殷 燕， 任曉陽， 劉亞萍， 盧桂芳， 和水祥

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710061

以內(nèi)臟高敏感為靶點(diǎn)的腸易激綜合征大鼠模型評價(jià)研究

殷 燕， 任曉陽， 劉亞萍， 盧桂芳， 和水祥

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710061

目的以內(nèi)臟敏感性為靶點(diǎn)，評價(jià)比較慢性母嬰分離和急性冷束縛應(yīng)激腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)動物模型。方法分別采用慢性母嬰分離和急性冷束縛應(yīng)激方法建立動物模型，通過腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)、結(jié)腸黏膜超微特征、肥大細(xì)胞活化程度及結(jié)腸促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing factor，CRF)表達(dá)評價(jià)內(nèi)臟敏感性及致敏因素。結(jié)果慢性母嬰分離和急性冷束縛應(yīng)激方法均能模擬IBS內(nèi)臟高敏感和結(jié)腸動力特征，而慢性母嬰分離應(yīng)激組在高容量AWR評分、結(jié)腸黏膜超微特征改變、肥大細(xì)胞活化及結(jié)腸CRF表達(dá)中較急性冷束縛應(yīng)激組更具有顯著性差異。結(jié)論在以內(nèi)臟敏感性為靶點(diǎn)研究的IBS動物模型中，慢性母嬰分離造模方法更具有優(yōu)勢。

內(nèi)臟敏感性;母嬰分離;冷束縛;腸易激綜合征

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)是以反復(fù)發(fā)作的腹痛不適伴排便頻繁或糞便性狀改變的一種腸道疾病[1]。IBS發(fā)病機(jī)制目前仍未完全闡明，與內(nèi)臟敏感性增加、腸道動力異常、神經(jīng)內(nèi)分泌改變、腸道感染、遺傳因素、微生態(tài)異常及精神心理應(yīng)激等多種因素相關(guān)[2]。

內(nèi)臟高敏感是內(nèi)臟對生理性刺激感受閾值降低或?qū)π源碳し磻?yīng)增強(qiáng)而引起疼痛不適的表現(xiàn)，是IBS的核心特征[3]，因此,內(nèi)臟敏感性增加是評價(jià)IBS動物模型是否成功的重要標(biāo)準(zhǔn)，建立客觀、公認(rèn)、符合臨床特征的內(nèi)臟高敏感動物模型對研究IBS發(fā)病機(jī)理具有重要意義。目前認(rèn)為，精神心理應(yīng)激在內(nèi)臟高敏感的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用[4]，新生期反復(fù)多次母嬰分離作為一種生命早期負(fù)性生活事件，可能引起成年后的應(yīng)激反應(yīng)受損[5]；冷束縛應(yīng)激作為經(jīng)典的一種急性應(yīng)激，在短時(shí)間內(nèi)形成精神創(chuàng)傷可誘發(fā)機(jī)體反應(yīng)過度，因此在本研究中，通過比較急慢性精神心理應(yīng)激對內(nèi)臟敏感性的作用及致敏因素，評價(jià)不同應(yīng)激方式的造模效力，獲得以內(nèi)臟敏感性為靶點(diǎn)進(jìn)行研究的IBS動物模型優(yōu)勢方案。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級新生SD大鼠10只，SPF級SD成年大鼠20只，雌雄不拘，2個月齡，體質(zhì)量(190±50)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供，飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心屏障環(huán)境(SPF級)中。環(huán)境溫度為20～25 ℃，相對濕度50%～70%，12 h光照-黑暗時(shí)間交替，自由進(jìn)食、飲水，按照實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷，所有操作措施獲得西安交通大學(xué)動物倫理委員會許可。

1.2試劑與儀器逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司，目的因子引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司設(shè)計(jì)并合成，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物模型制備：(1)慢性母嬰分離動物模型：隨機(jī)選擇新生SD大鼠以出生第1天作為起點(diǎn)，與母鼠共同飼養(yǎng)在同一鼠籠，從出生第2天起至第21天，每天9∶00～12∶00與母鼠分離3 h，分離時(shí)與母鼠處在同一房間不同籠中，不能看到母鼠，自出生第22天起徹底分離，單籠飼養(yǎng)，2個月齡即可用于實(shí)驗(yàn)。(2)急性冷束縛應(yīng)激動物模型: 隨機(jī)選擇正常2個月齡SD大鼠，給予寒冷-束縛應(yīng)激，即用膠帶束縛大鼠前肩、上肢和胸部，限制其前肢搔抓頭部，但不限制其他活動，并置于4 ℃冰水中2 h，2 h后將大鼠隨機(jī)單籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。正常對照大鼠僅予單籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。

