郭慶啟 張 娜 符 群 鄒傳山 張 智

(東北林業(yè)大學林學院1，哈爾濱 150040) (哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院2，哈爾濱 150076)

毛榛榛仁肽的氨基酸營養(yǎng)組成與總還原能力評價

郭慶啟1張 娜2符 群1鄒傳山1張 智1

(東北林業(yè)大學林學院1，哈爾濱 150040) (哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院2，哈爾濱 150076)

以超臨界CO2脫脂制備出的毛榛榛仁粕為原料，經(jīng)Alcalase堿性蛋白酶水解榛仁粕蛋白提取液后，采用葡聚糖凝膠G-25對水解液進行分離純化，得到Ⅰ和Ⅱ2種榛仁多肽組分，測定其氨基酸組成，并對其營養(yǎng)和總還原能力進行了評價。研究結(jié)果表明：對于毛榛榛仁多肽組分Ⅰ和Ⅱ，其氨基酸比值系數(shù)分值分別為36.15和41.11，營養(yǎng)價值較低，限制氨基酸分別是賴氨酸和亮氨酸。抗氧化實驗結(jié)果表明，在相同質(zhì)量濃度條件下，多肽組分Ⅱ的總還原能力要高于多肽組分Ⅰ，但均小于VC。

榛仁肽 氨基酸組成 營養(yǎng)評價 抗氧化

榛子為樺木科(Corylaceae)榛屬(Corylus)植物[1]，榛子營養(yǎng)豐富，富含油脂、蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)[2-3]，以及人體所需的8種必需氨基酸和微量元素[4]。據(jù)《開寶本草》記載：“榛子益氣力，實腸胃，令人不饑，健行”。世界榛子產(chǎn)量居前列的國家有土耳其、意大利、西班牙和塞浦路斯等，目前我國有22個省(區(qū))有榛屬分布，僅東三省就有榛林170萬 m2[5]。黑龍江省的榛屬資源主要有平榛和毛榛，毛榛產(chǎn)于黑龍江省的小興安嶺、張廣才嶺、老爺嶺和完達山山脈。毛榛果皮薄，出仁率高，果仁香甜可口，品質(zhì)優(yōu)良，是重要的生食和食品加工的堅果原料之一[6-7]。目前，國內(nèi)對于毛榛仍是傳統(tǒng)的食用方式，即焙炒后去殼食用，對于榛仁的加工幾乎是空白，亟需研究榛仁精深加工及高附加值產(chǎn)品的開發(fā)。

榛仁中蛋白質(zhì)含量較高，但目前國內(nèi)對于榛仁蛋白研究主要集中在分離提取及理化性質(zhì)的分析[8-10]，而國外則集中在過敏源方面的研究[11]，國內(nèi)有研究人員進行了榛仁肽水解條件的優(yōu)化以及抗氧化、降血脂和抗疲勞等功能性質(zhì)的研究，但研究對象均為酶解后制備出的酶解物，是一種多肽的混合物，而本文通過葡聚糖凝膠Sephadex G-25對酶解后的水解液進行分離純化，對富集得到的榛仁多肽組分，依據(jù)氨基酸比值系數(shù)和FAO/WHO氨基酸評分標準[12]，進行了相關(guān)的營養(yǎng)評價并考察了其總還原能力[13]，以及進一步研究氨基酸組成和分子質(zhì)量大小與榛仁肽抗氧化活性之間的聯(lián)系，為毛榛榛仁的高值化加工利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 原料和試劑

毛榛(Corylusmandshurica)：黑龍江省伊春市五營林業(yè)局，采集時間為當年9月份；Alcalase堿性蛋白酶(30000 U)：丹麥Novo Nordisk公司；其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

44C2-A型冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；HA221-50-60型超臨界CO2萃取裝置：江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；TU-1800SPC紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；PHS-3C型酸度計：上海雷磁儀器廠；Kjeltec2300型定氮儀：瑞典Foss公司；HITACHI835-50氨基酸分析儀：日本HITACHI公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 脫脂榛仁粕的制備

