胡 志，馬 慧，范粉玲，劉文娟，謝 航

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院結構性心臟病科，陜西 西安 710061)

ROS/ALOX5/NLRP3信號通路激活在低氧所致肺動脈內皮增殖中的作用

胡 志，馬 慧，范粉玲，劉文娟，謝 航

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院結構性心臟病科，陜西 西安 710061)

目的考察ROS/ALOX5/NLRP3信號通路相關蛋白激活在低氧所致肺動脈內皮細胞增殖中的作用。方法將人肺動脈內皮細胞分別在常氧狀態(tài)(21% O2)和低氧狀態(tài)(1% O2)下培養(yǎng)24、48、72及96小時，同時低氧狀態(tài)下分別設立活性氧(ROS)清除劑Trolox組和ALOX5抑制劑齊留通組。采用CCK-8法檢測細胞增殖率的改變，活性氧探針H2-DCFA檢測低氧狀態(tài)下肺動脈內皮細胞內ROS的變化，Western blot法分別檢測低氧狀態(tài)及加入Trolox或齊留通干預后ALOX5、NLRP3和Caspase-1蛋白表達的變化。結果肺動脈內皮細胞在低氧作用48、72及96 h后可見增殖顯著，分別達(135.6±29.4)%、(185.3±21.7)%及(212.3±39.0)%。同時，細胞內ROS在24、48及72 h可檢測到顯著增加，96小時后基本恢復正常。ALOX5、NLRP3和Caspase-1蛋白隨低氧時間增加而表達增多。預先加入ROS清除劑Trolox和ALOX5抑制劑齊留通均可抑制NLRP3炎性小體相關蛋白NLRP3和Caspase-1的表達，且細胞增殖率也顯著降低。結論ROS/ALOX5/NLRP3信號通路在低氧所致的肺動脈內皮細胞增殖中顯著激活，抑制這一通路可顯著減少低氧所致的內皮細胞增殖。

肺動脈高壓；低氧；人肺動脈內皮細胞；NLRP3炎性小體；信號通路

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種以肺血管循環(huán)阻力增加、肺動脈壓力持續(xù)增高，進而誘發(fā)右心衰竭的高致死率和致殘率疾病，其病理生理改變以進展性肺動脈壓力升高和血管重建為特征[1]。目前雖然機制未明，但臨床PAH患者檢查發(fā)現，低氧所導致的肺泡血管內皮細胞和肺動脈內皮細胞功能不全、異常增殖在PAH的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用[2]。

低氧所誘發(fā)的肺動脈內皮細胞增殖機制較為復雜，新近研究資料表明，氧化應激和炎癥應答可導致血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)釋放，同時促進內皮細胞活化后釋放成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors，FGF)，進而改變肺部動脈血管微環(huán)境，從而促進肺動脈內皮細胞(pulmonary artery endothelial cells，PAEC)無序增殖，使肺動脈血管狹窄而誘發(fā)PAH[3]。但低氧是如何誘發(fā)肺動脈內皮增生，期間關聯的信號分子及機制還遠未闡明。

花生四烯酸5脂氧酶(arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX5)，可催化具有促血管增殖作用的白三烯類物質的生成。文獻報道，在PAH動物模型中發(fā)現，長期低氧可能伴隨ALOX5表達改變[4]。NLRP3，也被稱做NALP3(NACHT，LRR and PYD domains-containing protein 3)是由位于1號染色體長臂的NLRP3基因所編碼的重要炎癥小體，其在低氧所致的腫瘤細胞增殖中起重要作用[5，6]，但其對動脈內皮細胞的促增殖作用還不明確。由于 ROS生成，ALOX5表達及NLRP3激活在低氧導致的肺動脈內皮增殖中的作用尚不清楚，因此本研究試圖考察ROS/ALOX5/NLRP3信號通路相關蛋白在低氧所致肺動脈內皮細胞增殖中的變化規(guī)律，同時采用活性氧(ROS)清除劑Trolox組和ALOX5抑制劑齊留通來驗證這一通路抑制對內皮細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器CCK-8 檢測試劑盒購自美國Dojindo Molecular Technologies 公司；活性氧探針2’，7’-二氯熒光素二乙酸鹽(2’，7’-dihydrodichlorofluorescein diacetate，H2-DCFDA)購自碧云天生物技術研究所；低氧培養(yǎng)容器(Hypoxia Incubator Chamber購自加拿大Stemcell公司；ALOX5，NLRP3，Caspase-1及GAPDH抗體購自美國CST公司；Thermo MK3型酶標儀產地美國；Olympus IX53 倒置熒光顯微鏡產地日本。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人肺動脈內皮細胞(Human pulmonary artery endothelial cells，HPAEC)購自美國ScienCell實驗室。常規(guī)DMEM培養(yǎng)基含10%胎牛血清進行傳代培養(yǎng)，20代內用于實驗。