1.3.2 結(jié)腸動力評估：對直腸內(nèi)玻璃小球排出時(shí)間和糞便顆粒、質(zhì)量測定進(jìn)行結(jié)腸動力評估。玻璃小球排出時(shí)間：實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，自由飲水，乙醚麻醉后，取直徑3 mm的玻璃小球放入距肛門約3 cm的直腸內(nèi)，并將大鼠迅速移至代謝籠中，待蘇醒后開始喂水，同時(shí)計(jì)時(shí)，記錄每只大鼠直腸內(nèi)玻璃小球的排出時(shí)間。糞便顆粒和質(zhì)量測定：實(shí)驗(yàn)前將大鼠移入代謝籠，充分適應(yīng)環(huán)境后，在代謝籠下墊干凈白紙一張，并開始計(jì)時(shí)，測定每只大鼠72 h的糞便顆粒和質(zhì)量，在整個測定過程中自由進(jìn)食飲水。

1.3.3 內(nèi)臟敏感性評估：通過觀察大鼠腹壁撤退反射進(jìn)行內(nèi)臟敏感性評估。實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，自由飲水，乙醚麻醉后放入自制的圓柱形大鼠固定器中，使大鼠只能上下運(yùn)動，無法前后活動及轉(zhuǎn)身，并用球囊進(jìn)行直腸擴(kuò)張，球囊和導(dǎo)管外涂石蠟油潤滑，使球囊末端距肛門約1 cm，并用膠帶將導(dǎo)管與鼠尾根部固定。待大鼠清醒并能適應(yīng)環(huán)境后，向球囊中分別注入1 ml、2 ml和3 ml生理鹽水(26～28 ℃)擴(kuò)張球囊。腹壁撤退反射的評分標(biāo)準(zhǔn)[4]： 0分：給予擴(kuò)張刺激時(shí)大鼠的情緒基本穩(wěn)定；1分：給予擴(kuò)張刺激時(shí)大鼠變得相對不穩(wěn)定，偶爾扭動頭部；2分：腹背部肌肉輕微收縮但腹部未抬離地面；3分：腹背部肌肉強(qiáng)烈收縮并把腹部抬離地面；4分：腹部肌肉強(qiáng)烈收縮，腹部呈弓形并把腹部、會陰部抬離地面。

1.3.4 結(jié)腸組織病理評估：大鼠以質(zhì)量濃度為100 g/L水合氯醛按體質(zhì)量300 mg/kg經(jīng)腹腔麻醉后迅速斷頸處死，提取大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，用PBS沖洗后依次行固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片處理，行HE染色在顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜的形態(tài)。

1.3.5 結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)評估：大鼠麻醉處死后，提取大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織以戊二醛進(jìn)行固定，依次脫水、浸透、包埋、超薄切片處理，采用透射電鏡觀察大鼠結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)特征。

1.3.6 結(jié)腸促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing factor，CRF)表達(dá)評估：取大鼠結(jié)腸組織，按RNA提取試劑盒說明提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。據(jù)NCBI Genebank中大鼠基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，上游：5′-CCAGCAACCTCAGCCGATTC-3′,下游：5′-GCCATTTCCAAGACTTCCCTCAG-3′。β-actin引物：上游：5′-CTATCGGCAATGAGCGGTTCC-3′,下游：5′-TGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG-3′。進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR循環(huán)結(jié)束后，分別通過溶解曲線與瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的特異性與一致性。讀取Ct值，采用2-△△Ct計(jì)CRF mRNA的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1一般情況實(shí)驗(yàn)期間，急性冷束縛應(yīng)激組大鼠死亡1只，慢性母嬰分離應(yīng)激組幼鼠死亡2只，正常對照組死亡1只，存活大鼠生長、發(fā)育情況良好。

2.2腸道動力評估

2.2.1 直腸內(nèi)玻璃小球排出時(shí)間評估：采用直腸內(nèi)玻璃小球排出時(shí)間進(jìn)行結(jié)腸蠕動功能評估，與正常對照組大鼠相比，急性冷束縛組大鼠及慢性母嬰分離組大鼠置入直腸的小球排出時(shí)間明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

