梁衛(wèi)+周群+沈家敏+吳艮艮+張麗玲+陳曄+姚亮宇

摘要：目的 觀察風(fēng)濕痹痛方對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠血清細(xì)胞因子及滑膜組織Fas/FasL mRNA表達(dá)的影響，探討其相關(guān)的作用機(jī)制。方法 采用大鼠足部皮內(nèi)注射牛Ⅱ型膠原乳化劑方法建立CIA模型。實驗大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、雷公藤多苷組和風(fēng)濕痹痛方低、中、高各劑量組，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)14 d。觀察各組大鼠體質(zhì)量和關(guān)節(jié)炎評分；ELISA檢測血清白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-15、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1含量；RT-PCR檢測滑膜組織Fas、FasL的mRNA表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，風(fēng)濕痹痛方中、高劑量組大鼠足部關(guān)節(jié)炎評分和血清IL-15含量顯著降低，TGF-β1含量顯著升高（P<0.01），風(fēng)濕痹痛方高劑量組Fas mRNA表達(dá)顯著降低，F(xiàn)asL mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05）。結(jié)論 風(fēng)濕痹痛方對CIA有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能是通過調(diào)控Fas/FasL凋亡系統(tǒng)，誘導(dǎo)滑膜組織細(xì)胞凋亡，抑制滑膜增生。

關(guān)鍵詞：風(fēng)濕痹痛方；膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎；炎性因子；細(xì)胞凋亡；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.013

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）12-0052-04

Effects of Fengshi Bitong Prescription on Cytokines in Serum and Synovial Fas/FasL mRNA Expression in Rats with Collagen-Induced Arthritis LIANG Wei1， ZHOU Qun2， SHEN Jia-min2， WU Gen-gen2， ZHANG Li-ling1， CHEN Ye1， YAO Liang-yu3 （1. No.454 Hospital of PLA， Nanjing 210002， China； 2.Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China； 3. Xuzhou Medical University， Xuzhou 221004， China）

Abstract： Objective To observe the effects of Fengshi Bitong Prescription （FSBT） on cytokines in serum and Fas/FasL mRNA expression system in synovium； To discuss relevant mechanism of action. Methods Rats were given foot intradermal injection of bovine type Ⅱ collagen emulsion to establish collagen-induced arthritis （CIA） model. After successful modeling， they were randomly divided into 6 groups： normal control group， CIA model group， tripterygium glycosides group， FSBT high-， medium-， and low-dose groups. Each medication group was given relevant medicine for gavage for 14 d. The weight and arthritis scores of CIA rats were observed. Serum levels of IL-1β， IL-15， and TGF-β1 were detected by ELISA. Expressions of Fas and FasL mRNA in synovium of CIA rats were detected by real-time PCR. Results Compared with model group， the foot arthritis score and serum levels of IL-15 in FSBT high- and medium-dose groups significantly decreased （P<0.01）， and the serum level of TGF-β1 significantly increased （P<0.05）. Expression of Fas significantly decreased and FasL significantly increased in FSBT high-dose group （P<0.05）. Conclusion FSBT may have certain immune regulation effects on rheumatoid arthritis. Its mechanism may be in regulating Fas/FasL apoptosis system， thereby inducing apoptosis of synovial cells and inhibiting synovial hyperplasia.

Key words： Fengshi Bitong Prescription； collagen-induced arthritis； cytokine； apoptosis； rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主的全身性慢性自身免疫系統(tǒng)疾病，伴有關(guān)節(jié)滑膜增生、關(guān)節(jié)軟骨、骨組織破壞，嚴(yán)重可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能喪失，其主要病機(jī)為氣血虧虛、風(fēng)寒濕邪外侵、化毒內(nèi)郁、氣滯血瘀、脈絡(luò)痹阻。前期研究表明，風(fēng)濕痹痛方對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用，可提高caspase-8的表達(dá)，影響Fas/FasL介導(dǎo)的滑膜細(xì)胞凋亡，減少關(guān)節(jié)損傷[1]。本實驗采用大鼠足部皮內(nèi)注射牛Ⅱ型膠原乳化劑，建立膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）模型，觀察風(fēng)濕痹痛方對CIA大鼠血清白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-15、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1含量及滑膜組織Fas、FasL mRNA表達(dá)的影響，探討其相關(guān)的作用機(jī)制，為風(fēng)濕痹痛方的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。endprint

