宋立超，張 薇，鈕旭光，李 瑞，曹 陽，趙浩宇，周立煬

焦化廠區(qū)地膚根際芘降解細菌篩選和促生潛力研究

宋立超，張 薇，鈕旭光，李 瑞，曹 陽，趙浩宇，周立煬

（沈陽農(nóng)業(yè)大學土地與環(huán)境學院，沈陽 110866）

為強化焦化廠土壤多環(huán)芳烴原位植物-微生物修復的應(yīng)用，提供具有降解多環(huán)芳烴功能的植物促生菌，分別以芘和1-氨基環(huán)丙烷-1-脫氨酶（ACC脫氨酶）為唯一碳源和氮源，采用富集培養(yǎng)法對某焦化廠優(yōu)勢植物地膚根際土壤中的功能菌株進行分離。研究分離的菌株對芘的降解能力和對植物的促生特性；通過種子萌發(fā)試驗，以芘為碳源，研究菌株對地膚種子發(fā)芽率和根長的影響。多次富集后，得到7株菌，經(jīng)鑒定命名為考克氏菌KSB1、芽孢桿菌KSB2、類香味菌KSB3、沙雷菌KSB4、副球菌KSB5、松鼠葡萄球菌KSB6、芽孢桿菌KSB7。經(jīng)過14 d的降解實驗，菌株KSB1、KSB2、KSB4、KSB5和KSB7均可降解約58%以上的芘。菌株KSB2、KSB4和KSB7的ACC脫氨酶活性大于3.5 M α-KB·mg-1·h-1。在種子萌發(fā)實驗中，菌株KSB2、KSB4和KSB7均可顯著提高芘脅迫下（芘濃度10～25 mg·L-1）地膚種子的發(fā)芽率和芽長，其中KSB7的效果最好，與對照相比對地膚發(fā)芽率和芽長分別提高了56.76%和88.9%，表明菌株KSB7在焦化廠污染土壤的地膚-微生物聯(lián)合修復中具有較大的應(yīng)用潛力。

根際促生菌；地膚；多環(huán)芳烴；降解

多環(huán)芳烴（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）是環(huán)境中普遍存在的一類持久性有機污染物，給人類健康和生態(tài)環(huán)境造成了嚴重的危害[1-2]，它是焦化廠污染土壤中的主要污染物之一，主要來源于煉焦過程中煤的不完全燃燒[3]。李鳳梅等[4]報道沈陽某焦化廠土壤中13種PAHs質(zhì)量濃度總和為5 672.00 mg·kg-1，且以4環(huán)和5環(huán)為主，占PAHs總和的75.21%。馮嫣等[5]報道北京某焦化廠車間土壤中PAHs質(zhì)量濃度為144.81 mg·kg-1，以3環(huán)和4環(huán)為主。近年，由于環(huán)境污染和城市規(guī)劃等原因，一些市中心的焦化廠開始搬遷，而遺留的場地將被改為居住和商業(yè)用地。因此，如何有效地清除或降低焦化廠地PAHs污染風險便成為人們重點關(guān)注的問題。

針對焦化廠目前已有的PAHs修復技術(shù)包括化學淋洗、化學氧化、電動修復、微生物修復和植物修復等[6]。其中微生物修復和植物修復方法由于低耗、經(jīng)濟有效且環(huán)境友好等特點，已成為目前污染土壤修復的主要方式[7-8]。Sun等[9]從焦化廠土壤篩選分離出菌株Kocuria sp.P10，液體培養(yǎng)14 d對芴、熒蒽和芘的降解率分別為83.2%、76.5%和59.6%。但由于游離降解菌難于在土壤中存活，導致單純的微生物修復技術(shù)難以大面積推廣。Smith等[10]選取了高羊茅、紫羊茅、黑麥草、紅車軸草和三葉草分別修復焦化廠污染的土壤，結(jié)果表明植物對3環(huán)和4環(huán)的PAHs具有一定的修復能力。但由于PAHs具有一定的毒性，可影響植物的生長，致使單純通過植物修復的效率并不高，如何提高植物對PAHs毒性的抗性、提高植物的生物量、降低PAHs的濃度成為提高植物修復效率的重要途徑[11]。微生物和植物聯(lián)合修復技術(shù)可彌補各自缺點，微生物可部分降解PAHs，降低土壤PAHs的濃度，減輕PAHs對植物的毒害，而植物的根際區(qū)可為共生菌提供良好的生長環(huán)境，利于菌株的存活，此外根際共生菌往往還具有促生功能，能夠提高植物的生物量[12-13]。Guo等[12]向農(nóng)田污染土壤中添加降解PAHs的分枝桿菌，可提高黑麥草對PAHs的去除率和土壤中降解PAHs功能微生物的數(shù)量。然而，目前關(guān)于焦化廠原位優(yōu)勢植物根際區(qū)專性降解PAHs促生菌的研究還未見報道。