將榛子手工去殼剝紅衣，用粉碎機將榛仁粉碎后采用超臨界CO2進行脫脂，超臨界CO2萃取脫脂的條件為：萃取溫度50 ℃、壓力20 MPa、萃取時間3 h，將脫脂榛仁粕在40 ℃條件下烘干，過60 目篩后置于封口袋中低溫保存。測得脫脂榛仁粕的蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為(76.72±0.14)%。

1.3.2 榛仁蛋白水解液的制備

稱取一定質(zhì)量的脫脂榛仁粕粉末，按1∶35料液比加入蒸餾水攪拌溶解，在100 ℃條件下處理30 min后冷卻，按3720 U/g加入Alcalase堿性蛋白酶，酶解溫度50.6 ℃、酶解pH 8.4、采用NaOH溶液和恒溫水浴保持體系的pH值和溫度恒定，酶解90 min后沸水浴滅酶，離心分離得榛仁蛋白水解液[14]。

1.3.3 榛仁肽的分離純化

將酶解得到的榛仁蛋白水解液，通過葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析進行分離純化，采用N2000色譜工作站進行在線檢測和收集，設(shè)定檢測波長280 nm，流速0.5 mL/min，將出現(xiàn)信號的洗脫液收集并真空凍干。

1.3.4 氨基酸的測定

氨基酸的檢測方法采用GB/T 5009.124—2003，平行測定2次，以平均值作為試驗結(jié)果。

1.3.5 榛仁肽氨基酸組成的營養(yǎng)評價

世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)于1973年提出了評價蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的氨基酸模式[15]，其主要采用以下指數(shù)和公式進行計算：

必需氨基酸比值(ratio of essential amino acid，REAA)=待評蛋白質(zhì)中某種必需氨基酸含量(mg/g)/(WHO/FAO)模式中相應(yīng)必需氨基酸的含量(mg/g蛋白)

氨基酸比值系數(shù)(ratio coefficient of amino acid，RC)=必需氨基酸比值/必需氨基酸比值的均值

氨基酸比值系數(shù)分值(score of RC，SRC)=100-CV×100

式中：CV為RC的變異系數(shù)，CV=標準差/均值。

1.3.6 榛仁肽組分的總還原能力評價

采用分光光度法進行總還原能力的測定[16]并略有改動，將浸提溶劑由甲醇改為水，并采用水溶液作參比調(diào)零。重復(fù)試驗3次，以平均值±標準差結(jié)果作圖。

2 結(jié)果和討論

2.1 榛仁多肽的分離純化

采用葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析分離榛仁蛋白水解液的譜圖見圖1。經(jīng)4次平行試驗，層析譜圖均出現(xiàn)2個峰，表明Sephadex G-25可以將榛仁蛋白水解液分離成2種主要組分。先洗脫下來的相對分子質(zhì)量較大的稱其為榛仁多肽組分Ⅰ，后洗脫下來的相對分子質(zhì)量比較小的稱其為榛仁多肽組分Ⅱ。王晶[5]采用酶解制備榛仁蛋白水解物，經(jīng)凝膠柱分析得到2個峰，根據(jù)榛仁肽分子質(zhì)量分布曲線判斷水解反應(yīng)是連續(xù)進行的，并估算出大多數(shù)榛仁肽的分子質(zhì)量低于5 000 ku。