1.2.2低氧及藥物處理 HAPEC細胞正常培養(yǎng)條件為37 ℃和5% CO2，95% 空氣；低氧條件下，將HAPEC細胞置于Stemcell公司的低氧培養(yǎng)容器，培養(yǎng)條件為1% O2，5% CO2，94% N2。為考察ROS清除劑Trolox和ALOX5抑制劑齊留通對細胞增殖的影響，在進行低氧處置前，預先加入10 μmol/L 的Trolox和齊留通。

1.2.3細胞增殖率測定 將96孔板低氧及常氧狀態(tài)下培養(yǎng)的HAPEC細胞，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，37 ℃下室溫孵育2小時后，用酶標儀在450 nm下檢測吸光度值。檢驗結果重復三次取均值(n=3)。

1.2.4細胞內ROS檢測 細胞內總ROS測定采用ROS敏感的熒光探針H2-DCFDA進行反應標記。具體方法如下：HPAEC細胞進行ROS測定前，先用PBS液清洗2次，然后加入10 μg/ml的H2-DCFDA溶液按1∶500濃度稀釋，37 ℃孵育15 min后，PBS液清洗3次，去除殘留的反應液，488 nm下進行熒光激發(fā)，熒光分光光度計檢測OD值，檢驗結果重復三次取均值(n=3)。倒置熒光顯微鏡進行拍照記錄。

1.2.5Western Blot分析 將常氧或低氧狀態(tài)培養(yǎng)不同時間、不同藥物處理的HPAEC進行收集，加入細胞裂解液后進行蛋白定量。每組取20 μg蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉至PVDF膜。室溫下2%BSA封閉1小時，按不同稀釋倍數加入一抗(ALOX5，NLRP3，Caspase-1及GAPDH)，4 ℃ 封閉過夜后PBS清洗3次，加入1：1000稀釋的HRP標記二抗室溫孵育1小時，ECL顯色，常規(guī)膠片曝光。Image-Pro Plus Version 6.0 圖像分析軟件進行灰度分析。檢驗結果重復三次取均值(n=3)。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計分析。實驗結果均以均數±標準差表示，單因素方差分析(ANOVA)，組間比較采用t檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1低氧對肺動脈內皮細胞增殖率的影響肺動脈內皮細胞在低氧作用48、72和96小時后可見增殖顯著，增殖率分別達(135.6±29.4)%、(185.3±21.7)%和(212.3±39.0)%，與常氧對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義。見圖1。

圖1 低氧對肺動脈內皮細胞增殖率的影響(n=3) 與常氧組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

2.2低氧對肺動脈內皮細胞ROS生成的影響圖2 A為熒光分光光度法檢測肺動脈內皮細胞內ROS的生成變化(n=3)；圖2B為常氧組及低氧24、48、72及96小時ROS探針H2-DCFDA激發(fā)后的熒光照片。結果可見，低氧作用24、48及72小時可見細胞內ROS生成顯著增多，分別達(164.38±19.75)%、(196.31±36.02)%及(272.74±31.77)%，與常氧對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。見圖2。第96小時細胞內ROS基本恢復正常。

2.3低氧對肺動脈內皮細胞ROS/ALOX5/NLRP3信號通路相關蛋白表達的影響隨著低氧作用時間的延長，ALOX5蛋白在第48、72及96小時出現顯著上調，而炎癥小體相關蛋白NLRP3和Caspase-1的表達上調在早期(第24小時)已開始出現。見圖3。