注：與正常對照組比較，*P<0.05。

2.2.2 糞便顆粒和質(zhì)量評估：從糞便形狀上觀察，急性冷束縛組及慢性母嬰分離組較正常對照組糞便顆粒體積減小，但未見明顯的稀糊或稀水樣便。從糞便顆粒計(jì)數(shù)上觀察，急性冷束縛組及慢性母嬰分離組較正常對照組糞便顆粒數(shù)明顯增加(P<0.05)，但慢性母嬰分離組與急性冷束縛組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖2A)。從糞便質(zhì)量上觀察，急性冷束縛組及慢性母嬰分離組與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖2B)。

注：與正常對照組相比，*P<0.05圖2 大鼠糞便顆粒和質(zhì)量比較Fig 2 Comparison of fecal particle size and weight in rats

2.3內(nèi)臟敏感性評估隨著擴(kuò)張球囊注入生理鹽水容量增加，AWR評分逐漸增加，當(dāng)給予2 ml容量擴(kuò)張時(shí)，急性冷束縛組及慢性母嬰分離組較正常對照組評分明顯升高(P<0.05)，當(dāng)予3 ml容量擴(kuò)張時(shí)，慢性母嬰分離組較急性冷束縛組評分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.4結(jié)腸組織病理評估大鼠結(jié)腸組織行HE染色，顯微鏡下各組大鼠的結(jié)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，僅有少量的中性粒細(xì)胞浸潤，均未見明顯充血、水腫、糜爛、潰瘍等改變，各組間比較無顯著性差異(見圖3)。

表1 各組大鼠在不同擴(kuò)張容量下AWR評分比較Tab 1 Comparison of the AWR score of rats in different expansion capacity (±s)

注：與正常對照組相比, *P<0.05；與急性冷束縛組相比, #P<0.05。

圖3 大鼠結(jié)腸組織病理(200×) A: 正常對照組；B: 慢性母嬰分離組；C：急性冷束縛組

2.5結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)評估大鼠結(jié)腸組織行透射電鏡檢查，正常對照組大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞和微絨毛排列整齊，形態(tài)正常，胞膜完整，細(xì)胞間隙緊密。與正常對照組相比，慢性母嬰分離組大鼠結(jié)腸微絨毛分布不規(guī)整，可見斷裂而呈鋸齒樣改變，杯狀細(xì)胞包膜完整，游離面開口于管腔方向，細(xì)胞內(nèi)的黏液泡及其分泌明顯增加，呈分泌旺盛狀態(tài)。與母嬰分離組相比，急性冷束縛應(yīng)激組大鼠結(jié)腸黏膜腸微絨毛分布規(guī)整，較少見斷裂，杯狀細(xì)胞完整，其中分泌顆粒排列相對整齊，少量黏液泡形成(見圖4)。

肥大細(xì)胞作為腸道黏膜免疫細(xì)胞，活化后可以釋放大量炎癥介質(zhì)導(dǎo)致內(nèi)臟敏感性升高。正常對照組大鼠結(jié)腸黏膜中肥大細(xì)胞胞質(zhì)中高密度的分泌顆粒較少，未見空泡形成，而慢性母嬰分離組大鼠結(jié)腸黏膜肥大細(xì)胞胞質(zhì)中充滿了高密度的分泌顆粒，可見空泡形成，呈活躍的脫顆粒狀態(tài)或處于脫顆粒前期的激活狀態(tài)。與慢性母嬰分離組相比，急性冷束縛組大鼠結(jié)腸黏膜中肥大細(xì)胞可見較多分泌顆粒，但無明顯空泡形成(見圖5)。

2.6結(jié)腸CRF表達(dá)改變CRF作為機(jī)體應(yīng)對應(yīng)激反應(yīng)重要的腦-腸肽，參與內(nèi)臟高敏感的形成。與正常對照組相比，慢性母嬰分離組和急性冷束縛組大鼠結(jié)腸CRF表達(dá)均明顯升高，且慢性母嬰分離組大鼠結(jié)腸CRF的表達(dá)較急性冷束縛組升高更為顯著(P<0.05，見圖6)。

注：▲示結(jié)腸黏膜微絨毛改變。圖4 大鼠結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)特征(20 000×) A: 正常對照組；B: 慢性母嬰分離組；C：急性冷束縛組 Fig 4 Ultrastructural features of colonic mucosa in rats (20 000×) A: normal control group; B: chronic maternal separation group; C: acute cold restraint stress group