筆者對沈陽某棄用焦化廠土壤PAHs進行檢測，結(jié)果表明4環(huán)芘的含量最高，占PAHs總量的15.11%，故該試驗選擇芘為PAHs的代表模型。利用富集法，從焦化廠區(qū)優(yōu)勢植物地膚根際分離具芘降解能力的促生菌，研究它們的促生潛能、降解芘的能力以及對地膚種子生長的影響，以期為焦化廠土壤PAHs污染植物-微生物修復提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

芘（純度>97%）購自Fluka公司；1-氨基環(huán)丙烷-1-脫氨酶（1-amino cyclopropane-1-deaminase，ACC）、吲哚乙酸（Indoleacetic Acid，IAA）購自華中海威（北京）基因科技有限公司。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

①液體無機鹽培養(yǎng)基（g·L-1）：MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO40.8，（NH4）2SO41.0，KH2PO40.2，NaCl 20.0，CaCl2·2H2O 0.1，葡萄糖 0.05，調(diào)節(jié) pH 至 8.0。

②DF 鹽培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖 2.0，（NH4）2SO42.0，Na2HPO46.0，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO44.0，葡萄糖酸2.0，檸檬酸2.0，調(diào)節(jié)pH至8.0。

③ADF培養(yǎng)基：用ACC替代DF培養(yǎng)基中（NH4）2SO4，將ACC溶于滅菌蒸餾水后，再過0.22 μm有機濾膜除菌，使其最終濃度為3.0 mmol·L-1。

④PKO培養(yǎng)基（g·L-1）：Ca3（PO4）25.0，葡萄糖5.0，NaCl 20.0，KCl 0.3，（NH4）2SO40.5，MnSO4·4H2O 0.03，MgSO4·7H2O 0.3，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，瓊脂 20.0，調(diào)節(jié)pH至8.0。

1.1.3 土樣的采集及理化性質(zhì)測定

2016年7月，在沈陽某棄用焦化廠區(qū)外（41°48′N，123°20′E）采集生長優(yōu)勢植物地膚，采用五點采樣法取樣，每點掘出面積為10 cm×10 cm，深度為10 cm的包含地膚根系的整塊土壤樣本，實驗室無菌條件下將根際和非根際土壤刮下備用，于4℃冰箱保存。測定土壤有機質(zhì)、pH值、速效N、速效P、速效K以及土壤和地膚中16種PAHs含量。16種PAHs的測定參考Khan等[14]的方法。PAHs的方法檢出限為0.021～0.103 mg·kg-1（干重），土壤基質(zhì)加標回收率為84.21%～108.36%。

1.2 根際土壤中具促生能力的芘降解細菌的篩選

取5 g地膚根際土加入到45 mL液體無機鹽培養(yǎng)基中（含芘濃度為 25 mg·L-1），28 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d；取上述培養(yǎng)液5 mL再次加入到45 mL含芘的液體無機鹽培養(yǎng)基中，28℃、120 r·min-1培養(yǎng)7 d，重復3次，稀釋平板法LB固體培養(yǎng)基計數(shù)芘耐受菌的數(shù)量。

吸取1 mL上述富集液加入到30 mL DF鹽培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng) 24 h，按上述方法再次轉(zhuǎn)接1 mL至30 mL的ADF液體培養(yǎng)基中，28℃、120 r·min-1培養(yǎng) 24 h，重復 3次，通過ADF固體培養(yǎng)基進行稀釋分離單菌落。

1.3 芘降解細菌的鑒定

利用細菌 16S rRNA 通用引物（F27：5′-AGAGTT TGATCMTGGCTCAG-3′，R1492：5′-TACGYTACCTT GTTACGACT-3′）序列進行PCR擴增，具體參照宋立超等[15]的方法。獲得產(chǎn)物進行測序，然后將所測得序列在GenBank中進行比對。同時常規(guī)方法對分離菌的形態(tài)、革蘭氏染色、芽孢以及菌落特征進行分析。

