周麗云 李校天 李 麗 楊俊超 郭永澤

(056002) 河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科2 血液內(nèi)科3

1α,25-二羥維生素D3通過(guò)上調(diào)MiR-146a表達(dá)抑制肝星狀細(xì)胞活化*

周麗云1#李校天2&李 麗3楊俊超3郭永澤2河北工程大學(xué)1

(056002)河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科2血液內(nèi)科3

肝星狀細(xì)胞； 纖維化； 1α,25-二羥維生素D3； 微RNAs； MiR-146a

肝纖維化的形成是一個(gè)多因素、多細(xì)胞參與的復(fù)雜過(guò)程，涉及多種細(xì)胞和細(xì)胞因子的相互制約、相互作用，活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSC)在此過(guò)程中起關(guān)鍵作用[1-3]，因此抑制HSC活化成為延緩肝纖維化進(jìn)程甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要靶點(diǎn)。

微RNAs(miRNAs)是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度為18～25 nt的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物甚至單細(xì)胞生物體內(nèi)，參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[4]。以基因芯片和熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)對(duì)在靜息期與活化期HSC中差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，并聯(lián)合基因本體分析和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析明確相關(guān)miRNAs的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)有多個(gè)miRNAs參與了HSC的增殖、活化，可促進(jìn)或抑制肝纖維化發(fā)生、發(fā)展。

肝臟是維生素D3代謝的重要部位，1α,25-二羥維生素D3[1α,25-dihydroxyvitamin D3, 1,25(OH)2D3]是維生素D在體內(nèi)的最終活性形式，與體內(nèi)鈣和骨鹽的平衡密切相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3有一定的抗肝纖維化作用，對(duì)于其是否系通過(guò)影響HSC中的miRNAs表達(dá)而抑制HSC活化、增殖，進(jìn)而抑制肝纖維化進(jìn)展，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)從基因?qū)W角度出發(fā)，探討1,25(OH)2D3對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)激活的HSC中相關(guān)miRNAs表達(dá)的影響，旨在明確1,25(OH)2D3是否可通過(guò)調(diào)控miRNAs表達(dá)而抑制HSC活化，研究結(jié)果可為1,25(OH)2D3用于治療肝纖維化提供更多理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為臨床逆轉(zhuǎn)肝纖維化提供更多的藥物靶點(diǎn)和臨床治療思路。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

大鼠原代HSC-T6細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。TRIzolTM試劑、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Thermo Fisher Scientific)；qPCR試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；miR-146a mimic、miR-146a mimic陰性對(duì)照(miR-146a mimic NC)凍干粉、riboFectTMCP轉(zhuǎn)染試劑(廣州市銳博生物科技有限公司)；1,25(OH)2D3(Sigma-Aldrich Co.)；CCK-8試劑盒(同仁化學(xué)研究所)。

二、方法

1. qPCR篩選差異表達(dá)miRNAs、驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功、檢測(cè)1,25(OH)2D3干預(yù)對(duì)miR-146a表達(dá)的影響：通過(guò)文獻(xiàn)檢索，選取既往研究報(bào)道的在靜息期與活化期HSC中存在明顯差異表達(dá)的miRNAs，初步納入miR-146a、miR-30c、miR-193、miR-101、miR-200a五個(gè)miRNAs[5-8]，采用qPCR作進(jìn)一步篩選、驗(yàn)證。HSC長(zhǎng)至單層80%～90%時(shí)，更換無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基同步化細(xì)胞，然后以終濃度10 pmol/L TGF-β1活化細(xì)胞3 h，以不予TGF-β1處理的未活化HSC作為對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，以TRIzolTM試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以之為模板，采用SYBR Green Ⅰ行qPCR。各miRNAs特異性上游引物序列見(jiàn)表1，通用下游引物序列：5’-CTC AAC TGG TGT CGT GGA-3’；通用鼠源內(nèi)參U6引物序列：上游5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，下游5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。反應(yīng)條件：95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt法計(jì)算目的miRNAs相對(duì)表達(dá)量。

轉(zhuǎn)染是否成功的驗(yàn)證和1,25(OH)2D3干預(yù)對(duì)miR-146a表達(dá)影響的檢測(cè)，qPCR步驟同差異表達(dá)miRNAs篩選。

表1 候選miRNAs上游引物序列

2. MiRNA mimic轉(zhuǎn)染：miR-146a mimic和miR-146a mimic NC于使用前瞬時(shí)離心，以滅菌ddH2O配制成20 μmol/L儲(chǔ)存液，分裝保存。以30 μL 1×riboFectTMCP緩沖液稀釋1.25 μL miR-146a mimic或miR-146a mimic NC，輕輕混勻后加入3 μL riboFectTMCP轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹打混勻，室溫孵育0～15 min。將24孔板中HSC的培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，加入上述混合液，輕輕混勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