注：↑示肥大細(xì)胞胞質(zhì)中的分泌顆粒。圖5 大鼠結(jié)腸黏膜肥大細(xì)胞(15 000×) A: 正常對照組；B: 慢性母嬰分離組；C：急性冷束縛組Fig 5 Colonic mucosal mast cells in rats (15 000×) A: normal control group; B: chronic maternal separation group; C: acute cold restraint stress group

注：與正常對照組相比，*P<0.05;

3 討論

目前普遍認(rèn)為，IBS患者與正常人比較,內(nèi)臟敏感性增加，表現(xiàn)為胃腸道疼痛閾值降低，對結(jié)腸球囊擴(kuò)張等各種刺激更敏感，是腹痛或腹部不適癥狀的主要原因[6]。精神心理應(yīng)激是誘發(fā)或加重內(nèi)臟高敏感的重要因素，研究[7]提示，與正常人對比，IBS患者發(fā)病時(shí)常伴隨緊張、焦慮、抑郁等精神癥狀，早期的負(fù)性生活事件對成年后的應(yīng)激反應(yīng)有著深刻的影響，因此采用精神心理應(yīng)激的造模方式成為IBS動物模型常用造模方法[8-9]。在本研究中以內(nèi)臟敏感性改變?yōu)榘邢?，比較慢性母嬰分離和急性冷束縛兩種不同應(yīng)激方式的造模效力。本研究中發(fā)現(xiàn)，慢性母嬰分離組與急性冷束縛應(yīng)激組較正常對照組大鼠AWR評分均明顯升高，隨著球囊擴(kuò)張容積的增加，慢性母嬰分離組較急性冷束縛組評分差異具有顯著性，提示急慢性心理應(yīng)激均能引起大鼠內(nèi)臟敏感性升高，且慢性母嬰分離應(yīng)激作用更顯著。本研究中同時(shí)觀察到急慢性應(yīng)激可以引起大鼠直腸內(nèi)玻璃小球排出時(shí)間延長，糞便顆粒計(jì)數(shù)增加，提示精神心理應(yīng)激促進(jìn)了結(jié)腸蠕動，符合腹瀉型IBS的結(jié)腸動力特征，且各組大鼠結(jié)腸組織病理染色均未發(fā)現(xiàn)潰瘍、水腫、出血等病變。綜合大鼠內(nèi)臟敏感性、結(jié)腸動力特征和結(jié)腸病理分析，慢性母嬰分離和急性冷束縛兩種應(yīng)激方式均能成功進(jìn)行IBS大鼠造模，且慢性母嬰分離應(yīng)激造模方法對內(nèi)臟敏感性改變更顯著。

臨床研究[10]發(fā)現(xiàn)，IBS患者腸鏡下光學(xué)表現(xiàn)和結(jié)腸組織病理學(xué)表現(xiàn)與健康對照相比并無顯著異常，而結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)卻發(fā)生改變，表現(xiàn)為腸黏膜微絨毛不規(guī)整、長短不一、杯狀細(xì)胞增加、上皮細(xì)胞間隙增寬等，這種腸道黏膜屏障損傷和通透性增加促進(jìn)了內(nèi)臟高敏感的發(fā)生。在本研究中采用急慢性心理應(yīng)激造模大鼠結(jié)腸HE染色均無水腫、潰瘍、出血等改變，但采用透射電鏡觀察可見微絨毛斷裂和杯狀細(xì)胞分泌旺盛表現(xiàn)，且以慢性母嬰分離組表現(xiàn)更為顯著，與臨床IBS患者的結(jié)腸黏膜的超微結(jié)構(gòu)特征相似。

