丁哲宇，杜鋒，王繼紅，甘晟，寸英麗

（云南省腫瘤醫(yī)院 腹部外科，云南 昆明 650000）

Bcl-2基因沉默對(duì)胃腺癌SGC-7901細(xì)胞5-Fu敏感性的影響*

丁哲宇，杜鋒，王繼紅，甘晟，寸英麗

（云南省腫瘤醫(yī)院 腹部外科，云南 昆明 650000）

目的探討B(tài)淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）基因沉默增強(qiáng)胃腺癌SGC-7901細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶（5-FU）敏感性的價(jià)值。方法設(shè)立人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞研究組和對(duì)照組，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測(cè)兩組人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞中Bcl-2 mRNA的表達(dá)。研究組采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的Bcl-2 siRNA序列至人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞，對(duì)照組不進(jìn)行干預(yù)。比較轉(zhuǎn)染前后兩組Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平。兩組均添加不同濃度5-FU，采用Annexin V標(biāo)記和流式細(xì)胞儀檢測(cè)48 h后兩組不同濃度5-FU細(xì)胞株的增殖抑制率和凋亡率。結(jié)果兩組轉(zhuǎn)染前Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與轉(zhuǎn)染前比較，研究組轉(zhuǎn)染后的Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，研究組轉(zhuǎn)染后的Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，研究組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率較高（P＜0.05）。結(jié)論Bcl-2基因沉默可增強(qiáng)胃腺癌SGC-7901細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性，抑制癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。Bcl-2基因沉默可能是改善胃腺癌5-FU療效的有效方法。

B淋巴細(xì)胞瘤-2；基因沉默；增強(qiáng)；胃腺癌；SGC-7901 細(xì)胞；5-氟尿嘧啶；敏感性

胃癌發(fā)病率和病死率較高，預(yù)后差，5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是其常用藥物[1-3]。然而化療藥物作用有限，常出現(xiàn)化療耐藥[4]。從基因水平上逆轉(zhuǎn)化療抵抗性可取得良好的效果[5]。而B淋巴細(xì)胞瘤-2（B lymphocyte tumor-2，Bcl-2）基因亦是與胃癌密切相關(guān)的因子[6]。因此，本研究分析Bcl-2基因沉默對(duì)胃腺癌SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制情況和細(xì)胞凋亡的影響，旨在為Bcl-2基因沉默改善胃癌5-FU化療敏感性提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞由上海細(xì)胞研究所提供。恒溫箱（江蘇佳美儀器有限公司），流式細(xì)胞儀（德國(guó)Partec公司），離心管、玻璃瓶、吸管、試管等購(gòu)自廣東東普醫(yī)療科技有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清（武漢博士德生物工程有限公司），RNA提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司），cDNA合成試劑盒（美國(guó)Promega公司），實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒和SYBR Premix EX Taq（日本TaKaRa公司），5-Fu（浙江海正藥業(yè)公司），MTT（美國(guó)Amersco公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（美國(guó)Amersco公司），脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染液 LipofectamineTM（美國(guó)Invitrogen 公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱、細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)SHELLAB公司，華東電子酶標(biāo)儀DG5033A（南京華東電子管廠），Bcl-2多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 設(shè)立人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞研究組和對(duì)照組，每組3個(gè)培養(yǎng)皿，分別標(biāo)記研究組50μg/ml、研究組 100μg/ml、研究組 200μg/ml、對(duì)照組 50μg/ml、對(duì)照組100μg/ml及對(duì)照組200μg/ml。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)皿含10%新鮮胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5%二氧化碳C02飽和濕度環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR） RT-PCR檢測(cè)兩組人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞中Bcl-2 mRNA的表達(dá)，收集細(xì)胞，棄上清液后提取總RNA，通過(guò)cDNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，其中Bcl-2 siRNA正向引物：5'-GUACAUCCAUUAUAAGCUGdTdT-3'，反向引物：5'-TdTdCAUGUAGGUAAUAUUCGAC-3'。以該cDNA為模版擴(kuò)增Bcl-2，采用兩步法，95℃預(yù)變性15 s，95℃變性 15 s，60℃退火 30 s，共 45 個(gè)循環(huán)，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 合成序列 選用廣州RIBIBIO公司化學(xué)合成的Bcl-2 siRNA序列，Bcl-2 siRNA靶序列為5'-GTACATCCATTATAAGCTG-3'。