3. 細(xì)胞培養(yǎng)和分組：取HSC，使用含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每24～48 h換液一次。細(xì)胞長(zhǎng)滿至t25培養(yǎng)瓶中約80%～90%時(shí)，胰酶消化傳代，傳至3～4代時(shí)進(jìn)行細(xì)胞分組。實(shí)驗(yàn)設(shè)5個(gè)組別，分別予下述處理：①TGF-β1刺激組：終濃度10 pmol/L TGF-β1；②miR-146a mimic轉(zhuǎn)染組：50 nmol/L miR-146a mimic+10 pmol/L TGF-β1；③miR-146a mimic NC轉(zhuǎn)染組：50 nmol/L miR-146a mimic NC+10 pmol/L TGF-β1；④1,25(OH)2D3治療組：2.5×10-6mol/L 1,25(OH)2D3+0.1% DMSO+10 pmol/L TGF-β1；⑤DMSO對(duì)照組：0.1% DMSO+10 pmol/L TGF-β1。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。藥物濃度和培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定。

4. CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力：HSC接種于96孔板，每孔100 μL，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，按步驟3分組進(jìn)行干預(yù)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。干預(yù)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育約1 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度值(A值)。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(對(duì)照孔A值-空白孔A值)×100%。

5. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HSC，按步驟3分組干預(yù)24 h后，棄去培養(yǎng)基，胰酶消化細(xì)胞，以培養(yǎng)基輕輕吹打，4 ℃ 1 200 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗2次，以500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)目為5×105。以孔徑為40～50 μm 的300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μl PI，輕柔渦旋混勻，室溫避光孵育5 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、差異表達(dá)miRNAs

qPCR檢測(cè)顯示， HSC活化前后miR-146a相對(duì)表達(dá)量分別為1.523±0.085和0.507±0.012(P=0.039)，miR-101分別為1.117±0.115和0.810±0.056(P=0.401)，miR-30c分別為1.003±0.105和0.593±0.129(P=0.629)，miR-193分別為1.001±0.092和0.750±0.044(P=0.263)，miR-200a分別為1.340±0.053和0.927±0.081(P=0.267)(圖1)。5種miRNAs在活化HSC中的表達(dá)均有所下調(diào)，但僅miR-146a差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 活化與未活化HSC差異表達(dá)miRNAs篩選結(jié)果

二、 轉(zhuǎn)染成功與否驗(yàn)證和1,25(OH)2D3對(duì)miR-146a表達(dá)的影響

qPCR檢測(cè)顯示，miR-146a mimic轉(zhuǎn)染組HSC中的miR-146a相對(duì)表達(dá)量較miR-146a mimic NC轉(zhuǎn)染組顯著增高(33.72±4.79對(duì)0.41±0.12，P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功。1,25(OH)2D3治療組HSC中的miR-146a相對(duì)表達(dá)量較DMSO對(duì)照組顯著增高(4.53±0.73對(duì)0.35±0.11，P<0.05)，提示1,25(OH)2D3可上調(diào)miR-146a表達(dá)。

三、細(xì)胞存活率

CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，以TGF-β1刺激組HSC的細(xì)胞存活率作為參考值(100%)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，1,25(OH)2D3治療組和DMSO對(duì)照組HSC存活率分別為 62.77%±0.16%和83.32%±0.06%，miR-146a mimic轉(zhuǎn)染組和miR-146a mimic NC轉(zhuǎn)染組HSC存活率分別為53.50%±0.58%和93.32%±0.03%，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示1,25(OH)2D3可通過(guò)上調(diào)miR-146a表達(dá)抑制活化HSC增殖。

四、細(xì)胞凋亡率

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，TGF-β1刺激組、1,25(OH)2D3治療組、miR-146a mimic轉(zhuǎn)染組、miR-146a mimic NC轉(zhuǎn)染組和DMSO對(duì)照組HSC凋亡率分別為 6.26%±0.03%、13.40%±1.33%、19.07%±0.60%、5.36%±0.32%和7.13%±0.08%，1,25(OH)2D3治療組明顯高于DMSO對(duì)照組和TGF-β1刺激組，miR-146a mimic轉(zhuǎn)染組明顯高于miR-146a mimic NC轉(zhuǎn)染組和TGF-β1刺激組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)，提示1,25(OH)2D3可通過(guò)上調(diào)miR-146a表達(dá)促進(jìn)活化HSC凋亡。

