孔祥珍 黃 飛 周治彤 吳煒豪

(江南大學(xué)食品學(xué)院；食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122)

小麥醇溶蛋白自組裝納米粒子負(fù)載白藜蘆醇的性質(zhì)研究

孔祥珍 黃 飛 周治彤 吳煒豪

(江南大學(xué)食品學(xué)院；食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122)

小麥醇溶蛋白是谷朊粉的主要成分之一，用小麥醇溶蛋白包埋白藜蘆醇以達(dá)到穩(wěn)定白藜蘆醇的目的。用反溶劑法制得其自組裝納米粒子，對(duì)乙醇濃度、蛋白濃度、分散液pH、分散液鹽濃度等因素對(duì)納米粒子的粒徑以及Zeta電位的影響做出了探究。發(fā)現(xiàn)在乙醇濃度為65%，蛋白質(zhì)濃度4%，分散液pH為4.5，分散液鹽濃度為0.00 mol/L時(shí)，得到理想的納米粒子，其粒徑約為(185.1±8.5) nm,Zeta電位為(19.36±1.03) mV。而后在最佳條件下用小麥醇溶蛋白納米粒子負(fù)載白藜蘆醇，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物在芯壁比為1:40時(shí)包埋率最高，此時(shí)粒徑(166.7±3.7) nm，Zeta電位(15.68±0.74) mV，包埋率為55.0%，載藥率為1.5%。小麥醇溶蛋白納米粒子可以用來(lái)穩(wěn)定白藜蘆醇。

小麥醇溶蛋白 納米粒子 自組裝 白藜蘆醇

谷朊粉是小麥加工的副產(chǎn)品，主要由醇溶蛋白和麥谷蛋白組成[1-2]。小麥醇溶蛋白為單鏈蛋白，分子量約為28～55 ku，通過(guò)鍵內(nèi)二硫鍵、疏水相互作用、氫鍵等形成球狀結(jié)構(gòu)[3]。小麥醇溶蛋白作為靶向載體材料前景廣闊。李崇達(dá)[4]采用小麥醇溶蛋白通過(guò)戊二醛交聯(lián)制備小麥醇溶蛋白微球，并在微球的制備過(guò)程中引入磁性納米粒子。Ezpeleta等[5]用小麥醇溶蛋白制備荊豆凝集素-小麥醇溶蛋白納米粒子，并且使荊豆凝集素在體內(nèi)活性和特性得到保留。

白藜蘆醇是一種非黃酮類(lèi)多酚化合物，分子式C14H12O3，難溶于水，易溶于乙醇乙醚等有機(jī)試劑[6]。天然白藜蘆醇主要來(lái)自于葡萄、虎杖等植物。研究表明,白藜蘆醇具有抗菌[7]、抗氧化[8]等功效，對(duì)鼠的肝癌[9]、胃癌[10]、白血病[11]等都有明顯的抑制作用。白藜蘆醇還具有延長(zhǎng)秀麗隱形線蟲(chóng)和黑腹果蠅壽命[12]的作用。但是白藜蘆醇的不穩(wěn)定性限制了它的應(yīng)用。

本研究以小麥醇溶蛋白為原料，通過(guò)反溶劑法制備小麥醇溶蛋白納米粒子，并以其為載體進(jìn)行荷載白藜蘆醇的研究，以期獲得荷載白藜蘆醇的納米粒子，提高白藜蘆醇的穩(wěn)定性，擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域。文章首先考察工藝條件對(duì)納米粒子粒徑、Zeta電位等的影響，在此基礎(chǔ)上，制備負(fù)載白藜蘆醇的小麥醇溶蛋白納米粒子，并對(duì)其微觀結(jié)構(gòu)及紅外光譜的變化進(jìn)行了表征。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥醇溶蛋白:實(shí)驗(yàn)室自制，由谷朊粉提取，純度92%；白藜蘆醇:生工生物工程(上海)股份有限公司，純度≥98%；乙醇、鹽酸、氫氧化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