1.2.5Bcl-2基因轉(zhuǎn)染 研究組細(xì)胞抽出原細(xì)胞液，添加RPMI 1640培養(yǎng)液80μl和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染液LipofectamineTM24μl，加入 30μl化學(xué)合成的 Bcl-2 siRNA，輕輕混勻。采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的Bcl-2 siRNA序列至研究組人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞，培養(yǎng)48 h。對(duì)照組不進(jìn)行干預(yù)，以RPMI 1640培養(yǎng)液80μl和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染液 LipofectamineTM24μl同期進(jìn)行培養(yǎng)48 h。

1.2.6 Bcl -2 mRNA的表達(dá) 再次行RT-PCR檢測(cè)，比較轉(zhuǎn)染前后兩組Bcl-2 mRNA的表達(dá)，方法同1.2.3。

1.2.7 細(xì)胞增長(zhǎng)抑制率的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，根據(jù)取樣培養(yǎng)皿標(biāo)記相應(yīng)培養(yǎng)板，在兩組對(duì)應(yīng)標(biāo)記的培養(yǎng)板中添加50、100和200μg/ml 5-FU，兩組另設(shè)空白對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后加入1 mg/ml MTT 1 ml。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入0.1 ml DMSO溶液，37℃孵育30 min，在華東電子酶標(biāo)儀DG5033A上自動(dòng)讀數(shù)，獲取波長(zhǎng)570 nm處的光密度（optical density，OD）值，以空白對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各組細(xì)胞增長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞增長(zhǎng)抑制率=（5-FU孔OD值-空白孔OD值）/空白孔OD值。

1.2.8 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，根據(jù)取樣培養(yǎng)皿標(biāo)記相應(yīng)培養(yǎng)板，在兩組對(duì)應(yīng)標(biāo)記的培養(yǎng)板中分別添加50、100和200μg/ml 5-FU。培養(yǎng)48 h后用0.25%胰蛋白酶處理2 min，800 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，PBS液洗滌2次，加入10 mg/ml RNAse溶液150μl，培養(yǎng)30 min后碘化丙啶50 ml染色，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后行Annexin V標(biāo)記，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)或析因設(shè)計(jì)的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組轉(zhuǎn)染前后Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

研究組轉(zhuǎn)染前Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量為與對(duì)照組比較，經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。研究組轉(zhuǎn)染后Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較，經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），研究組低于對(duì)照組。見(jiàn)表1。

表1 兩組轉(zhuǎn)染前后Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表1 兩組轉(zhuǎn)染前后Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組別 轉(zhuǎn)染前 轉(zhuǎn)染后研究組 0.872±0.106 0.113±0.103對(duì)照組 0.887±0.105 0.886±0.108 t值 0.985 50.749 P值 0.828 0.000

2.2 兩組細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率比較

研究組48 h不同濃度5-FU細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.927和6.433，P=0.000和0.016）。對(duì)照組48 h不同濃度5-FU細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.866和8.029，均P=0.000）。 兩 組 50、100和 200μg/ml 5-FU 均可取得較好的胃腺癌SGC-7901細(xì)胞抑制效果，50和100μg/ml 5-FU的抑制效果差異較大，而100和200μg/ml 5-FU的抑制效果差異不明顯，達(dá)100μg/ml后增加5-FU濃度對(duì)其細(xì)胞抑制效果影響不大。見(jiàn)表2和圖1～3。

表2 兩組細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率比較 （%，x±s）

圖1 兩組細(xì)胞增殖抑制率比較

圖2 兩組細(xì)胞凋亡率比較

圖3 兩組不同濃度5-Fu細(xì)胞凋亡情況

3 討論

近年來(lái)隨著生活方式的改變，各類消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生不斷增加。胃癌是臨床常見(jiàn)消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率高。然而由于早期癥狀不明顯，無(wú)特異性癥狀，早期診斷困難，多數(shù)患者出現(xiàn)癥狀確診時(shí)已為晚期，錯(cuò)過(guò)手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)，常需選取其他姑息治療方法[7-8]?；熓俏赴┦中g(shù)外的首選治療方法，而5-FU是其常用化療藥物，其在胃癌治療中的效果已得到多個(gè)臨床研究的認(rèn)可[9-10]。然而胃癌化療的特異性差，不良反應(yīng)較多，且容易發(fā)生化療藥物的耐藥[11]。從開發(fā)新藥的角度改善胃癌化療效果，已無(wú)法滿足臨床需求。尋找新的途徑改善胃癌5-FU化療效果，是目前臨床急需解決的難題。