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，鼠齡8周，體質(zhì)量220～250 g，上海杰思捷實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（滬）2013-0003。飼養(yǎng)于室溫（24±1）℃、相對濕度（55±10）%的環(huán)境，光照明暗交替12 h/12 h，自由飲水?dāng)z食。

1.2 藥物

風(fēng)濕痹痛方（桂枝10 g、黃芪20 g、赤芍15 g、白芍15 g、當(dāng)歸10 g、細(xì)辛3 g、追地風(fēng)15 g、忍冬藤15 g等），南京中醫(yī)藥大學(xué)提供，批號20170125；雷公藤多苷片，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，批號170108。

1.3 主要試劑與儀器

牛Ⅱ型膠原，Chondrex公司；弗氏完全佐劑，美國Sigma公司；大鼠IL-15、IL-1β和TGF-1β ELISA試劑盒，南京金益柏有限公司；Fas一抗，美國Proteintech公司；FasL一抗，北京博奧森生物公司。酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司），電泳儀（美國Bio-Rad公司），Lightcycler 96型PCR，Roche公司。

2 實驗方法

2.1 造模

參照文獻(xiàn)[2-3]方法造模。取適量牛Ⅱ型膠原，加入0.1 mol/L冰乙酸，4 ℃振蕩過夜，濃度為8 mg/mL，再按1∶1加入弗式完全佐劑充分混合乳化，制成Ⅱ型膠原蛋白乳化劑，最終濃度為4 mg/mL。60只SD大鼠隨機(jī)選取50只，右后足跖皮內(nèi)注射0.1 mL/只膠原蛋白乳化劑制備CIA模型。造模后大鼠右后側(cè)足部紅腫明顯、體積增大，表明造模成功。

2.2 分組和給藥

將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、雷公藤多苷片組（7.5 mg/kg）和風(fēng)濕痹痛方低、中、高劑量組（9.5、19、38 g/kg），每組10只，其余10只大鼠為空白組。致炎第14日開始，各給組給予相應(yīng)濃度藥液灌胃，空白組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。給藥體積為1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)14 d。

2.3 體質(zhì)量和足部關(guān)節(jié)炎評分

大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，每周稱量大鼠體質(zhì)量，同時每隔1周進(jìn)行大鼠足部關(guān)節(jié)炎測定評分，觀察大鼠繼發(fā)性病變。根據(jù)《中藥藥理實驗方法學(xué)》[4]進(jìn)行評分。0分：正常；1分：腳踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑及輕微腫脹；2分：踝關(guān)節(jié)到趾關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)紅斑和輕微腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)到趾關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹；4分：踝關(guān)節(jié)到趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和重度腫脹。

2.4 白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-15、轉(zhuǎn)化生長因子-β1含量檢測

當(dāng)日末次給藥1 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，取腹主動脈血，3000 r/min離心10 min，取血清-20 ℃保存。采用血清IL-1β、IL-15、TGF-β1 ELISA試劑盒測定含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.5 滑膜組織Fas、FasL mRNA表達(dá)檢測

將從大鼠后腿取出來的滑膜組織做成組織勻漿，Trizol法提取RNA，按PCR操作說明書檢測滑膜組織Fas、FasL mRNA表達(dá)?；蛞镆姳?。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 風(fēng)濕痹痛方對模型大鼠體質(zhì)量和足部關(guān)節(jié)炎評分的影響

各組大鼠體質(zhì)量未見明顯差異，見表2。模型組大鼠關(guān)節(jié)炎評分較空白組差異明顯；雷公藤多苷片組大鼠關(guān)節(jié)炎評分第21、28日和風(fēng)濕痹痛方中、高劑量組大鼠第28日關(guān)節(jié)炎評分顯著降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），見表3。

4.2 風(fēng)濕痹痛方對模型大鼠血清相關(guān)細(xì)胞因子含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清IL-15、IL-1β含量顯著升高，TGF-β1含量明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，風(fēng)濕痹痛方高、中劑量組血清IL-15含量顯著降低，TGF-β1含量明顯升高（P<0.01），IL-1β含量各劑量組有下降趨勢（P>0.05）。結(jié)果見表4。