肥大細(xì)胞是腸道中廣泛存在的炎癥免疫細(xì)胞，內(nèi)含大量內(nèi)分泌顆粒，激活后脫顆粒釋放五羥色胺、組胺、前列腺素、白三烯等介質(zhì)，作用于外周神經(jīng)，從而參與內(nèi)臟敏感性增加[11]。肥大細(xì)胞與IBS的關(guān)系密切，D-IBS患者結(jié)腸黏膜中肥大細(xì)胞數(shù)量較正常對照明顯增加，La等[12]發(fā)現(xiàn)，IBS患者內(nèi)臟敏感性增加伴隨著結(jié)腸黏膜肥大細(xì)胞脫顆粒現(xiàn)象增加，且在有效抑制肥大細(xì)胞脫顆粒后，內(nèi)臟敏感性較前有明顯下降。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，慢性母嬰分離應(yīng)激和急性冷束縛應(yīng)激大鼠結(jié)腸黏膜均可見充滿分泌顆粒的肥大細(xì)胞，且在慢性母嬰分離組大鼠結(jié)腸黏膜肥大細(xì)胞中可見較多的空泡形成，提示慢性母嬰分離應(yīng)激更易引起肥大細(xì)胞的活化，從而參與內(nèi)臟敏感性增加。

CRF廣泛分布于下丘腦室旁核等中樞神經(jīng)核團(tuán)和外周腸神經(jīng)系統(tǒng)中[13-14]，機(jī)體面對應(yīng)激時(shí)，CRF通過激活下丘腦-垂體-腎上腺軸或是直接作用于腸神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)答，產(chǎn)生包括結(jié)腸動力和內(nèi)臟敏感性的改變[15]。既往研究[16-17]發(fā)現(xiàn)，束縛應(yīng)激可以引起下丘腦室旁核CRF表達(dá)升高和內(nèi)臟敏感性增加，給予CRF受體拮抗劑后可以減輕LPS引起內(nèi)臟敏感性，這可能是通過抑制肥大細(xì)胞活化釋放炎癥因子和減輕腸道通透性實(shí)現(xiàn)的，提示CRF促進(jìn)內(nèi)臟敏感性增加。在本研究中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，慢性母嬰分離應(yīng)激和急性冷束縛應(yīng)激均能引起大鼠結(jié)腸CRF表達(dá)升高，但在慢性母嬰分離組中，CRF表達(dá)升高更為顯著，提示慢性母嬰分離可能通過影響結(jié)腸中CRF變化而引起腸神經(jīng)慢性致敏，促進(jìn)內(nèi)臟敏感性增加。

綜上所述，慢性母嬰分離與急性冷束縛應(yīng)激均能模擬IBS病理生理學(xué)特征，包括結(jié)腸動力紊亂和內(nèi)臟高敏感，但在內(nèi)臟敏感性評價(jià)中，慢性母嬰分離在高容量AWR評分、結(jié)腸黏膜完整性、肥大細(xì)胞活化程度及結(jié)腸CRF表達(dá)上均較急性冷束縛應(yīng)激改變更顯著，造模效力更高，且造模過程符合臨床IBS特征，因此在以內(nèi)臟敏感性為靶點(diǎn)進(jìn)行研究的IBS動物模型制作中更具優(yōu)勢。

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(責(zé)任編輯：陳香宇)

Researchofirritablebowelsyndromeratmodeltargetingonvisceralhypersensitivity

YIN Yan, REN Xiaoyang, LIU Yaping, LU Guifang, HE Shuixiang

Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China

ObjectiveTo evaluate the superiority to establish the irritable bowel syndrome (IBS) rat model between chronic maternal separation and acute cold restraint stress based on the visceral hypersensitivity.MethodsThe chronic maternal separation or acute cold restraint stress method were used to establish rat model. The visceral sensitivity and sensitization factors were evaluated by abdominal withdrawal reflex (AWR), colonic mucosal ultrastructure, mast cell activation, and colonic corticotropin-releasing factor (CRF) expression.ResultsBoth chronic maternal separation and acute cold restraint stress method could mimic the visceral hypersensitivity and colonic motility characteristics of IBS. There were significant differences of the high dosage AWR score, colonic mucosal ultrastructure changes, mast cell activation and CRF expression in chronic maternal separation group and acute cold restraint stress group.ConclusionChronic maternal separation stress has more advantages in establish IBS rat model targeting on visceral hypersensitivity.

Visceral sensitivity; Maternal separation; Cold restraint stress; Irritable bowel syndrome

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.11.017

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(2015gjhz22)

殷燕，博士，主治醫(yī)師，研究方向：胃腸激素和胃腸功能性疾病。E-mail：doctoryinyan@126.com

和水祥，博士，主任醫(yī)師，研究方向：胃腸功能性疾病、肝臟腫瘤機(jī)制的研究。 E-mail: hesx123@126.com

R574.4

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1006-5709(2017)11-1263-05

2017-03-07