近年來(lái)關(guān)于癌癥的研究中，基因?qū)W占據(jù)重要地位。有臨床研究致力于通過(guò)基因沉默等措施，增強(qiáng)癌癥化療藥物的敏感性，并取得一定的效果[12]。廉超等[13]研究發(fā)現(xiàn)，E2F轉(zhuǎn)錄因子沉默有助于提高人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，可能作為胃癌藥物治療的靶點(diǎn)之一。BOYER等[14]研究發(fā)現(xiàn)， siRNA轉(zhuǎn)染影響胰腺癌和肺癌的化療耐藥相關(guān)基因，有助于改善其化療效果。Bcl-2基因是細(xì)胞凋亡控制的關(guān)鍵基因，可保護(hù)細(xì)胞免受凋亡的基因，亦是與胃癌密切相關(guān)的基因[15]。倪志超等[16]采用RNA干擾沉默Bcl-2基因，觀察其對(duì)人黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的效果，研究結(jié)果顯示，Bcl-2 mRNA可顯著降低人黑素瘤M14細(xì)胞株Bcl-2蛋白表達(dá)，有效抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，Bcl-2基因靶向沉默亦可能對(duì)其5-FU化療敏感性有影響。然而，目前關(guān)于Bcl-2基因沉默增強(qiáng)胃腺癌SGC-7901細(xì)胞對(duì)5-FU敏感性的研究較少。

本研究采用化學(xué)合成的Bcl-2 siRNA序列，轉(zhuǎn)染至胃腺癌SGC-7901 細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bcl-2 siRNA序列轉(zhuǎn)染至胃腺癌SGC-7901細(xì)胞后，Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，Bcl-2 siRNA序列轉(zhuǎn)染至胃腺癌SGC-7901細(xì)胞可達(dá)Bcl-2基因沉默效果。分別對(duì)Bcl-2基因沉默和未對(duì)Bcl-2基因進(jìn)行沉默處理的胃腺癌SGC-7901細(xì)胞加入50、100和200μg/ml 5-FU，培養(yǎng)48 h后檢測(cè)其細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡情況。本研究結(jié)果顯示，50、100和200μg/ml 5-FU均可取得較好的胃腺癌SGC-7901細(xì)胞抑制效果，50和100μg/ml 5-FU的抑制效果差異較大；在一定濃度范圍內(nèi)增大5-FU用量有助于改善療效，而100和200μg/ml 5-FU的抑制效果差異不明顯，達(dá)100μg/ml后增加5-FU濃度對(duì)其細(xì)胞抑制效果影響不大；且經(jīng)Bcl-2基因進(jìn)行沉默處理的胃腺癌SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率及凋亡率更高，經(jīng)Bcl-2基因沉默可能成為改善胃癌5-FU化療效果的措施之一，且Bcl-2基因可能作為胃癌基因治療的靶基因之一。

綜上所述，Bcl-2 siRNA序列可有效沉默Bcl-2，而Bcl-2基因沉默可抑制癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)胃腺癌SGC-7901細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。Bcl-2基因沉默可能是改善胃腺癌5-FU療效的有效方法。

[1]亦磊, 葉星江. 核因子-κB及Bcl-2在胃癌組織中的表達(dá)及意義[J].廣東醫(yī)學(xué), 2014, 35(11): 1705-1707.

[2]PASQUINI G, VASILE E, CAPARELLO C, et al. Third-line chemotherapy with irinotecan plus 5-fluorouracil in caucasian metastatic gastric cancer patients[J]. Oncology, 2016, 91(6): 311-316.

[3]MURANAKA T, YUKI S, KOMATSU Y, et al. Efficacy and safety of bolus 5- fluorouracil and L-leucovorin as salvage chemotherapy for oral fluoropyrimidine-resistant unresectable or recurrent gastric cancer: a single center experience[J]. J Gastric Cancer, 2016,16(3): 177-181.

[4]李勇, 檀碧波, 范立僑, 等. 胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/阿霉素中miR-185的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞多藥耐藥性的影響[J]. 中國(guó)全科醫(yī)學(xué), 2015, 18(17): 2101-2104.

[5]鐘竹, 周偉, 吳小翎. 慢病毒介導(dǎo) STAT3-shRNA 對(duì)胃癌細(xì)胞化療敏感性的影響及機(jī)制[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 40(20):261-265.

[6]陳俊卯, 劉思洋, 吳景華, 等. 胃癌與癌旁組織中RACK1、Src和Bcl-2蛋白的表達(dá)及相關(guān)性研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2016, 45(19):2645-2647.