1.4 分離細菌的特點

1.4.1 促生特性測定

所分離菌株的ACC脫氨酶活性測定參照Liu等[16]的方法，解磷能力參照張國壯等[17]的方法，產(chǎn)物IAA的檢測采用Salkowski方法[18]，產(chǎn)鐵載體能力參照Payne的[19]方法。

1.4.2 分離菌種的降解特征

以濃度108CFU·mL-1的投菌量和含芘25 mg·L-1液體無機鹽培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別投加所篩選細菌，以不加任何菌株作為對照，28℃、120 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)，分別在7 d和14 d取樣分析芘殘留量。每個處理設(shè)3次重復。溶液中芘的萃取參照宋立超等[15]的方法，芘的測定采用液相色譜法。

1.5 芘脅迫下菌株對地膚種子的促生能力

地膚種子的前處理參照Liu等[13]的方法，先將地膚種子用70%的酒精表面消毒2 min，然后再用1%次氯酸鈉消毒10 min，最后用無菌水沖洗3遍，20粒消毒后的種子放入鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，分別添加不同濃度的芘溶液（0、10、25 mg·L-1）和 1 mL 的菌懸液（OD600nm=0.6～0.8），28℃ 培養(yǎng) 5 d，測定種子的發(fā)芽率和芽長。

1.6 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析使用SPSS 16.0，樣品均值的比較采用LSD檢驗（α=0.05），數(shù)據(jù)處理使用軟件Origin 8.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試土壤性質(zhì)

地膚根際和非根際土壤理化性質(zhì)見表1，可見該地區(qū)土壤為弱堿性，地膚根際區(qū)的有機質(zhì)、速效N、速效P和速效K均顯著高于非根際區(qū)。根際區(qū)PAHs質(zhì)量濃度與非根際區(qū)相比，減少了25.1 mg·kg-1，而地膚中PAHs濃度卻為7.69 mg·kg-1，且根際區(qū)含有大量的PAHs耐受菌，這部分菌株具有降解PAHs的潛能，表明地膚根際區(qū)PAHs的去除可能是由植物累積和微生物降解協(xié)同作用完成。

2.2 分離菌株的鑒定

以芘和AAC為唯一碳源和氮源從地膚根際富集分離出可培養(yǎng)細菌7株，分別編號為KSB1、KSB2、KSB3、KSB4、KSB5、KSB6 和 KSB7，其菌落形態(tài)及鑒定結(jié)果列于表2。菌株KSB2和KSB7均為芽孢桿菌屬，長桿、有芽孢、革蘭氏染色為陽性、白色菌落；KSB4為沙雷氏菌，短桿、革蘭氏染色陰性、白色菌落。

2.3 分離菌株的促生特性

分離菌株促生特性結(jié)果列于表3，除了菌株KSB3和KSB6以外，其余5株菌ACC脫氨酶活性均大于 1.0 M α-丁酮酸 mg-1·h-1（M α-KB mg-1·h-1），其中菌株KSB2、KSB4和KSB7的ACC脫氨酶活性在3.55～5.21 M α-KB mg-1·h-1；7 株菌均具有產(chǎn) IAA 的能力，范圍為6.33～108.71 mg·L-1；鐵載體為定性檢測，菌株KSB3能力最強；菌株KSB2和KSB5不具溶磷特性，菌株KSB7溶磷效果最好。綜上，除了鐵載體以外，在所有菌株中KSB7具有最高水平的ACC脫氨酶、IAA產(chǎn)物和溶磷活性。

2.4 分離菌株對芘的降解特征

篩選分離所得7株細菌，經(jīng)14 d培養(yǎng)后其對芘降解效果如圖1所示。各菌株對芘均具有一定的降解能力，其中菌株KSB2和KSB5對芘的降解啟動速率較快，在培養(yǎng)7 d后對芘的降解率分別為35.81%和38.57%，然而菌株KSB7在14 d后對芘的降解率卻最高，達到90.23%，表明在根際區(qū)菌株KSB2和KSB5可能對芘的降解起先導作用，作為共代謝底物促進菌株KSB7對芘的降解，進而提高根際區(qū)對PAHs的降解效率。