A：1,25(OH)2D3治療組；B：DMSO對(duì)照組；C：miR-146a mimic轉(zhuǎn)染組；D：miR-146a mimic NC轉(zhuǎn)染組

圖2各組HSC細(xì)胞凋亡情況流式細(xì)胞分析

討 論

肝纖維化是慢性肝病進(jìn)展為肝硬化乃至肝細(xì)胞癌的必經(jīng)階段，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度沉積為其主要病理過(guò)程。HSC活化是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)[1-3]，可致ECM合成增加，因此抑制HSC活化對(duì)于肝纖維化的治療至關(guān)重要。盡管目前對(duì)肝纖維化可逆轉(zhuǎn)這一觀點(diǎn)已達(dá)成共識(shí)，但仍缺乏效果明確的逆轉(zhuǎn)藥物。MiRNAs是一類(lèi)廣泛存在于生物體內(nèi)的內(nèi)源性非編碼RNA，其表達(dá)具有明顯的組織特異性和時(shí)序特異性。成熟miRNA的種子序列(seed sequence)可與靶基因mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)互補(bǔ)結(jié)合，從而降解靶mRNA或抑制蛋白翻譯，參與調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)約1/3的基因表達(dá)。隨著分子生物學(xué)研究的深入，已發(fā)現(xiàn)miRNAs在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。近年研究顯示，miRNAs與HSC的增殖和凋亡密切相關(guān)，如miR-146a、miR-30c、miR-193、miR-101、miR-200a在活化HSC中的表達(dá)水平明顯下調(diào)，miR-146a下調(diào)可通過(guò)TGF-β/Smad4信號(hào)通路促進(jìn)HSC活化[5]；而miR-146a、miR-30c和miR-193過(guò)表達(dá)可使TGF-β誘導(dǎo)的HSC增殖顯著受抑[5-6]；miR-101可通過(guò)靶向抑制TGF-βⅠ型受體(TβRⅠ)及其轉(zhuǎn)錄激活因子KLF6抑制TGF-β1信號(hào)通路，進(jìn)而抑制HSC活化[7]；上調(diào)HSC中的miR-200a表達(dá)可在mRNA和(或)蛋白水平抑制其下游TGF-β2或β-catenin，從而影響HSC的活化和增殖[8]。本研究采用qPCR技術(shù)驗(yàn)證了上述5個(gè)miRNAs在TGF-β1誘導(dǎo)激活的HSC中的表達(dá)水平均低于靜息期HSC，其中miR-146a差異表達(dá)顯著(P<0.01)。MiR-146a位于人類(lèi)5號(hào)染色體LOC285628基因的第二外顯子，Baltimore的團(tuán)隊(duì)于2006年首先報(bào)道了該miRNA的生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)制[9]。隨后不斷有研究報(bào)道其與機(jī)體自身免疫之間有著錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，近年研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)變化與病毒復(fù)制、肝細(xì)胞再生、炎癥反應(yīng)甚至肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展亦有密切聯(lián)系。由此推測(cè)，某些具有抑制肝纖維化作用的藥物可能通過(guò)上調(diào)HSC中的miR-146a表達(dá)而抑制HSC活化。