納米粒度及Zeta電位儀:英國(guó)馬爾文公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):翱藝儀器(上海)有限公司；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡:日本日立株式會(huì)社；傅里葉紅外光譜儀：美國(guó)Nicolet公司；冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 白藜蘆醇的紫外吸收波長(zhǎng)掃描

取一定質(zhì)量的白藜蘆醇，采用乙醇攪拌溶解，配制成白藜蘆醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.01%(m/V)的乙醇溶液，波長(zhǎng)范圍200～500 nm掃描。發(fā)現(xiàn)在306 nm處有最大吸收峰。

1.3.2 白藜蘆醇分解動(dòng)力學(xué)方程

操作過(guò)程中難免要使白藜蘆醇暴露在光下，測(cè)定白藜蘆醇的分解速率方程以消除計(jì)算過(guò)程中的誤差。取一定量白藜蘆醇(精確到0.01 mg)采用乙醇攪拌溶解，稀釋至合適濃度，在波長(zhǎng)306 nm下測(cè)定吸光度隨時(shí)間的變化值，并擬合出白藜蘆醇分解速率方程。

1.3.3 小麥醇溶蛋白自組裝納米粒子的制備

采用反溶劑法制備小麥醇溶蛋白自組裝納米粒子。小麥醇溶蛋白以一定質(zhì)量濃度分散于一定濃度的乙醇溶液，待其完全溶解。隨后吸取一定量的醇溶蛋白溶液，逐滴滴入到漩渦攪拌的分散液(一定pH、鹽濃度的去離子水溶液)，滴加完畢后繼續(xù)攪拌5～10 min，即獲得小麥醇溶蛋白自組裝納米粒子。分散液通過(guò)1 mol/L HCl溶液進(jìn)行pH值的調(diào)節(jié)，及1.00 mol/L NaCl溶液進(jìn)行鹽濃度的調(diào)節(jié)。此處分別考察溶劑乙醇濃度、蛋白濃度、分散液pH、分散液離子強(qiáng)度對(duì)納米粒子的性質(zhì)的影響，具體設(shè)置條件如下：乙醇濃度(35%、45%、55%、65%、75%)，蛋白濃度(1%、2%、4%、6%、8%)，分散液pH(2.5、4.5、6.5、8.5、10.5)，分散液鹽濃度(0.00、0.25、0.50、0.75 mol/L)。

1.3.4 負(fù)載白藜蘆醇自組裝納米粒子的制備

制備流程同1.2.3小麥醇溶蛋白納米粒子的制備方法。在最佳條件下制備負(fù)載白藜蘆醇自組裝納米粒子。在溶解有小麥醇溶蛋白的乙醇溶液中，分別按白藜蘆醇、小麥醇溶蛋白質(zhì)量比為0、1:5、1:10、1:20、1:40的比例加入白藜蘆醇，磁力攪拌至白藜蘆醇完全溶解。

1.3.5 負(fù)載白藜蘆醇自組裝納米粒子的包埋率及載藥率

取負(fù)載白藜蘆醇自組裝納米粒子的懸濁液1 mL,去離子水定容至25 mL。取5 mL定容后的液體超濾(超濾管分子截留量為10 ku)離心(4 000 r/min，20 min)，收集濾液。采用5 mL水洗滌超濾管截留物，上述條件離心，收集濾液。繼續(xù)重復(fù)洗滌2次，將所有濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，定容。在波長(zhǎng)306 nm處測(cè)定吸光度值。計(jì)算白藜蘆醇包埋率及載藥率，計(jì)算公式：

1.3.6 納米粒子表征

采用納米粒度及ZETA電位儀測(cè)定反溶劑法制備的小麥醇溶蛋白納米粒子的粒度、Zeta電位以及PDI。PDI是指多分散性系數(shù)，PDI越小，代表體系粒徑越均勻，一般認(rèn)為小于0.4較好。采用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡對(duì)納米粒子形貌觀察，及傅里葉紅外光譜儀對(duì)納米粒子進(jìn)行紅外光譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 白藜蘆醇的最大吸收峰

