖1 不同顆粒度乳液在不同酶解時間下的水解度

圖2 乳液顆粒度對酶促反應速率的影響

由圖1可知，在80～160目范圍內，單位時間內乳液蛋白的水解度隨著乳液顆粒度的減小而增加。超過160目之后的乳液，在條件不變的情況下，其蛋白質水解度并未明顯提高。說明乳液顆粒大小達到一定程度后，蛋白質水解反應速率趨勢穩(wěn)定。隨著反應時間延長，進一步提高了蛋白質的水解度。酶解時間在4 h以上，顆粒較小的乳液其蛋白質水解度變化不大，而顆粒較大的乳液蛋白質水解度提高速度增加。這可能是因為在酶解4 h后，因酶解破壞了顆粒較大固形物的結構，從而更有利于酶解反應的進行。

實驗中，反應體系中固形物含量和酶用量是一致的，按照米氏方程的描述，反應速率在此相同條件下是一樣的。不過圖2結果所示，乳液顆粒度不同而固形物含量相同的乳液，在酶解時間一樣的情況下，相應的酶促反應速率有很大的差異，表明酶促反應速率受乳液顆粒度的影響很大。在反應5 h之內基本呈現(xiàn)的是顆粒度越小，酶促反應速率越大的趨勢。但顆粒度達160目以后，隨著顆粒度的減小反應速率的提高速度趨于平緩甚至有些出現(xiàn)下降趨勢。不同反應時間段，乳液顆粒度對反應速率的影響也不一樣，80目的乳液體系在3 h內反應速率逐漸加快，之后減慢；顆粒度100目的乳液體系開始4 h左右反應速率逐漸下降，隨后又緩慢上升；而顆粒度120目以上的體系反應速率是隨反應進行而逐步變慢。在反應初始階段，由于酶解作用，顆粒度較大的乳液顆粒結構被破壞，反應接觸面積增加，加快了速率，隨后因酶受抑制及失活等原因占主導，引起反應速率下降，隨著反應進一步進行，顆粒結構進一步被破壞，反應速率又緩慢回升。而顆粒較小的乳液反應速率隨反應的進行由于酶抑制及失活等原因逐漸下降，與溶液體系類似。

2.2 不同反應時間段乳液顆粒度對酶促反應速率影響的基本規(guī)律

本實驗探究在5 h內，隨著酶解時間變化，酶促反應速率受乳液顆粒度影響，且具有一定的變化規(guī)律，具有指導實際應用的作用。實驗值曲線由圖2中5 h內不同顆粒度對酶促反應速率影響所知，擬合在不同反應時間段下，乳液顆粒度與反應速率的關系式y(tǒng)=y0+a×e(80-x)/49.3，式中：x為固形物顆粒度(目)；y為酶促反應速率，μmol/min；y0、a分別為與酶解時間相關的常數。

不同時間段乳液顆粒度對反應速率關系式曲線與實驗值比較結果見圖3。

由圖3(a)、(b)可知，酶解時間在1 h之內，由于時間較短，乳液中固形物顆粒結構并未被顯著破壞，顆粒度對反應速率影響的擬合關系式與實驗值能較好符合；而圖3(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)表明在反應較長時間后，即酶促反應在1～4 h間，擬合關系式與實驗值有一定的偏差。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是反應開始乳液的固形物顆粒結構具有一定的破壞；由圖3(i)、(j)可知，在反應4～5 h范圍內，酶解時間過長，固形物顆粒基本被破壞完全，其對反應速率的影響理論值和實驗值也能夠較好符合。

圖3 乳液顆粒度影響酶促反應速率的實驗值與擬合方程曲線

3 結 論

(1)乳液顆粒度對乳液體系中酶促反應速率有重要的影響，酶解時間越短，不同顆粒度乳液的反應速率相差越大。在80～160目范圍內，隨著目數增加，即顆粒度變小，反應速率增加。160目以上并無顯著的影響。

(2)不同酶解時間段，其反應速率受顆粒度的影響有一定差異，在反應開始的1 h內及4～5 h，顆粒度對反應速率影響的規(guī)律較一致，而反應時間在1～4 h間，又有相似的影響規(guī)律。酶解時間在1 h之內以及在4～5 h范圍內，其擬合關系式與實驗值具有較好的吻合。酶解時間在4 h以上，顆粒較小的乳液其蛋白質水解度變化不大，所以可選擇蛋白酶水解乳液時間為4 h。此實驗得出的結論對于指導和優(yōu)化水相酶法提取大豆油和大豆蛋白的酶解實驗具有重要意義。

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Effectofparticlesizeofemulsiononenzymatichydrolysisreactionof1398neutralprotease

YU Ming, QIAN Junqing, GONG Feng, GUO Hui
(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

The effect of particle size of emulsion on the reaction velocity of 1398 neutral protease hydrolyzing soybean emulsion was studied. The enzymatic hydrolysis reaction of 1398 neutral protease was carried out at 45℃, pH 7.0 and enzyme dosage 120 U/mL (based on emulsion). It was found that the reaction velocity increased with particle size increasing from 80 to 160 meshes (particle size decreasing), and the reaction velocity of 200 meshes emulsion was approximate with 160 meshes emulsion. According to experimental data of velocity change with particle size from reaction beginning to 5 h, the equation of particle size of emulsion with reaction velocity in different reaction time was fitted. Comparing the equation curve with experimental data, the law of particle size of emulsion influencing on reaction velocity in 1 h was consistent with that in 4-5 h, while it was different from that in 1-4 h. Based on the fitted formulas, it could direct and optimize the process of extraction of oil from soybean by aqueous enzymatic method.

protease; reaction velocity; particle size; soybean emulsion; aqueous enzymatic method

2016-12-21;

2017-06-22

俞 明(1991)，男，碩士研究生，研究方向為油脂、酶催化(E-mail)yuba23@sina.com。

錢俊青，教授，博士生導師(E-mail)302015815@qq.com。

TS229;TS206

A

1003-7969(2017)10-0043-04