楊 昊

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250000）

固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物源性食品獸藥殘留

楊 昊

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250000）

利用固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)喹諾酮類與青霉素類2類15種獸藥在動(dòng)物源性食品中的殘留情況進(jìn)行檢測(cè)。樣品經(jīng)丙醇-乙酸乙酯（5∶5）提取，由不經(jīng)活化的prime HLB固相萃取柱凈化，使用甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）作為流動(dòng)相，電噴霧離子源分段多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式檢測(cè)。15種獸藥檢出限為0.5～2.0 μg/kg，定量限為2.0～5.0 μg/kg，各基質(zhì)中回收率為71.3%～96.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～9.2%。采用此方法，能有效提高多殘留獸藥的檢測(cè)效率，可良好應(yīng)用于食品安全問(wèn)題中獸藥殘留的快速分析。

固相萃??；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；獸藥殘留；動(dòng)物源性食品

近年來(lái)，獸藥（含飼料藥物添加劑在內(nèi)）在畜牧業(yè)的應(yīng)用愈發(fā)廣泛，動(dòng)物性食品中的獸藥殘留現(xiàn)象亦日益發(fā)展為很多人共同關(guān)注的一個(gè)社會(huì)焦點(diǎn)[1]。

當(dāng)前，對(duì)違禁藥物予以非法使用、濫用抗菌藥物及藥物添加劑等行為均已成為我國(guó)動(dòng)物源性食品中獸藥殘留超標(biāo)、畜禽產(chǎn)品消費(fèi)不安全等的主要原因之一?；趯?duì)獸藥性質(zhì)差異明顯，當(dāng)前殘留分析大多采用類似于化學(xué)類結(jié)構(gòu)的同組藥物進(jìn)行相應(yīng)方法的開(kāi)發(fā)、多類殘留的同時(shí)檢測(cè)報(bào)道較少、檢測(cè)周期長(zhǎng)、成本高、效率低[2]等因素的考慮，為增加藥物分析的種類，滿足多類獸藥風(fēng)險(xiǎn)篩查與檢測(cè)工作的需求，應(yīng)加強(qiáng)現(xiàn)代農(nóng)藥檢測(cè)領(lǐng)域中關(guān)于不同類別農(nóng)藥多殘留問(wèn)題的檢測(cè)，完善檢測(cè)方法與基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)過(guò)程所用儀器包括：Qasis Prime HLB200mg/6ml固相萃取柱、Acquity UPLC液相色譜儀、Xevo TQ-S質(zhì)譜儀、Thermo XIR高速冷凍離心機(jī)、Milli Q超純水系統(tǒng)、GM200刀式研磨儀以及ENVI氮吹儀等。實(shí)驗(yàn)所用試劑有：甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純）以及15種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品（喹諾酮類12種、青霉素類3種）[3]。

1.2 樣品制備

為了滿足樣品的均質(zhì)[4]要求，需對(duì)其進(jìn)行去脂處理，以此為前提，稱取2.00 g樣品放入材質(zhì)為聚四氟乙烯的離心管中，加入10 mL乙酸鈉-乙酸緩沖液（濃度為0.2 mol/L，pH值為5.2），待其充分渦旋呈均質(zhì)狀態(tài)后，加入 50μL β-葡萄糖醛苷酶進(jìn)行振蕩酶解，保持溫度為 37 ℃，振蕩速度 200 r/min，整個(gè)酶解過(guò)程不能小于 6 h。完成酶解作業(yè)后，取出并將其冷卻至室溫水平，以1 000 r/min的速度進(jìn)行10 min渦旋，之后將所有的上清液取出來(lái)，放到一個(gè)新的離心管中，滴入氫氧化鈉溶液（濃度為10 mol/L）對(duì)其pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，直至達(dá)到11.0的水平。然后，加入異丙醇-乙酸乙酯溶液（滿足體積比為5:5）與飽和氯化鈉溶液各10 mL，完全渦旋提?。ㄔ摬僮鲿r(shí)間為10 min），以10 000 r/min的速度做離心處理，將分離后的上層有機(jī)相清液取出來(lái)，用氮?dú)獯蹈桑囟缺３衷?0 ℃）。最后，加入5 mL乙酸鈉-乙酸緩沖液對(duì)殘差進(jìn)行充分溶解，上柱。