圖2 低氧致肺動脈內皮細胞ROS生成增加 a：熒光分光光度法檢測肺動脈內皮細胞內ROS的生成變化(n=3)；b：常氧組及低氧24、48、72及96小時ROS探針H2-DCFDA激發(fā)后的熒光照片。與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

圖3 低氧對肺動脈內皮細胞ROS/ALOX5/NLRP3信號通路相關蛋白表達的影響 a：Western Blot法檢測低氧狀態(tài)下24、48、72及96小時后ALOX5、NLRP3和Caspase-1蛋白表達的變化，內參蛋白為GAPDH；b：Image-Pro Plus6.0軟件分析ALOX5蛋白表達量(n=3)；c：Image-Pro Plus6.0軟件分析NLRP3和Caspase-1蛋白表達量(n=3)。與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

2.4Trolox和齊留通對ROS/ALOX5/NLRP3信號通路蛋白的干預及對HPAEC增殖的影響圖4a為Trolox和齊留通對ROS/ALOX5/NLRP3信號通路蛋白的干預作用；圖4b為Trolox和齊留通對HPAEC增殖的影響。10 μmol/L的 Trolox和齊留通均能顯著下調ALOX5、NLRP3及Caspase-1蛋白的表達，且能抑制低氧所導致的肺動脈內皮細胞增殖。

3 討論

目前，人們對PAH的病理生理機制尚不明確。長期以來，低氧[7]、酸中毒[8]、肺動脈血管內皮增殖[9]及血管重塑所致的肺泡毛細血管循環(huán)阻力增加[10]均被認為是導致PAH的重要危險因素。近年來，隨著對PAH發(fā)病機制的深層次探索，低氧導致的氧化應激損傷、炎性通路激活[11]及誘發(fā)的內皮功能障礙逐漸成為新的研究熱點和潛在藥物作用靶標[12]。

肺血管內皮細胞(PVEC) 在正常生理狀態(tài)下，其增殖率和凋亡率之間維持著動態(tài)平衡，其數量的相對穩(wěn)定對維持血管正常結構與功能至關重要。但PAH發(fā)病中，低氧作為重要的危險因素可引起PVEC增殖率和凋亡率之間失衡，使PVEC數量增多，其產生的促血管生成物質VEGF、FGF及LTs等大量釋放，改變肺動脈血管微環(huán)境進而導致內膜和平滑肌增厚，使肺血管管腔出現明顯狹窄，表現為肺循環(huán)阻力持續(xù)增大，動脈壓力持續(xù)升高而發(fā)展為PAH[13]。

圖4 Trolox和齊留通對ROS/ALOX5/NLRP3信號通路蛋白的干預及對HPAEC增殖的影響 A：ROS清除劑Trolox和ALOX5抑制劑齊留通對ROS/ALOX5/NLRP3信號通路蛋白的干預作用；B：Trolox和齊留通對HPAEC增殖的影響(n=3)。與低氧組比較，##P < 0.01；與常氧組比較，**P < 0.01

近年的研究表明，低氧狀態(tài)除可促進低氧細胞內ROS生成外，還可能激活下游氧化應激和炎癥反應，其中誘發(fā)血管生長因子釋放的ALOX5蛋白及NLRP3炎癥小體的表達規(guī)律可能在PVEC增殖中扮演重要作用[14]。為進一步探索低氧誘導動脈內皮增殖的機制，本研究采用人肺動脈內皮細胞作為研究對象，在低氧作用48、72和96 h后可見其增殖顯著。同時，細胞內ROS在24、48、72 h顯著增加，ALOX5、NLRP3和Caspase-1蛋白隨低氧時間增加而表達增多。預先加入ROS清除劑Trolox和ALOX5抑制劑齊留通均可抑制NLRP3炎性小體相關蛋白NLRP3和Caspase-1的表達，且細胞增殖率也顯著降低。