表1 供試土壤主要理化性質(zhì)Table 1 Characteristics of experimental soil

表2 分離菌株的鑒定Table 2 Identification of isolates

表3 分離菌株的促生特點Table 3 PGP features of isolated strains

2.5 不同芘濃度下菌株對地膚種子的影響

圖1 各菌株對芘的降解效果Figure 1 Biodegradation rate of pyrene by strains

綜合上述菌株的促生特性和對芘的降解能力，選取菌株KSB2、KSB4和KSB7，考察它們對地膚種子的促生能力。經(jīng)過5 d培養(yǎng)后其對種子發(fā)芽率和芽長的影響如表4所示。不添加任何菌時，發(fā)芽率和芽長隨著芘濃度的增加而降低；接種后，無芘脅迫下各菌株與CK相比促生能力無顯著差別，而伴隨著芘濃度的增加，它們則可顯著提高地膚的發(fā)芽率和芽長；菌株KSB7表現(xiàn)出最好的促生能力，與CK相比10 mg·L-1芘脅迫下發(fā)芽率和芽長分別提高了14.74%和50%，25 mg·L-1芘脅迫下提高了56.76%和88.9%（KSB7-CK/CK），表明菌株KSB7對高濃度芘脅迫下的地膚種子的萌發(fā)和生長具有顯著的影響。

表4 不同芘濃度下菌株對地膚種子生長的影響Table 4 Effects of strains on the growth of Kochia scoparia grown in different concentrations pyrene

3 討論

目前，國內(nèi)外研究者主要通過添加功能微生物（根際促生菌、PAHs降解菌株）來強化植物對PAHs類有機污染物的吸收降解作用[20]。Liu等[13]在石油污染土壤高羊茅根際篩選出1株具促生能力的Klebsiella sp.D5A，接種后高羊茅對石油烴的降解率提高了16.2%，地上和地下生物量各提高了75.2%和42.2%。劉魏魏等[11]研究表明接種PAHs專性降解菌可使紫花苜蓿對PAHs的降解率提高49.6%，而同時接種植物促生菌和PAHs專性降解菌時紫花苜蓿對PAHs的降解率提高了60.1%?；诖?，利用降解PAHs的促生菌聯(lián)合植物修復PAHs污染的焦化廠具有一定的應(yīng)用潛力，植物和共生功能菌株的篩選是關(guān)鍵。地膚對環(huán)境適應(yīng)性強，土壤生長范圍廣，具有一定耐堿特性，Moubasher等[21]研究表明地膚能有效去除干旱地區(qū)土壤中石油烴，去除率為31.2%～57.7%，但有關(guān)其根際細菌與地膚聯(lián)合修復有機污染的研究還未見報道。本研究從PAHs污染焦化廠地膚根際分離篩選出7株具芘降解特性的促生菌株，研究了菌株對芘的降解能力。結(jié)果表明，搖床培養(yǎng)14 d后菌株KSB1、KSB2、KSB4、KSB5 和 KSB7 對芘的降解率均在58%以上（芘25 mg·L-1）。分離菌株經(jīng)鑒定分別屬于考克氏菌屬（Kocuria sp.）、芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、類香味菌屬（Myroides sp.）、沙雷菌屬（Serratia.Sp.）、副球菌屬（Paracoccus sp.）、松鼠葡萄球菌屬（Staphylococcus sciuri）和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。KSB2、KSB4、KSB5和KSB7所在屬的菌株具有降解PAHs的功能已有報道，系統(tǒng)發(fā)育分析與KSB2親緣關(guān)系較近的菌株Bacillus sp.SPL-4可去除土壤中35.1%的4環(huán)PAHs，53.5%的5環(huán)和6環(huán)PAHs[22]，且有多個研究表明該屬菌可產(chǎn)生生物表面活性劑[22-23]。本研究中菌株KSB2培養(yǎng)7 d對芘的降解率最高，表明該屬菌株是一類降解PAHs的優(yōu)勢菌群。Liu等[24]研究表明接種菌株Bacillus sp.DZ13可提高花生植株13.8%的生物量。本研究發(fā)現(xiàn)菌株KSB2、KSB4和KSB7的ACC脫氨酶活性大于 3.5 M α-KB mg-1·h-1，7 株菌均具有產(chǎn)IAA的能力，范圍為6.33～108.71 mg·L-1，具有較強的促生潛力。