用3 mL甲醇與3 mL水對(duì)柱后樣液（規(guī)格為25 mg/10mL）進(jìn)行活化處理，待其溶解后全部上柱，將流速控制在1滴/s，順序采用3 mL水、3 mL甲醇水溶液（濃度為60%）以及1 mL甲醇將MIP柱清洗干凈，之后，對(duì)其進(jìn)行真空負(fù)壓抽干處理，用2mL甲醇溶液洗脫，控制流速于1滴/s的水平上。

之后，對(duì)洗脫液進(jìn)行收集，用微弱氮?dú)饬鲗⑵浯蹈桑ū３譁囟仍?0 ℃），用1 mL初始比例流動(dòng)相復(fù)溶，過(guò)親水性聚丙烯膜（厚度為0.2 μm），待測(cè)。

表1 5種獸藥中代表性化合物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)與質(zhì)譜參數(shù)（簡(jiǎn)表）Table 1 The multi-reaction monitoring ions pairs and mass spectrometric parameters of representative compound in five veterinary drugs(simple list)

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

柱溫恒定為35 ℃；流速為0.45 mL/min；液相色譜柱為Water Acquity UPLC BEHC18；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相 B為乙酸銨水溶液（規(guī)格為 5 mmol/L，含0.1甲酸）；進(jìn)樣量為10μL。梯度順序如下：0～5 min，95%～80% B；0.5～10 min，80%～60%B；1.0～2.5 min，60%～40% B；2.5～3.0 min，40% B；3.0～3.5 min，40%～1% B；3.5～4.5 min，1% B；4.5～5.0min，1%～95% B；5.0～6.0 min，95% B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

選用電噴霧離子源（ESI），以正離子方式進(jìn)行掃描、動(dòng)態(tài)多反映監(jiān)測(cè)方式進(jìn)行監(jiān)察與測(cè)量（各質(zhì)譜掃描窗口為對(duì)應(yīng)化合物保留±0.5 min的時(shí)間），毛細(xì)管電壓為800 V，脫溶劑氣溫度與氣流量分別為450 ℃與800 L/h，錐孔氣流量150 L/h，霧化氣壓力7.0 bar。表1所示為其他相關(guān)參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

采用如上所述實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定后的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖1所示。

2.2 儀器與工作參數(shù)的選擇

以BEHC18超高效液相色譜柱為分離介質(zhì)，采用流動(dòng)注射方法，對(duì)移取的溶液分別在電噴霧正模式下進(jìn)行母離子與子離子兩種掃描，為提高靈敏度至最佳水平，還要對(duì)去簇電壓與碰撞氣電壓等參數(shù)予以優(yōu)化。以不同溶液作為流動(dòng)相，對(duì)化合物的分離情況、峰值以及響應(yīng)值大小進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：因接受正離子模式檢測(cè)，在流動(dòng)相中加入酸能夠?qū)π盘?hào)響應(yīng)予以增強(qiáng)，緩沖鹽的加入則有利于峰形的變化。所以，最終選擇的流動(dòng)相為甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液，其中，乙酸銨水溶液中含有0.1的甲酸。

圖1 15種獸藥的動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.1 The dynamic multi-response monitoring chromatogram of fifteen veterinary drugs