用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)白藜蘆醇的稀溶液進(jìn)行吸收波長(zhǎng)掃描，得到如圖1所示的譜圖，在306 nm處有最大吸收峰，這與Shi等[13]的研究結(jié)果類(lèi)似。試驗(yàn)過(guò)程需測(cè)定白藜蘆醇紫外吸光度時(shí)，均在306 nm處測(cè)定。

圖1 白藜蘆醇溶液的紫外吸收曲線

2.2 白藜蘆醇的分解動(dòng)力學(xué)方程

為了考察在將白藜蘆醇包埋到小麥醇溶納米粒子期間，白藜蘆醇的穩(wěn)定性，因此考察了150 min以?xún)?nèi)，白藜蘆醇的自身穩(wěn)定性。分別測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)樣品吸光度值，整個(gè)測(cè)定過(guò)程未避光。根據(jù)白藜蘆醇溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.104 5x-0.000 7，R2=0.999 8(y，吸光度；x，白藜蘆醇濃度，μg/mL)，計(jì)算出對(duì)應(yīng)濃度。以白藜蘆醇濃度(y,μg/mL)對(duì)時(shí)間(x,min)作圖(見(jiàn)圖2)，擬合出一條回歸曲線：y=-0.005 3x+6.248 7，R2=0.997 7。由于納米粒子的制備過(guò)程在60 min以?xún)?nèi)，測(cè)定的白藜蘆醇分解速率在這個(gè)時(shí)間段內(nèi)有較好的線性關(guān)系，故用作計(jì)算白藜蘆醇自身不穩(wěn)定所造成的分解量。

圖2 白藜蘆醇的分解速率曲線

2.3 小麥醇溶蛋白納米粒子制備的條件優(yōu)化

2.3.1 分散液pH對(duì)自組裝納米粒子的粒徑、電位、多分散性系數(shù)的影響

試驗(yàn)所用去離子水的pH為6.5，當(dāng)分散液pH偏離6.5時(shí)，粒徑呈現(xiàn)變小的趨勢(shì)(見(jiàn)表1)，這是因?yàn)樾←湸既艿鞍椎牡入婞c(diǎn)恰好在6.5附近，利于反溶劑過(guò)程中蛋白質(zhì)的析出，所以粒徑在此pH較大。在pH 4.5時(shí)平均粒徑最小，電位較大，乳液較穩(wěn)定，故選擇pH 4.5。

表1 分散液pH對(duì)自組裝納米粒子的粒徑、電位、多分散性系數(shù)的影響

2.3.2 乙醇濃度對(duì)納米粒子粒徑、多分散性系數(shù)及Zeta電位的影響

乙醇溶液溶解小麥醇溶蛋白后的體系呈淺黃色透明澄清溶液，隨著乙醇濃度的遞增，溶液的黃色越深，無(wú)肉眼可見(jiàn)的沉淀。說(shuō)明在此系列的乙醇溶液中，小麥醇溶蛋白都能完全溶解。如表2所示，隨著乙醇濃度的增大，小麥醇溶蛋白自組裝納米粒子的平均粒徑呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)。當(dāng)溶解醇溶蛋白的乙醇濃度越高，滴入分散液后，相應(yīng)的分散體系中乙醇含量也越高，醇溶蛋白分子在越高的乙醇濃度下溶解度越大，故不易析出，粒徑越小。乙醇濃度為65%時(shí)，Zeta電位最大。選擇溶劑乙醇濃度為65%。

表2 不同濃度的乙醇對(duì)自組裝納米粒子的粒徑、電位、多分散性系數(shù)的影響

2.3.3 蛋白質(zhì)濃度對(duì)納米粒子粒徑、多分散性系數(shù)及Zeta電位的影響

各組隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，粒徑有變大的趨勢(shì)(見(jiàn)表3)，醇溶蛋白濃度為4%時(shí)電位最高，說(shuō)明粒子間相互作用的排斥力最大，體系最穩(wěn)定。綜合粒徑、PDI和電位因素，選擇小麥醇溶蛋白濃度為4%。