本研究結果首先明確了在體外條件下，低氧可促進肺動脈內皮細胞增殖，伴隨出現細胞內ROS增多，同時細胞膜脂質調節(jié)關鍵蛋白ALOX5表達增加，炎癥蛋白NLRP3和Caspase-1激活，以上結果均說明，肺動脈內皮細胞在低氧條件下的增殖與氧化應激、炎癥和脂質代謝紊亂相關。ALOX5的增加可能通過旁分泌方式作用于肺小動脈內膜，引起內膜增厚以及介導新生血管的形成，由此產生明顯的肺血管重構。隨著病情的發(fā)展，將進一步誘發(fā)血管中膜和內膜增厚及血管彈性下降，引起血管阻力增加，肺細小動脈肌性化；NLRP3其介導的炎癥通路及下游Caspase-1的激活及白介素1β的釋放也與動脈內皮細胞炎癥反應及增殖關系密切。后續(xù)實驗中，我們在低氧體系中預先加入ROS清除劑Trolox和ALOX5抑制劑齊留通，恰好抑制了ROS/ALOX5/NLRP3信號通路，同時大大阻斷了內皮細胞增殖。因此，我們大致可以推論，ROS/ALOX5/NLRP3信號通路是調節(jié)動脈內皮增殖的重要機制之一。

目前改善內皮細胞功能紊亂的藥物，如內皮素受體拮抗劑、血管緊張素受體阻斷劑、血脂調節(jié)藥物等已經證明可一定程度改善PAH患者的病情，但由于這些藥物副作用較大，目前臨床上仍不能作為低氧性PAH的長期治療手段[15]。因此，尋找新的針對低氧性PAH的有效治療靶點和新藥物勢在必行。本研究結果提示，ROS/ALOX5/NLRP3信號通路在低氧所致的肺動脈內皮細胞增殖中顯著激活，抑制這一通路可顯著減少低氧所致的內皮細胞增殖，但這一信號通路的干預實驗尚需在PAH動物模型中驗證，其后續(xù)是否可作用藥物調控的靶點從而形成新的治療手段，還有待進一步深入研究。

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TheeffectofROS/ALOX5/NLRP3signalingpathwayonhypoxia-inducedpulmonaryarteryendothelialcellproliferation

HUZhi，MAHui，FANFen-ling，LIUWen-juan，XIEHang

(DepartmentofStructuralHeartDisease，TheFirstAffiliatedHospital，Xi’anJiaotongUniversity，Xi’an710061，China)

ObjectiveTo investigate the role of activation of ROS/ALOX5/NLRP3 signaling pathway in hypoxia-induced proliferation of pulmonary artery endothelial cells.MethodsThe human pulmonary arterial endothelial cells (HPAEC) were cultured in normoxia (21% O2) and hypoxia (1% O2) for 24，48，72 and 96 hours，respectively.At the same time，subsets of reactive oxygen species (ROS) scavenger，Trolox and ALOX5 inhibitor，Zileuton were set up.The CCK-8 method was used to detect the cell proliferation rate.The change of ROS level in HPAEC under hypoxia was detected by probe H2-DCFA.Western blot was used to detect the expression of ALOX5，NLRP3 and caspase-1 protein after intervention of hypoxia，Trolox and Zileuton，respectively.ResultsHPAEC were significantly proliferated at 48，72 and 96 hours after hypoxia，reaching (135.6±29.4)%，(185.3±21.7)% and (212.3±39.0)%，respectively.At the same time，intracellular ROS at 24-，48-and 72-hour was increased significantly and return to normal at 96 hour.The protein expressions of ALOX5，NLRP3 and caspase-1 were increased with the prolonged hypoxia time.Pretreatment with Trolox and Zileuton inhibited the expressions of NLRP3 and caspase-1 in the inflammasome，and the cell proliferation rate was decreased significantly.ConclusionROS/ALOX5/NLRP3 signaling pathway is significantly activated in hypoxia-induced proliferation of HPAEC，and inhibition of this pathway can significantly reduce hypoxia-induced endothelial cell proliferation.

Pulmonary arterial hypertension；Hypoxia；Human pulmonary artery endothelial cells；NLRP3 inflammasome；Signaling pathway

陜西省自然科學基礎研究基金面上項目(編號:2014JM2-8171)

R563

A

1672-6170(2017)06-0044-05

2017-07-21；

2017-09-22)