陳亮 ，汪啟斌 ，董榮坤 ，黃建朋 ，汪彪 ，張健 ，王佩，甘云輝，張征，梁俊

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院 胃腸外科，湖北 十堰 442200；2.中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院 胃腸外科，廣東 深圳 518107）

潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血中IL-32表達(dá)水平及其意義

陳亮1，汪啟斌1，董榮坤1，黃建朋2，汪彪1，張健1，王佩1，甘云輝1，張征1，梁俊1

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院 胃腸外科，湖北 十堰 442200；2.中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院 胃腸外科，廣東 深圳 518107）

目的檢測潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者外周血中白細(xì)胞介素32（IL-32）表達(dá)水平，分析IL-32表達(dá)水平與UC嚴(yán)重程度的關(guān)系。方法入組50例UC患者（UC組，根據(jù)病情分為輕、中、重度）及30例健康體檢者（對照組），分別收集UC組和對照組患者的外周血，用Trizol提取外周血中淋巴細(xì)胞總RNA，實時聚合酶鏈反應(yīng)檢測IL-32 mRNA表達(dá)水平；用酶聯(lián)免疫吸附法檢測外周血中IL-32蛋白表達(dá)水平，比較兩組外周血中IL-32表達(dá)水平，以及輕、中、重度UC患者IL-32表達(dá)水平。結(jié)果UC患者外周血中IL-32 mRNA和蛋白表達(dá)水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；重度UC患者外周血中IL-32表達(dá)水平與輕、中度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論UC患者外周血中IL-32表達(dá)增高，IL-32可能參與UC的發(fā)病。

潰瘍性結(jié)腸炎；白細(xì)胞介素32；外周血

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是慢性、非特異性、腸道炎癥性疾病，病變主要累及乙狀結(jié)腸和直腸，亦可累及全部結(jié)腸，腸道炎癥常反復(fù)發(fā)生，易引起中毒性結(jié)腸擴張、癌變等并發(fā)癥，其發(fā)病機制尚未完全明確[1]。目前研究認(rèn)為，腸壁黏膜免疫調(diào)節(jié)異常、持續(xù)腸道感染及細(xì)胞因子等與UC的發(fā)病密切相關(guān)。白細(xì)胞介素32（Interleukin-32，IL-32）是一種促炎癥細(xì)胞因子，可以活化核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、激活子蛋白-1（activator protein 1，AP-1）、分裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK） 信 號通路誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素8（Interleukin-8，IL-8）等細(xì)胞因子表達(dá)，與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病的發(fā)病密切相關(guān)[2-4]。因此，本研究收集UC患者外周血標(biāo)本，檢測IL-32表達(dá)水平，分析其與UC患者病情嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013年9月-2014年9月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院消化內(nèi)科、胃腸外科診斷為UC的患者50例。其中，男性20例，女性30例；年齡20～65歲，平均（40.8±8.6）歲。UC的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《2010年世界胃腸病學(xué)組織關(guān)于炎癥性腸病診斷和治療的實踐指南》[5]制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。UC患者根據(jù)病情進行分級：輕度16例，中度20例，重度14。對照組30例為本院體檢中心體檢的健康居民。其中，男性14例，女性16例；年齡19～62歲，平均（40.2±7.8）歲。兩組患者在性別、年齡上比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 標(biāo)本收集

UC組和對照組于晨起采空腹肘靜脈血10 ml，取4 ml放入非抗凝干燥無菌真空管中，室溫靜置1 h自行凝固，1 300 r/min離心15 min，取上清液分裝于離心管內(nèi)，置于-80℃冰箱低溫冷凍保存。取6 ml放入含肝素的無菌抗凝管，F(xiàn)icoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個核細(xì)胞。

1.3 RNA提取及實時聚合酶鏈反應(yīng)

用Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）提取細(xì)胞總RNA，具體步驟按說明書操作。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Toyobo公司）將提取的細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按說明書操作。然后用實時聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）Faststart Universal SYBR Green Master（Rox）試劑盒（瑞士Roche公司）擴增，按說明書操作。擴增IL-32正向引物：5’-CGACTTCAAAGAGGGCTACC-3’，反向引物：5’-GAGTGAGCTCTGGGTGCTG-3’[6]。用β-actin作為內(nèi)參，應(yīng)用SYBR Green熒光染料進行real-time PCR反應(yīng)，獲得各組織標(biāo)本的擴增曲線，計算機分析Ct值?；贑t值來評估檢測樣品變化的相對值。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法

血清中IL-32蛋白表達(dá)水平用美國Biolegend公司的酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒檢測，具體步驟按說明書操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較用t檢驗，多組比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UC患者外周血中IL-32 mRNA表達(dá)增高

UC組IL-32mRNA表達(dá)水平為（3.07±0.29），對照組為（1.00±0.12），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.157，P=0.009），UC組IL-32 mRNA表達(dá)水平高于對照組。見圖1。