2.3 提取與凈化條件選擇

2.3.1 提取方式選擇

對(duì)于多殘留檢測(cè)，目標(biāo)化合物的前處理方式十分重要。此次試驗(yàn)中檢測(cè)的獸藥化學(xué)結(jié)構(gòu)普遍存在亞氨基等功能團(tuán)，容易溶于甲醇等極性溶劑中，在水溶液中通常呈現(xiàn)弱堿性。在取代集團(tuán)的作用下，化合物之間存在比較明顯的性質(zhì)差異，即使它們屬于同族藥物，pKa也會(huì)有較大的不同。舉例而言，硝基咪唑類化合物的pKa值通常在2.8～11.4之間，這說(shuō)明它有一些中性與偏酸性藥物，故樣品前處理難度會(huì)比較大。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了多種溶劑種類，并對(duì)搭配比例不同的處理效率進(jìn)行了對(duì)比分析。結(jié)果顯示，乙腈的提取效率較低，而乙酸乙酯與異丙醇對(duì)不同化合物的分配又各不相同，致使配比不同的情況下得到的提取效率也存在相應(yīng)的差異，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步考察，在綜合考慮所有化合物的前提下，做出以異丙醇-乙酸乙酯（5∶5）進(jìn)行提取的最終選擇。

2.3.2 固相萃取方式的選擇與優(yōu)化

由于目標(biāo)化合物有不同的極性，且對(duì)不同固相萃取柱的適應(yīng)性也存在差異，為在所有的化合物中予以應(yīng)用，所選擇的固相萃取柱應(yīng)符合極性吸附原理，經(jīng)凈化處理，不僅可以去除磷脂、蛋白質(zhì)等雜志，還能夠最小化凈化處理對(duì)化合物產(chǎn)生的負(fù)面影響。在HLB親水親脂平衡柱的基礎(chǔ)之上，Prime HLB會(huì)在相應(yīng)地增強(qiáng)干擾物的效果，同時(shí)，優(yōu)化篩板，避免堵塞狀況的出現(xiàn)。實(shí)現(xiàn)對(duì)不同親水親脂平衡柱進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果表明，prime HLB在降低雜質(zhì)干擾中的效果最為明顯，對(duì)于某種相對(duì)比的喹諾酮類、青霉素類化合物而言，會(huì)有更高的回收率。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)

從原理上看，液相色譜-質(zhì)譜分析中的基質(zhì)效應(yīng)不能完全消除[5]，一般會(huì)通過(guò)稀釋法、標(biāo)準(zhǔn)加入法、內(nèi)標(biāo)法、陰性基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)基質(zhì)效應(yīng)造成的誤差進(jìn)行修正或削弱。本實(shí)驗(yàn)采用優(yōu)化梯度洗脫程序與陰性基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)予以抵消。

表2 15種獸藥線性范圍、方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限表Table 2 The linearity range, equation, coefficient association, LOD and LOQ of fifteen veterinary drugs

2.4.2 線性關(guān)系與檢出限

依照以上條件，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)測(cè)定，在制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線之時(shí)，橫坐標(biāo)用以表示質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)則用于表示峰面積。結(jié)果顯示，接受檢測(cè)的獸藥在對(duì)應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性比較好。通過(guò)定量子離子的3倍信噪比進(jìn)行檢出限（LOD）的計(jì)算，10倍信噪比則用于定量限（LOQ）的計(jì)算，加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定，得到如表2所示結(jié)果。由表可知，獸藥 LOD 為 0.5～2.0 μg/kg，LOQ 為 2.0～5.0 μg/kg，靈敏度能夠?qū)?shí)際樣品檢測(cè)所需予以滿足。

2.4.3 回收率與重現(xiàn)性

在豬肉、魚(yú)肉中分別添加3個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)它們進(jìn)行6次回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，所測(cè)化合物在豬肉、魚(yú)肉中的回收率維持在71.3%～96.5%的水平內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.1%～9.2%的范圍內(nèi)，表明該方法的精密度較高，可對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)所需予以滿足。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

采用實(shí)驗(yàn)所用方法，對(duì)市場(chǎng)中銷售的豬肉、魚(yú)肉共 20份進(jìn)行快速篩查。與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GBT20366-2006及GBT21312-2007進(jìn)行比較，所得測(cè)定結(jié)果大體相同，這意味著該方法能夠應(yīng)用于動(dòng)物源食品中獸藥殘留的快速篩查與定量測(cè)定。