[7]黎伯培, 陳俊強(qiáng), 劉金祿, 等. 胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/5-FU的建立及其耐藥機(jī)制的初步探討[J]. 消化腫瘤雜志：電子版,2012, 4(3): 163-169.

[8]MAHLBERG R, LORENZEN S, THUSS-PATIENCE P, et al.New perspectives in the treatment of advanced gastric cancer:S-1 as a novel oral 5-FU therapy in combination with cisplatin[J].Chemotherapy, 2016, 62(1): 62-70.

[9]WANG B, WALSH S J, SAIF M W. Pancytopenia and severe gastrointestinal toxicities associated with 5- fluorouracil in a patient with thymidylate synthase (TYMS) polymorphism[J]. Cureus,2016, 8(9): DOI:org/10.1371/journal.pone e798.

[10]YAWATA K, OSADA S, TANAHASHI T, et al. The significant role of cyclin D1 in the synergistic growth-inhibitory effect of combined therapy of vandetanib with 5-fluorouracil for gastric cancer[J]. Anticancer Res, 2016, 36(10): 5215-5226.

[11]程燕, 哈斯其美格, 覃小珍, 等. 藏藥柳茶水提物對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞BGC823/5-FU增殖及藥物敏感性的影響[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2016, 41(4): 603-608.

[12]廉超, 楊杰, 王曉通, 等. E2F-1基因沉默對(duì)人胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/順鉑多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)[J]. 中華腫瘤雜志, 2014,36(3): 171-176.

[13]廉超, 楊杰, 王曉通, 等. E2F-1基因沉默可增強(qiáng)人胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/DDP對(duì)順鉑的敏感性[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013, 33(12): 1727-1732.

[14]BOYER C l, TEO J, PHILLIPS P, et al. Effective delivery of siRNA into cancer cells and tumors using well-defined biodegradable cationic star polymers[J]. Mol Pharm, 2013, 10(6):2435-2444.

[15]任磊, 周業(yè)江, 劉春鳳, 等. Bcl-2/Bid在胃癌的差異性表達(dá)與臨床意義[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 23(20): 51-54.

[16]倪志超, 烏新春, 孫立新, 等. RNA干擾沉默bcl-2基因?qū)θ撕谒亓黾?xì)胞生長(zhǎng)抑制研究[J]. 河北醫(yī)學(xué), 2009, 15(9): 1012-1015.

（童穎丹 編輯）

Impact of BCL2 gene silencing on 5-Fu sensitivity in gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells*

Zhe-yu Ding, Feng Du, Ji-hong Wang, Sheng Gan, Ying-li Cun
(Department of Abdominal Surgery, Yunnan Cancer Hospital, Kunming, Yunnan 650000, China)

ObjectiveTo explore the value of B cell lymphoma 2 (BCL2) gene silencing in enhancing 5-fluorouracil (5-FU) sensitivity in gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells.MethodsHuman gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells were set up as research group and control group. In the research group, chemicallysynthesizedBCL2siRNA sequence was transfected into gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells by liposome method;while the control group had no relative intervention. RT-PCR was applied in detection ofBCL2mRNA expression in gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells of the two groups before and after transfection. Both groups were added with different concentrations of 5-FU and tagged with Annexin V; 48 h after adding 5-FU fl ow cytometry was applied to detect cell proliferation inhibition rate and apoptosis rate.ResultsBefore transfection the relative expression ofBCL2mRNA had no statistical difference between the two groups (P＞ 0.05). The relative expression ofBCL2mRNA in the research group decreased after transfection compared to that before transfection and that in the control group(P＜ 0.05). After cell culture for 48 h, the proliferation inhibition and apoptosis rates of the research group were higher than those of the control group (P＜ 0.05).ConclusionsBCL2gene silencing can enhance 5-FU sensitivity in gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells, inhibit cancer cell proliferation and promote cancer cell apoptosis; therefore,BCL2gene silencing may be an effective way to enhance the effect of 5-FU therapy for gastric adenocarcinoma.

B cell lymphoma 2; gene silencing; enhance; gastric adenocarcinoma; SGC-7901 cell;5- fluorouracil; sensitivity

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.29.003

1005-8982（2017）29-0011-05

2016-10-15

昆醫(yī)聯(lián)合專項(xiàng)（No：2010CD179）

寸英麗，E-mail：cunying@medmail.com.cn