圖1 榛仁蛋白水解液的層析譜圖

2.2榛仁多肽組分的氨基酸組成分析和營養(yǎng)學評價

經(jīng)氨基酸自動分析儀測定的2種多肽組分的氨基酸組成如表1所示。

表1 榛仁多肽組分的氨基酸組成及含量

多肽組分Ⅰ中氨基酸含量最多的是谷氨酸，占氨基酸總量的11.23%，苯丙氨酸含量第二，占氨基酸總量的10.50%。其中必需氨基酸占氨基酸總量的38.05%，接近FAO/WHO規(guī)定的40%標準比例，非必需氨基酸的含量占氨基酸總量的61.95%，高于FAO/WHO標準規(guī)定的60%[15]，說明多肽組分I的氨基酸組成較接近理想蛋白質(zhì)的要求。多肽組分Ⅱ中氨基酸含量最高的是胱氨酸，占氨基酸總量的15.27%，這一含量與多肽組分I具有明顯的區(qū)別；谷氨酸含量第二，占氨基酸總量的11.89%。其中必需氨基酸占氨基酸總量的34.19%，對比于多肽組分Ⅰ，要低于FAO/WHO標準。必需氨基酸含量的高低及構(gòu)成比例是決定氨基酸營養(yǎng)價值的重要因素，從這一指標對比分析可知，多肽組分Ⅰ的營養(yǎng)價值要高于多肽組分Ⅱ。

表2 榛仁多肽組分的必需氨基酸比值、氨基酸比值系數(shù)及氨基酸比值系數(shù)分

評價蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值可以分為兩類，一類為動物試驗，如生物價、蛋白質(zhì)功效比值等[17]；另一類為化學分析法，常用的是氨基酸評分，而氨基酸比值系數(shù)法是基于氨基酸平衡理論設(shè)計的評價蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的方法[18]?，F(xiàn)代營養(yǎng)學理論認為，氨基酸的組成與其營養(yǎng)價值密切相關(guān)。蛋白質(zhì)的氨基酸組成越接近于人體蛋白質(zhì)的組成，在消化吸收時其營養(yǎng)價值越高[19]。對于2種多肽組分，根據(jù)氨基酸的種類和含量，計算出的必需氨基酸比值、氨基酸比值系數(shù)和比值系數(shù)分如表2所示。

RC的意義是與模式氨基酸相當量的一份食物氨基酸的比值，如果食物中氨基酸組成與氨基酸模式一致，則各比值系數(shù)都應(yīng)等于1[20]。數(shù)值大于和小于1都表示偏離氨基酸模式，RC>1表示該氨基酸相對過剩，RC<1表示該氨基酸相對不足，RC最小的氨基酸則是限制氨基酸。從表2可知多肽組分Ⅰ中限制氨基酸為賴氨酸，多肽組分Ⅱ的限制氨基酸為亮氨酸。

現(xiàn)代研究認為不僅氨基酸不足影響蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值，氨基酸過剩同樣也限制蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值。SRC的意義為[18]：如果食物蛋白質(zhì)的氨基酸組成與氨基酸模式一致，則CV=0，SRC為100。當食物蛋白質(zhì)的RC越分散，表示這些氨基酸在氨基酸平衡上做的負貢獻越大，則CV變大，SRC變小，蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值越差。通過計算可得組分Ⅰ和組分Ⅱ的SRC值分別為36.15和41.11，說明水解之后得到的2種多肽組分，營養(yǎng)價值低于多數(shù)的食品蛋白質(zhì)[22-22]。

研究人員發(fā)現(xiàn)榛仁肽具有溶解性不隨pH值變化而變化和高濃度低黏度的理化性質(zhì)，并進一步研究發(fā)現(xiàn)榛仁肽具有降血脂和抗疲勞的功能，但對抗氧化功能的研究較少。抗氧化肽是目前國內(nèi)外研究較多的一種生物活性肽，大部分研究者認為，抗氧化肽通常會包含特定類型的氨基酸，同時氨基酸的種類、序列、構(gòu)型會決定著其抗氧化能力[22]，2種多肽組分中不同種類的氨基酸組成和含量如表3所示。

表3 2種榛子仁多肽中不同種類氨基酸的組成分析/mg/g蛋白

注：a為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸；b為絲氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、酪氨酸；c為賴氨酸、精氨酸、組氨酸；d為天門冬氨酸、谷氨酸；e為蛋氨酸；f為苯丙氨酸、酪氨酸。

2.3 榛仁多肽組分的總還原能力測定

由圖2可知，無論是VC還是2種榛仁多肽組分，隨著質(zhì)量濃度的增加其總還原能力均呈現(xiàn)增加的趨勢，呈現(xiàn)出一定的劑效關(guān)系。在相同質(zhì)量濃度條件下，多肽組分Ⅱ的的總還原能力要高于多肽組分Ⅰ，但均小于VC。