表3 蛋白濃度對(duì)自組裝納米粒子的粒徑、電位、多分散性系數(shù)的影響

2.3.4 分散液鹽濃度對(duì)自組裝納米粒子的粒徑、電位、多分散性系數(shù)的影響

離子的存在使得蛋白質(zhì)的表面形成一層靜電屏蔽層，離子強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)的影響取決于蛋白質(zhì)表面的性質(zhì)。由于醇溶蛋白含有高比例的非極性區(qū)域，因此電荷屏蔽效應(yīng)使其溶解度下降。如表4所示，隨著鹽濃度的增大，形成的納米粒子的粒徑增大。選擇分散液鹽濃度為0.00 mol/L即去離子水。

表4 分散液鹽濃度對(duì)自組裝納米粒子的粒徑、電位、多分散性系數(shù)的影響

2.4 負(fù)載白藜蘆醇自組裝納米粒子的研究

最終確定采用分散液pH 4.5，乙醇濃度65%，蛋白濃度4%，分散液鹽濃度為0.00 mol/L制備負(fù)載白藜蘆醇的自組裝納米粒子。如表5所示，隨著芯材比例的減小，包埋率有所波動(dòng)，最高為55.0%。隨著芯壁材比例的減小，載藥率自最大值9.1%依次減小。這與殷婷等[14]用大麥醇溶蛋白包埋白藜蘆醇的載藥率相比偏低。這可能與小麥醇溶蛋白和大麥醇溶蛋白與白藜蘆醇的相互作用不同有關(guān)。大麥醇溶蛋白與白藜蘆醇的相互作用主要是氫鍵、范德華力、疏水相互作用，白藜蘆醇與大麥醇溶蛋白的疏水相互作用體現(xiàn)在對(duì)色氨酸殘基的疏水性上[15]。目前小麥醇溶蛋白與白藜蘆醇的相互作用還在研究中。

表5 白藜蘆醇的包埋率及載藥率

表6所示為負(fù)載白藜蘆醇納米粒子的粒徑及電位結(jié)果，由表可知，在所考察的芯壁材比例范圍內(nèi)，平均粒徑在146.8～193.65 nm，Zeta電位變化范圍10.23～21.28 mV。

表6 負(fù)載白藜蘆醇納米粒子的粒徑、多分散性系數(shù)及電位

2.5 掃描電子顯微鏡對(duì)納米粒子形貌觀察

對(duì)冷凍干燥后的納米粒子進(jìn)行場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡形貌觀察。當(dāng)不加入白藜蘆醇時(shí)，如圖3a所示，除了個(gè)別較大的粒子外，絕大多數(shù)為極小的納米粒子，而且較為均勻，粒子與粒子之間相互有所黏連。當(dāng)芯壁材比為1:5時(shí)，如圖3b所示，粒子粒徑變大，大顆粒的狹縫中夾雜許多小顆粒(如圖3c)，這說(shuō)明當(dāng)加入白藜蘆醇后，芯材被包裹，粒子的粒徑變大，還有未包埋到芯材的蛋白質(zhì)則像空白組一樣析出，粒徑不變化。當(dāng)芯壁材比例為1:40時(shí)，與空載相比，較大的顆粒數(shù)量增多，但體積增加并不明顯(如圖3d)，這是由于加入芯材后有部分芯材被包埋，但是由于芯壁材比例小，所以粒子粒徑并不像圖3b中那么大。

注：a小麥醇溶蛋白自組裝納米粒子,b芯壁材1:5負(fù)載白藜蘆醇納米粒子宏觀圖,c芯壁材1:5負(fù)載白藜蘆醇納米粒子微觀圖,d芯壁材1:40負(fù)載白藜蘆醇納米粒子。圖3 小麥醇溶蛋白納米粒子及其負(fù)載白藜蘆醇納米粒子的SEM圖

各組電鏡圖片可以看出，粒子表面光滑，沒(méi)有孔洞，沒(méi)有凸凹，說(shuō)明本方法制備的納米粒子具有良好的包埋性，可以很好地將芯材包封在粒子內(nèi)部。