根際促生菌可提高種子的發(fā)芽率和芽長，進而提高植株的生物量。但植物對所分離的功能菌株是否具有根際效應(yīng)，是菌株發(fā)揮功能的關(guān)鍵。Chen等[25]發(fā)現(xiàn)接種Microbacterium sp.KL5和Candida tropicalis C10可提高黑麥草和東南景天的生物量和對PAHs的去除率，但黑麥草與東南景天比，具有較好的根際效應(yīng)。為此，我們在促生特性和芘降解能力實驗的基礎(chǔ)上，選取菌株KSB2、KSB4和KSB7，做了促生試驗，結(jié)果表明無芘脅迫下菌株的促生特性與對照相比無顯著差別，然而隨著芘濃度的升高，顯著增加了地膚的發(fā)芽率和芽長（表4）。菌株KSB7在芘脅迫下表現(xiàn)出了良好的促生能力，濃度25 mg·L-1與10 mg·L-1相比，其促生功能所發(fā)揮的相對作用更強，表明菌株KSB7在污染脅迫下，降解功能起先導作用，先緩解了高濃度芘對種子的毒害作用，進而達到促生的效果。關(guān)于菌株KSB7對土壤PAHs地膚修復的影響在今后工作中將做進一步的研究。

4 結(jié)論

本研究從焦化廠優(yōu)勢植物地膚根際土壤篩選分離出7株具PAHs降解能力的根際促生菌，其中菌株KSB7具有較高的芘降解能力和促生活性，鑒定屬于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.），接種該株菌可顯著提高地膚種子對芘的抗性，在25 mg·L-1芘濃度下，與對照相比地膚發(fā)芽率和芽長分別提高了56.76%和88.9%。表明菌株KSB7在焦化廠污染土壤的地膚-微生物聯(lián)合修復中具有較大的應(yīng)用潛力。

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Screening of pyrene-degrading bacteria from Kochia scoparia rhizosphere in coking plant and study of plant growth-promoting ability

SONG Li-chao,ZHANG Wei,NIU Xu-guang,LI Rui,CAO Yang,ZHAO Hao-yu,ZHOU Li-yang
（College of Land and Environment,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China）

In order to enhance in situ bioremediation of coking plant soils contaminated by polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）and obtain plant growth-promoting bacteria that can degrade PAHs,functional strains in the rhizosphere of Kochia scoparia,which is a typical plant in coking plants,were obtained using the enrichment culture method.Pyrene and 1-amino cyclopropane-1-deaminase（ACC）were used as the sole carbon and nitrogen sources,respectively.The pyrene degradation ability and plant growth-promoting characteristics of the isolated strains were studied.The effect of the strains on the germination rate and root length of Kochia scoparia seeds were also analyzed using pyrene as the carbon source.After several enrichment times,7 strains were identified and named as Kocuria sp.KSB1,Bacillus sp.KSB2,Myroides sp.KSB3,Serratia.sp.KSB4,Paracoccus sp.KSB5,Staphylococcus sciuri.KSB6,and Bacillus sp.KSB7.In the degradation experiment,more than 58%of pyrene could be degraded in 14 days by strains KSB1,KSB2,KSB4,KSB5,and KSB7.The activity of ACC deaminase was more than 3.5 M α-KB mg-1·h-1in KSB2,KSB4,and KSB7.Strains KSB2,KSB4,and KSB7 significantly improved the germination rate and root length under pyrene stresses of 10～25 mg·L-1.Compared to CK,KSB7 increased the germination rate by 56.76%and shoot length by 88.9%,respectively.The results show that strain KSB7 has great potential in the bioremediation of contaminated soils of coking plants using Kochia scoparia.

plant growth-promoting rhizobacteria;Kochia scoparia;polycyclic aromatic hydrocarbons;degradation

X171.5

A

1672-2043（2017）11-2275-06

10.11654/jaes.2017-0997

宋立超，張 薇，鈕旭光，等.焦化廠區(qū)地膚根際芘降解細菌篩選和促生潛力研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報,2017,36（11）：2275-2280.

SONG Li-chao,ZHANG Wei,NIU Xu-guang,et al.Screening of pyrene-degrading bacteria from Kochia scoparia rhizosphere in coking plant and study of plant growth-promoting ability[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（11）：2275-2280.

2017－07－17 錄用日期：2017－10－16

宋立超（1979—），女，遼寧沈陽人，博士，講師，從事土壤有機污染生物修復方面的研究。E-mail：slch_1979@163.com

國家自然科學基金項目（41703103，31401322）；農(nóng)業(yè)部東北耕地保育重點實驗室項目（2015NYBKFT-4）

Project supported：The National Natural Science Foundation of China（41703103，31401322）；Laboratory of Northeast Arable Land Conservation of Ministry of Agriculture（2015NYBKFT-4）