圖2 2種多肽組分和VC的總還原能力

李京京等[24]研究發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的升高，榛子抗氧化肽的還原能力逐漸增強，能夠達到同濃度下EDTA的38.55%。研究認為，某些特定的氨基酸有可能成為抗氧化肽的活性位點，包括親核性的含硫氨基酸，芳香族氨基酸以及含咪唑基的氨基酸。從表3可以看出，多肽組分Ⅱ的特征性氨基酸的數(shù)量要高于多肽組分Ⅰ，2種多肽組分的氨基酸含量存在差異，直接影響了其總還原能力的不同。

KATO等[25]認為芳香族氨基酸可供氫，減慢或終止自由基鏈式反應(yīng)，而自身可以通過共振維持穩(wěn)定，而極性氨基酸可以通過螯合金屬離子來發(fā)揮其抗氧化能力。多肽組分Ⅱ中的疏水性的丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸的含量均高于多肽組分Ⅰ，而這些氨基酸的非極性脂肪烴側(cè)鏈能使肽與疏水性多不飽和脂肪酸的相互作用增強，含疏水性氨基酸的肽片段通過與氧結(jié)合或抑制脂質(zhì)中氧的釋放來延緩脂質(zhì)過氧化鏈式反應(yīng)[26]。

從分子質(zhì)量大小角度分析來看，多肽組分Ⅱ的分子質(zhì)量要小于多肽組分Ⅰ，推斷水解度對產(chǎn)物的抗氧化能力具有一定的影響，即水解度越大，產(chǎn)物的抗氧化能力越強，因此為了制備出抗氧化能力更強一些的榛仁肽，應(yīng)加大對水解度的優(yōu)化以及復(fù)合酶的應(yīng)用研究。

3 結(jié)論

通過分析2種毛榛榛仁多肽組分的氨基酸組成及含量，發(fā)現(xiàn)其限制性氨基酸分別是賴氨酸和亮氨酸，計算出氨基酸比值系數(shù)分別為36.15和41.11，表明2種多肽組分的營養(yǎng)價值較低；但總還原能力試驗結(jié)果表明，這2種多肽組分均具有一定的抗氧化能力，且多肽組分Ⅱ的總還原能力要高于多肽組分Ⅰ，但二者均小于VC。

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Evaluation of Amino Acid Nutritional Composition and Total Reducing Power ofCorylusMandshuricaMaxim Hazelnut Peptides

Guo Qingqi1Zhang Na2Fu Qun1Zou Chuanshan1Zhang Zhi1

(School of Forestry,Northeast Forestry University1, Harbin 150040) (College of Food Engineering, Harbin University of Commerce2,Haerbin 150076)

The protein extraction solution from the supercritical carbon dioxide defattedcorylusmandshuricakernel meal was hydrolyzed by Alcalase, and then the hydrolysate was separated and purified by Sephadex G-25. After that two kernel polypeptide fractions I and II were prepared,the amino acid composition of thetwo polypeptide fractions was determined, and its nutrition and total reducing power were evaluated. The results showed that, for polypeptide fractions I and II, the score of ratio coefficient of amino acid was 36.15 and 41.11 each, which showed that the nutritional value wasrelatively low; the limiting amino acidswere Lysine and Leucine for two fractions, respectively. The antioxidant experiment results show that under the same concentration, the total reducing power of polypeptide fraction II was higher than that of polypeptide fraction I, but both were less than that of VC.

hazelnut peptide, amino acid composition, nutrition evaluation, antioxidation

S664.4

A

1003-0174(2017)11-0064-06

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(DL12BA04)，東北林業(yè)大學食品工程原理重點課程資助(DL 2015-26)，中國食品科學技術(shù)學會食品科技基金-貝因美食品科技研究基金(2016-002)

2016-05-25

郭慶啟，男，1978年出生，副教授，天然產(chǎn)物化學