1,25(OH)2D3是維生素D在體內(nèi)的最終活性形式，經(jīng)典作用為調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝。近年來(lái)，隨著研究的深入，1,25(OH)2D3所具有的免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移以及抗纖維化作用逐漸被揭示。Giangreco等[10]的體外實(shí)驗(yàn)和對(duì)腫瘤組織標(biāo)本的研究證實(shí)，1,25(OH)2D3可通過(guò)上調(diào)miR-100、miR-125b表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，得出前列腺癌患者可能受益于維生素D3的結(jié)論。另有1,25(OH)2D3通過(guò)調(diào)節(jié)miRNAs表達(dá)譜誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的報(bào)道[11]。Li等[12]的研究顯示，1,25(OH)2D3可通過(guò)下調(diào)miR-27b增加維生素D受體(VDR)表達(dá)，從而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，達(dá)到抑制肺纖維化進(jìn)程的目的。Abramovitch等[13]的實(shí)驗(yàn)研究顯示，1,25(OH)2D3對(duì)大鼠原代培養(yǎng)HSC具有抗增殖作用，在大鼠肝纖維化模型中可顯著減少ECM沉積。本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)1,25(OH)2D3對(duì)HSC具有明顯的抗增殖、促凋亡作用[14]；進(jìn)一步的動(dòng)物模型研究顯示，1,25(OH)2D3可顯著改善肝纖維化模型大鼠的肝組織炎癥，抑制纖維化進(jìn)程[15]。然而，關(guān)于1,25(OH)2D3抗肝纖維作用的具體機(jī)制，目前尚未完全明確。本研究對(duì)1,25(OH)2D3是否通過(guò)直接影響HSC中的miRNAs表達(dá)而發(fā)揮抑制活化HSC增殖并促進(jìn)其凋亡的作用進(jìn)行了探討。首先，研究通過(guò)重復(fù)既往實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-146a在TGF-β1誘導(dǎo)激活的HSC中表達(dá)顯著下調(diào)。進(jìn)一步將化學(xué)合成的具有模擬內(nèi)源性miR-146a作用的miR-146a mimic轉(zhuǎn)染入TGF-β1誘導(dǎo)激活的HSC，然后以qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功以及1,25(OH)2D3干預(yù)對(duì)miR-146a表達(dá)的影響，以CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡情況，結(jié)果顯示1,25(OH)2D3治療組HSC中的miR-146a表達(dá)較DMSO對(duì)照組顯著增高，1,25(OH)2D3治療組和miR-146a mimic轉(zhuǎn)染組HSC存活率分別較DMSO對(duì)照組和miR-146a mimic NC轉(zhuǎn)染組顯著降低，凋亡率則分別較相應(yīng)對(duì)照組顯著增高，與TGF-β1刺激組相比亦顯著增高。上述結(jié)果提示1,25(OH)2D3可通過(guò)上調(diào)miR-146a表達(dá)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，1,25(OH)2D3調(diào)控miR-146a表達(dá)可能是其抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC活化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一，但其涉及的具體信號(hào)通路有待進(jìn)一步研究。本課題組將在后續(xù)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)探索1,25(OH)2D3的抗肝纖維化作用與miR-146a及其下游信號(hào)通路之間的關(guān)系，以期為1,25(OH)2D3用于肝纖維化的治療提供更多依據(jù)，同時(shí)為臨床逆轉(zhuǎn)肝纖維化提供更多治療思路，從而改善肝纖維化患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。

1 Moreira RK. Hepatic stellate cells and liver fibrosis[J]. Arch Pathol Lab Med, 2007, 131 (11): 1728-1734.

2 Friedman SL. Evolving challenges in hepatic fibrosis[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2010, 7 (8): 425-436.

3 Bauer M, Schuppan D. TGFbeta1 in liver fibrosis: time to change paradigms?[J]. FEBS Lett, 2001, 502 (1-2): 1-3.

4 Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116 (2): 281-297.

5 He Y, Huang C, Sun X, et al. MicroRNA-146a modulates TGF-beta1-induced hepatic stellate cell proliferation by targeting SMAD4[J]. Cell Signal, 2012, 24 (10): 1923-1930.

6 Roy S, Benz F, Vargas Cardenas D, et al. miR-30c and miR-193 are a part of the TGF-β-dependent regulatory network controlling extracellular matrix genes in liver fibrosis[J]. J Dig Dis, 2015, 16 (9): 513-524.

7 Tu X, Zhang H, Zhang J, et al. MicroRNA-101 suppresses liver fibrosis by targeting the TGFβ signalling pathway[J]. J Pathol, 2014, 234 (1): 46-59.

8 Sun X, He Y, Ma TT, et al. Participation of miR-200a in TGF-β1-mediated hepatic stellate cell activation[J]. Mol Cell Biochem, 2014, 388 (1-2): 11-23.

9 Taganov KD, Boldin MP, Chang KJ, et al. NF-kappaB-dependent induction of microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103 (33): 12481-12486.

10 Giangreco AA, Vaishnav A, Wagner D, et al. Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue[J]. Cancer Prev Res (Phila), 2013, 6 (5): 483-494.

11 Ma Y, Hu Q, Luo W, et al. 1α,25(OH)2D3 differentially regulates miRNA expression in human bladder cancer cells[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2015, 148: 166-171.

12 Li F, Zhang AZ, Shi YW, et al. 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 prevents the differentiation of human lung fibroblasts via microRNA-27b targeting the vitamin D receptor[J]. Int J Mol Med, 2015, 36 (4): 967-974.

13 Abramovitch S, Dahan-Bachar L, Sharvit E, et al. Vitamin D inhibits proliferation and profibrotic marker expression in hepatic stellate cells and decreases thioacetamide-induced liver fibrosis in rats[J]. Gut, 2011, 60 (12): 1728-1737.

14 王蕾，李校天，張利，等. 活性維生素D3聯(lián)合LY294002體外抑制大鼠肝星狀細(xì)胞增殖作用研究[J]. 實(shí)用肝臟病雜志, 2016, 19 (2): 147-151.