4.3 風(fēng)濕痹痛方對模型大鼠滑膜組織Fas、FasL mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織Fas mRNA表達(dá)顯著升高，F(xiàn)asL mRNA表達(dá)顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，風(fēng)濕痹痛方高劑量組和雷公藤多苷片組Fas mRNA表達(dá)顯著下降，F(xiàn)asL mRNA表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表5。

5 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。風(fēng)濕痹痛方中桂枝、追地風(fēng)、細(xì)辛祛風(fēng)散寒、溫經(jīng)通絡(luò)，黃芪、白芍、當(dāng)歸益氣養(yǎng)血、活血通絡(luò)，忍冬藤、赤芍清熱解毒消腫、涼血化瘀。全方共奏補(bǔ)益氣血、祛風(fēng)散寒、溫經(jīng)通絡(luò)、解毒消腫、行氣活血、化瘀止痛之功。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，其致病與多種免疫活性細(xì)胞的活化及細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)相關(guān)，并與滑膜組織細(xì)胞凋亡障礙、滑膜增生相關(guān)。

IL-l主要來源于單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥相關(guān)的重要細(xì)胞因子，刺激B細(xì)胞和T細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和抗體，同時刺激軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞釋放細(xì)胞毒素。1L-15主要由黏附性外周血單個核細(xì)胞產(chǎn)生，可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞的增殖、分化和調(diào)控，誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化和免疫球蛋白的分泌，能刺激TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白-1和IL-17等炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)或促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞間的黏附，有助于白細(xì)胞聚集于炎癥局部，并通過增加Bcl-x（L）和Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)滑膜T細(xì)胞增殖。TGF-β1是一種重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化的多肽因子，具有調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞生長、炎癥細(xì)胞趨化、成纖維細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解等作用，其在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起重要作用[5]。Fas又稱為CD95，該蛋白體的C端在細(xì)胞膜內(nèi)，負(fù)責(zé)傳遞細(xì)胞凋亡的信號，N端在細(xì)胞膜外，負(fù)責(zé)與特異性Fas配體（FasL）結(jié)合并誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎時滑膜細(xì)胞增生，與凋亡抑制有關(guān)，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理過程中具有重要調(diào)控作用[6-7]。endprint

本實驗結(jié)果表明，風(fēng)濕痹痛方可降低CIA大鼠關(guān)節(jié)炎評分，顯著下調(diào)血清IL-15水平，明顯升高TGF-β1含量，顯著下調(diào)Fas mRNA表達(dá)，顯著升高FasL mRNA表達(dá)。綜上所述，風(fēng)濕通痹方能抑制膠原性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)，具有免疫調(diào)節(jié)作用，并調(diào)控Fas/FasL凋亡系統(tǒng)，誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡，抑制滑膜增生。本研究僅為風(fēng)濕痹痛方藥效和機(jī)制的初步探討，今后將進(jìn)一步開展細(xì)胞水平、蛋白表達(dá)水平研究，深入闡明該方的作用機(jī)理。

參考文獻(xiàn)：

[1] 梁衛(wèi)，梁濤，張麗玲，等.風(fēng)濕痹痛方治療大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎的實驗研究[J].中國中醫(yī)急癥，2017，26（1）：83-85.

[2] 李寶麗，唐方，龐曉東.Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型制備[J].中國免疫學(xué)雜志，2006，22（4）：350.

[3] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：347.

[4] 魏偉，吳希美.李元建.藥理實驗方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社， 2010：663.

[5] 孫麗霞.轉(zhuǎn)化生長因子-β1與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2002，23（5）：310-312.

[6] PERLMAN H， PAGLIARI L J， LIU H， et al. Rheumatoid arthritis synovial macrophages express the Fas assciated death domain-like interleukin-1 beta-converting enzyme-inhibitory protein and are refractory to Fas mediated apoptosis[J]. Arthritis Rheum，2001， 44（1）：21-30.

[7] DRYNDA A， QUAX P H， NEUMANN M， et al. Gene transfer of tissue inhibitor of metalloproteinases-3 reverses the inhibitor effects of TNF-alpha on Fas-induced apoptosis in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts[J]. J Immunol，2005，174（10）：6524-6531.

（收稿日期：2017-05-08）

（修回日期：2017-06-11；編輯：華強(qiáng)）endprint