3 結(jié) 論

為預(yù)防、治療與診斷動(dòng)物疾病，或有目的地對(duì)動(dòng)物生理機(jī)能進(jìn)行調(diào)節(jié)，我國(guó)很多畜牧業(yè)經(jīng)營(yíng)企業(yè)都開(kāi)始使用多種類獸藥。消費(fèi)者在不知情的情況下食用動(dòng)物源性食品后，殘留在食品中的獸藥成分短期內(nèi)可能不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生影響，但長(zhǎng)期、大量的食用會(huì)對(duì)其肝、腎、心臟等器官造成巨大損傷[6]。為有效解決上述問(wèn)題，避免消費(fèi)者因食用含獸藥殘留類動(dòng)物源性食品而引致生理機(jī)能受損現(xiàn)象的發(fā)生，實(shí)驗(yàn)提出一種具體的檢測(cè)方法：固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)法，對(duì)豬肉、魚(yú)肉中15種獸藥的殘留情況進(jìn)行檢測(cè)。固相萃取法具有快速與簡(jiǎn)便優(yōu)勢(shì)，較之標(biāo)準(zhǔn)方法與已有報(bào)道，可減少活化、淋洗等耗時(shí)較多的環(huán)節(jié)，有效縮短樣品處理時(shí)間。經(jīng)驗(yàn)證，固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法在測(cè)定低限、回收率以及精密度等方面均能對(duì)殘留檢測(cè)需求予以滿足，在動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的檢測(cè)中適用性較高。

［1］郭德華，鄧曉軍，趙善貞，等.固相萃取-高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物源性食品中76種獸藥殘留[J].分析化學(xué)，2010（3）：318-324.

［2］陳剛，鄧曉軍，孫錦蘭，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中35種獸藥殘留量[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)，2014（7）：809-814.

［3］郝杰，姜潔，余建龍，等.固相萃取-超過(guò)效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中多種獸藥殘留[J].食品科學(xué)，2017（12）：266-272.

［4］郝杰，姜潔，邵瑞婷，丁學(xué)妍，史娜，路勇.分子印跡固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中11種β-受體阻斷劑殘留[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2016（10）：1278-1282.

［5］王京，王慶齡，葉佳明，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源食品中30種獸藥殘留[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2016（8）：955-960.

［6］朱捷，何微，馬桂娟.HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定補(bǔ)腎壯陽(yáng)類保健食品中非法添加11中化學(xué)藥成分[J].當(dāng)代化工，2015（11）：2729-2732.

Simultaneous Determination of Veterinary Drug Residues in Animal-origin Food by Solid Phase Extraction-Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

YANG Hao
（Shandong Food and Drug Inspection Institute,Shangdong Jinan 250101, China）

15 Kinds of veterinary drug residues in animal-origin food were detected by solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry. Samples were extracted by acetone-ethyl acetate, and were purified by a prime HLB solid phase extraction column. The eluate was detected by multiple reaction monitoring scanning with electronic spray ionization. The limits of quantitation for 15 veterinary drugs were in the range of 2.0～5.0 μg/kg, as well as the detection limits were 0.5～2.0 μg/kg. Recoveries from different food matrices were 71.3%～96.5% with relative standard deviations between 2.1%～9.2%. This method is significantly efficient in the determination of multiple veterinary drugs and suitable for rapid analysis of veterinary drugs.

Solid phase extraction; UPLC-MS/MS; Veterinary drug residue;Animal-derived food

O 657.63；O 657.7+2；O 658.2

A

1671-0460（2017）11-2386-03

2017-09-01

楊昊（1986-），男，山東省樂(lè)陵市人，工程師，研究方向：食品中農(nóng)藥獸藥殘留在液相色譜質(zhì)譜中檢測(cè)方法研究。