2.2 UC患者外周血中IL-32蛋白表達(dá)增高

UC組IL-32蛋白表達(dá)水平為（156.67±23.33）pg/ml，對照組為（48.337±4.41）pg/ml，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.562，P=0.010），UC組IL-32蛋白表達(dá)水平高于對照組。見圖2。

2.3 不同病情程度UC患者血清IL-32表達(dá)水平比較

輕度患者血清IL-32表達(dá)水平為（116.67±15.28）pg/ml，中度患者為（153.33±15.26）pg/ml，重度患者為（223.34±25.17）pg/ml，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=24.030，P=0.001），重度患者IL-32表達(dá)水平高于輕、中度患者。

圖1 兩組患者外周血中IL-32 mRNA表達(dá)水平（±s）

圖2 兩組患者外周血中IL-32蛋白表達(dá)水平（±s）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)UC患者外周血中IL-32表達(dá)水平升高，且IL-32表達(dá)水平隨著UC病情嚴(yán)重程度增加而升高。UC是一種炎癥性腸病，主要特點是直腸、乙狀結(jié)腸等反復(fù)發(fā)作的炎癥，可引起癌變、出血等并發(fā)癥，其發(fā)病機制尚未完全明確。目前研究認(rèn)為，免疫調(diào)節(jié)異常在UC發(fā)病中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，細(xì)胞因子表達(dá)異常與多種免疫性疾病的發(fā)病密切相關(guān)。比如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)腔中IL-32表達(dá)增高，與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病密切相關(guān)[4]。因此，筆者推測IL-32可能參與UC的發(fā)病。

IL-32是一種新發(fā)現(xiàn)的促炎癥細(xì)胞因子，可以通過活化NF-κB、AP-1、p38MAPK信號通路，誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等表達(dá)TNF-α、IL-6、IL-8及白細(xì)胞介素1β等細(xì)胞因子，而白細(xì)胞介素1β、TNF-α及干擾素-γ等細(xì)胞因子均可誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞等表達(dá)IL-32，相互影響導(dǎo)致腸內(nèi)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)活化，免疫調(diào)節(jié)異常，最終導(dǎo)致炎癥性腸損傷，發(fā)生炎癥性腸病[2-3，7-8]。

最新研究發(fā)現(xiàn)，腸上皮細(xì)胞表達(dá)IL-32，炎癥性腸病腸組織中IL-32表達(dá)升高，認(rèn)為促炎癥細(xì)胞因子IL-32可能涉及炎癥性腸病的發(fā)病[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，UC患者外周血中IL-32表達(dá)升高，且表達(dá)水平隨病情嚴(yán)重程度增加而升高，因此筆者認(rèn)為IL-32可能參與UC發(fā)病，筆者的研究進一步證實IL-32在UC發(fā)病中的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)UC患者外周血中IL-32表達(dá)升高，且IL-32表達(dá)水平隨著UC病情嚴(yán)重程度增加而升高，因此筆者認(rèn)為IL-32可能參與UC的發(fā)病。

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（童穎丹 編輯）

Expression of serum IL-32 level in patients with ulcerative colitis and its significance

Liang Chen1, Qi-bin Wang1, Rong-kun Dong1, Jian-peng Huang2, Biao Wang1,Jian Zhang1, Pei Wang1, Yun-hui Gan1, Zheng Zhang1, Jun Liang1
(1. Department of Gastrointestinal Surgery, Renmin Hospital of Hubei University of Medicine, Shiyan,Hubei 442200, China; 2. Department of Gastrointestinal Surgery, the Seventh Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Shenzhen, Guangdong 518107, China)

ObjectiveTo investigate serum IL-32 level in patients with ulcerative colitis (UC) and its relationship with the severity of UC.MethodsFifty UC patients (16 mild cases, 20 moderate cases and 14 severe cases) and 30 healthy controls were enrolled in the present study. Peripheral blood of the UC patients and the healthy controls was collected respectively. Total RNA in PBMCs was extracted by TRIzol Reagent. IL-32 mRNA expression level was detected by real-time PCR. IL-32 protein expression level in serum was assayed by ELSIA.Difference in IL-32 expression level between the UC and control groups was compared using student’sttest.Differences in IL-32 expression level among the mild, moderate and severe UC groups were compared using analysis of variance.ResultsSerum IL-32 expression level of the UC patients was higher than that of the healthy controls both at RNA and protein levels (P＜ 0.05). Serum IL-32 expression in the severe UC group was statistically higher than that in the moderate and mild UC groups, respectively (P＜ 0.05).ConclusionsSerum IL-32 expression in UC patients is increased. IL-32 might be involved in the pathogenesis of UC.Keywords: ulcerative colitis; IL-32; peripheral blood

R574.62

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.29.020

1005-8982（2017）29-0094-03

2016-03-07

黃建朋，E-mail：aiabao999@163.com