15 李校天，尹燕，郭永澤，等. 1,25(OH)2D3干預(yù)IL-17及巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α表達(dá)抑制大鼠肝纖維化形成的作用機(jī)制[J]. 臨床肝膽病雜志, 2016, 32 (12): 2331-2336.

(2017-06-03收稿；2017-07-05修回)

1α,25-DihydroxyvitaminD3InhibitsActivationofHepaticStellateCellsbyUp-regulatingMiR-146aExpression

ZHOULiyun1,LIXiaotian2,LILi3,YANGJunchao3,GUOYongze2.

1HebeiUniversityofEngineering,Handan,HebeiProvince(056002);2DepartmentofGastroenterology,3DepartmentofHematology,AffiliatedHospitalofHebeiUniversityofEngineering,Handan,HebeiProvince

LI Xiaotian, Email: xtianli@sina.com

Hepatic Stellate Cells; Fibrosis; 1α,25-Dihydroxyvitamin D3; MicroRNAs; MiR-146a

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.11.003

河北省研究生創(chuàng)新能力培養(yǎng)資助項(xiàng)目(171290080015)；河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃項(xiàng)目(20150490)

#Email: 1071815100@qq.com

&本文通信作者，Email: xtianli@sina.com

背景：1α,25-二羥維生素D3[1,25(OH)2D3]是維生素D在體內(nèi)的最終活性形式，研究顯示其具有一定的抗肝纖維化作用，但具體作用機(jī)制尚未完全明確。研究發(fā)現(xiàn)有多個(gè)微RNAs(miRNAs)參與了肝星狀細(xì)胞(HSC)的增殖、活化，可促進(jìn)或抑制肝纖維化發(fā)生、發(fā)展。目的探討1,25(OH)2D3是否可通過(guò)調(diào)控miRNAs表達(dá)而抑制HSC活化。方法通過(guò)文獻(xiàn)檢索和qPCR技術(shù)篩選在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)激活的HSC與未活化HSC之間明顯差異表達(dá)的miRNAs。分別以差異表達(dá)miRNA mimic、陰性對(duì)照mimic、1,25(OH)2D3和DMSO與TGF-β1共同干預(yù)HSC，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果篩選顯示miR-146a在活化HSC中的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。與DMSO對(duì)照組相比，1,25(OH)2D3治療組HSC中的miR-146a表達(dá)和細(xì)胞凋亡率顯著增高，細(xì)胞存活率顯著降低(P均<0.05)。MiR-146a mimic轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照mimic轉(zhuǎn)染組相比亦表現(xiàn)為miR-146a表達(dá)和細(xì)胞凋亡率顯著增高，細(xì)胞存活率顯著降低(P均<0.05)。結(jié)論1,25(OH)2D3調(diào)控miR-146a表達(dá)可能是其抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC活化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。

Background: 1α,25-dihydroxyvitamin D3 [1,25(OH)2D3], the active form of vitamin D, is reported in some studies having antifibrotic potential in liver fibrosis, however, its mechanism is not fully clarified. MicroRNAs (miRNAs) have recently been shown could regulate the proliferation and activation of hepatic stellate cells (HSCs), and are involved in the promotion or inhibition of liver fibrosis.AimsTo explore whether the inhibiting effect of 1,25(OH)2D3on activation of HSCs is by regulating miRNAs expression.MethodsLiterature review and qPCR method were used to screen out the differentially expressed miRNAs between transforming growth factor-β1 (TGF-β1)-stimulated (activated) HSCs and the inactivated HSCs. Then the HSCs were co-cultured with TGF-β1 and the mimic of differentially expressed miRNA, the negative control mimic, 1,25(OH)2D3and DMSO, respectively, and the cell viability and apoptosis were determined by CCK-8 assay and flow cytometry.ResultsExpression of miR-146a was down-regulated in activated HSCs (P<0.05). Compared with HSCs in DMSO group, the expression of miR-146a was significantly up-regulated in HSCs treated with 1,25(OH)2D3; meanwhile, the cell viability was decreased and the apoptosis was increased (Pall <0.05). In HSCs transfected with miR-146a mimic, the expression of miR-146a was up-regulated, the cell viability was decreased, and the apoptosis was increased similarly with HSCs in 1,25(OH)2D3group (Pall <0.05).ConclusionsRegulation of miR-146a expression might be one of the important mechanisms of 1,25(OH)2D3in inhibiting TGF-β1-stimulated HSC activation and inducing apoptosis in HSCs.