2.6 傅里葉紅外變換光譜分析

對(duì)小麥醇溶蛋白、小麥醇溶蛋白納米粒子以及包埋白藜蘆醇的小麥醇溶蛋白納米粒子進(jìn)行傅里葉紅外變化光譜分析，得到如圖4所示的紅外吸收光譜。波數(shù)在3 300 cm-1處的吸收峰代表—O—H的伸縮振動(dòng),比較A與C發(fā)現(xiàn)，C在此處峰寬較之窄，說(shuō)明蛋白質(zhì)的羥基分子間締合形成了氫鍵，形成納米粒子后，氫鍵的締合作用減弱，這是由于反溶劑法制成納米粒子后，羥基親水被暴露在納米粒子的外表面，分子間的締合被減弱。比較B、C發(fā)現(xiàn)，蛋白納米粒子比負(fù)載白藜蘆醇的納米粒子締合效果強(qiáng)，并且B在3 300 cm-1處的峰沒(méi)有向低波數(shù)移動(dòng)的跡象，說(shuō)明白藜蘆醇與蛋白質(zhì)沒(méi)有明顯的氫鍵締合作用，進(jìn)一步提示白藜蘆醇與蛋白質(zhì)之間的作用力由疏水相互作用主導(dǎo)。

注:A小麥醇溶蛋白;B小麥醇溶蛋白負(fù)載白藜蘆醇納米粒子(芯壁比1:5);C小麥醇溶蛋白納米粒子。圖4 傅里葉紅外變換譜圖

3 結(jié)論

用反溶劑法制備小麥醇溶蛋白自組裝納米粒子，確定在乙醇濃度為65%，蛋白質(zhì)濃度4%，分散液pH為4.5，分散液鹽濃度為0.00 mol/L時(shí)，得到理想的納米粒子，其粒徑約為(185.1±8.5) nm,Zeta電位約為(19.36±1.03) mV。而后用該方法包埋白藜蘆醇，發(fā)現(xiàn)芯壁比為1:40時(shí)，包埋率最佳為55.0%，載藥率為1.5%，小麥醇溶蛋白負(fù)載白藜蘆醇后粒徑(166.7±3.7) nm，Zeta電位(15.68±0.74) mV。掃描電鏡顯示負(fù)載白藜蘆醇后的納米粒子表面光滑，顆粒較小，具有較好的包埋特性。傅里葉紅外變換光譜顯示將小麥醇溶蛋白制備成納米粒子后分子間的氫鍵發(fā)生了變化，同時(shí)羧羥基多了一種面外彎曲的振動(dòng)方式。

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Characterization of Gliadin Self-Assembly Nanoparticles Loaded with Resveratrol

Kong Xiangzhen Huang Fei Zhou Zhitong Wu Weihao

(State Key Laboratory of Food Science and Technology； School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122)

Gliadin is an important fraction of wheat gluten.Resveratrol was buried in the gliadin nanoparticles to stabilize the resveratrol.In this paper,gliadin nanoparticles were self-assembled by anti-solvent method.Effects of ethanol concentration,protein concentration,pH and salt concentration of the dispersion solution on the particle size and Zeta potential of the prepared nanoparticles were systematically studied.The desired nanoparticles,of which the mean diameter was(185.1±8.5) nm and the mean Zeta potential was(19.36±1.03) mV,were prepared under the condition of 65% ethanol concentration,4% protein concentration，pH 4.5 and 0.00 mol/L salt concentration.Under the optimum conditions,the gliadin nanoparticles loaded with resveratrol have best encapsulation efficiency when prepared with 1:40 core/wall ratio.The result showed that the prepared nanoparticles have 55.0% encapsulation efficiency and 1.5% drug loading rate with mean diameter of (166.67±3.7) nm,and mean Zeta potential of (15.68±0.74) mV.Gliadin nanoparticles can stabilize resveratrol.

gliadin,nanoparticle,self-assembly,resveratrol

TQ218

A

1003-0174(2017)11-0021-05

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201510295018)

2016-10-25

孔祥珍，女，1980年出生，副教授，植物蛋白科學(xué)與技術(shù)