王山山, 崔蘭玉,薛正蓮,張 翀,邢新會(huì)
(1. 安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽 蕪湖 241000;2. 清華大學(xué) 化學(xué)工程系 生物化工研究所 工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100084;3. 清華大學(xué) 合成與系統(tǒng)生物學(xué)中心,北京 100084)
扭脫甲基桿菌AM1生物加工過(guò)程研究進(jìn)展
王山山1, 崔蘭玉2,3,薛正蓮1,張 翀2,3,邢新會(huì)2,3
(1. 安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽 蕪湖 241000;2. 清華大學(xué) 化學(xué)工程系 生物化工研究所 工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100084;3. 清華大學(xué) 合成與系統(tǒng)生物學(xué)中心,北京 100084)
甲醇作為重要的一碳化工原料,可由甲烷、合成氣和CO2等轉(zhuǎn)化制得。扭脫甲基桿菌AM1是以甲醇作為唯一碳源和能源來(lái)進(jìn)行生物發(fā)酵的微生物。由于原料來(lái)源廣泛,發(fā)酵過(guò)程染菌的風(fēng)險(xiǎn)低,且能夠利用合成培養(yǎng)基降低生產(chǎn)成本,同時(shí)產(chǎn)物后處理簡(jiǎn)單,扭脫甲基桿菌AM1被廣泛利用在生物化工領(lǐng)域。目前,扭脫甲基桿菌AM1以甲醇作為碳源,已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,扭脫甲基桿菌AM1以甲醇為底物有望合成更多高附加值的產(chǎn)品。本文中,筆者對(duì)扭脫甲基桿菌AM1生物加工過(guò)程進(jìn)行綜述,希望對(duì)甲醇基生物工業(yè)有所啟發(fā)。
甲醇;生物化工;高附加值產(chǎn)品;扭脫甲基桿菌AM1
甲醇作為一種重要的化工原料,可由煤、石油、天然氣、合成氣等化石資源以及生物質(zhì)等可再生資源生產(chǎn)。在我國(guó),甲醇是煤化工的重要產(chǎn)物,據(jù)CMAI數(shù)據(jù)顯示,目前我國(guó)甲醇產(chǎn)量占世界產(chǎn)量的50%。隨著低溫、低壓合成甲醇技術(shù)的快速推廣,甲醇的產(chǎn)量仍然在不斷增長(zhǎng)。甲醇的高值化轉(zhuǎn)化和利用成為碳一化工的重要課題。早在20世紀(jì)70年代,英國(guó)、挪威和日本等國(guó)以甲醇為碳源,利用甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白[1]。為了開(kāi)辟甲醇的利用新途徑,近年來(lái),隨著代謝工程、合成生物學(xué)、基因組學(xué)和生物過(guò)程工程的進(jìn)步,對(duì)甲醇利用微生物的認(rèn)識(shí)和工程化改造能力不斷深入,通過(guò)途徑工程實(shí)現(xiàn)了以甲醇為碳源生產(chǎn)多種高附加值產(chǎn)品。
甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物簡(jiǎn)稱甲基營(yíng)養(yǎng)菌,是一類能以非C—C鍵化合物作為碳源和能源的微生物的統(tǒng)稱[2],廣泛存在于空氣、水、土壤以及植物表面,在全球碳循環(huán)中具有重要作用[3]。甲基營(yíng)養(yǎng)菌能夠以甲醇作為唯一碳源和能源,在廉價(jià)的合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并合成各種代謝產(chǎn)物,自甲基營(yíng)養(yǎng)菌(Methylomonasmethanica)在1906年首次發(fā)現(xiàn)以來(lái),得到了廣泛而深入的研究[4]。
甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌主要分布在朊細(xì)菌門(mén)(P r o t e o b a c t e r i a)、α-朊細(xì)菌亞門(mén)(α-P r o t e o b a c t e r i a)、α-變形菌綱(α-Epsilonproteobacteria)、根瘤菌目(Rhizobiales)甲基桿菌科(Methylobacteriaceae)和甲基桿菌屬(Methylobacterium)中[3-5]。系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分類主要是根據(jù)甲基營(yíng)養(yǎng)菌的生理生化特征來(lái)分的,能夠利用絲氨酸(Serine)循環(huán)和卡爾文循環(huán)(CBB)進(jìn)行甲醛同化作用的為α-變形菌綱;能夠單一性利用非甲烷甲基類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的為β-變形菌綱;能夠利用核酮糖單磷酸循環(huán)(RuMP)進(jìn)行甲醛同化作用的為γ-變形菌綱[6-7]。
扭脫甲基桿菌AM1(MethylobacteriumextorquensAM1)是以甲醇為唯一碳源和能源生長(zhǎng)代謝的甲醇營(yíng)養(yǎng)菌,它可以通過(guò)聚羥基脂肪酸酯(PHB)合成途徑、甲基丙二酸單酰輔酶A(EMC)循環(huán)、Serine循環(huán)進(jìn)行C1同化作用。扭脫甲基桿菌AM1菌體呈粉紅色,屬于嚴(yán)格好氧型微生物,在細(xì)菌分類學(xué)上屬于α-變形菌綱,是革蘭氏陰性菌[8]。扭脫甲基桿菌是研究甲基代謝的模式菌株,在1960年被發(fā)現(xiàn)后,研究工作主要集中在菌體培養(yǎng)和生理特性研究,直到20世紀(jì)80年代才開(kāi)始基因克隆方面的研究。
本文中,筆者將首先綜述甲基營(yíng)養(yǎng)微生物的代謝特征,隨后著重介紹甲基營(yíng)養(yǎng)菌模式微生物扭托甲基桿菌AM1在甲醇高值化生物加工過(guò)程中的最新研究進(jìn)展,并討論其面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn)。
甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物有4種甲醇代謝方式[9]如圖1所示。它們分別是XuMP 循環(huán)、絲氨酸循環(huán)、CBB循環(huán)和RuMP循環(huán)。對(duì)于一些甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌,有絲氨酸循環(huán)的α-變形桿菌稱為I型菌株,而含有核酮糖單磷酸途徑的γ-變形桿菌綱稱為II型菌株,能以甲烷為碳源的稱為III型菌株[10]。分別以扭脫甲基桿菌AM1、甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母(Methylotrophic yeast)、能以甲烷為碳源的菌株(AcidimethylosilexfumarolicumSolV)、嗜有機(jī)甲基菌(Methylophilusmethylotrophus)和甲基單胞菌(Methylomonasmethanolica)研究最多,其中后2種實(shí)現(xiàn)了工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。
在甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母中[11],2.06CH3OH+2.02O2+0.15NH3+nutrient→CH1.75O0.5N0.15(biomass)+1.06CO2+3.47H2O,ΔH=-268.4 kJ/mol,約49%的甲醇形成生物量,51%的甲醇生成能量,酵母的生物細(xì)胞得率為0.37~0.45[12]。
I型菌株中甲醇代謝方程[13]:1.63CH3OH+1.39O2+0.23NH3+nutrient→CH169O038N024(biomass)+0.63CO2+2.76H2O,ΔH=-449.7 kJ/mol,約38%的甲醇生成能量,62%形成生物量。I型菌株細(xì)胞得率為0.55 g/g,要高于甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母[12],II型菌株能夠再利用細(xì)胞代謝產(chǎn)生的約1/5的CO2形成約50%生物量,相當(dāng)于減少了16%甲醇消耗[14],因此,I型菌株生物量底物得率要高于II型菌株。I型菌株特別是模式微生物AM1,已經(jīng)成為甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌的模式菌株。
甲基營(yíng)養(yǎng)菌以甲醇作為碳源,利用核酮糖單磷酸循環(huán)、絲氨酸循環(huán)進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝,已經(jīng)被用來(lái)合成多種高附加值產(chǎn)品,以甲醇作為碳源的甲基營(yíng)養(yǎng)菌的生長(zhǎng)參數(shù)如表1所示。
圖1 甲醇在甲基營(yíng)養(yǎng)菌中的代謝方式[8]Fig.1 Metabolic patterns of methanol in methylotrophic bacteria
菌種代謝途徑細(xì)胞產(chǎn)率/(g·L-1)細(xì)胞干質(zhì)量/(g·L-1)細(xì)胞得率/(g·g-1)備注φ(甲醇)/%文獻(xiàn)MethylomonasmethanolicaRuMP2550050SCP工業(yè)04~11[1]Methylomonassp.RuMP284114049連續(xù)過(guò)程05~1[2]MethylobacteriumorganophilumSerine36250034PHA02[3]Methylobacteriumsp.Serine2172PHA050[5]MethylobacteriumextorquensSerine12561028GFP018[15]Mixedculture455106044連續(xù)過(guò)程013[16]
注:SCP—單細(xì)胞蛋白;Mixed culture—多菌混合培養(yǎng)。
扭脫甲基桿菌AM1的C1代謝圖譜[17]、全基因序列[18]和代謝網(wǎng)絡(luò)[19]等均得到了闡明,各國(guó)科學(xué)家的研究大多基于PHB合成途徑、EMC循環(huán)和Serine循環(huán)構(gòu)建大量工程菌株用于生產(chǎn)多種化合物,特別是2014年以來(lái),各國(guó)研究者不斷嘗試?yán)没蚬こ痰氖侄伪磉_(dá)外源基因來(lái)生產(chǎn)功能化PHB[20]、生物能源[21]、富康酸[22]和蛇麻烯[23]等,隨著人們認(rèn)識(shí)的深入,將大大拓展甲基營(yíng)養(yǎng)菌的應(yīng)用前景。下面將從PHB循環(huán)產(chǎn)物、EMC循環(huán)的化學(xué)品和氨基酸產(chǎn)物這幾個(gè)方面來(lái)介紹扭脫甲基桿菌AM1利用甲醇作為底物生產(chǎn)多種高附加值化合物的情況。
2.1 PHB循環(huán)產(chǎn)物
PHB(聚β-羥基丁酸)是菌體儲(chǔ)能物質(zhì),具有優(yōu)良的生物可降解性和組織相容性,可用于包裝、醫(yī)藥衛(wèi)生和紡織等領(lǐng)域。AM1作為天然產(chǎn)PHB的菌株,有30多年研究歷史,PHB產(chǎn)量最高達(dá)到149 g/L,占細(xì)胞干質(zhì)量的64%,細(xì)胞得率達(dá)到0.2 g/g[24]。表2為不同的研究者利用M.extorquens生產(chǎn)PHB情況。
從表2可知,原始菌株可以達(dá)到較高的細(xì)胞密度(83.88 g/L)[24],工程菌發(fā)酵最高僅為5 g/L[30]。M.extorquens發(fā)酵過(guò)程或者搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中甲醇體積分?jǐn)?shù)均不高于1%(7.94 g/L)。從工業(yè)應(yīng)用的角度來(lái)看,PHB作為大宗化學(xué)品,提高總產(chǎn)量和單位時(shí)間產(chǎn)量是關(guān)鍵,除了要解決工程菌株代謝平衡的問(wèn)題,提高菌株耐受甲醇的能力也十分重要。
日本名古屋大學(xué)的Suzuki教授對(duì)高密度發(fā)酵產(chǎn)PHB的研究最為充分,他們的研究獲得了最高的生物量,具有重要的參考價(jià)值[24]。他們根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)PHB的過(guò)程曲線,將發(fā)酵分為2個(gè)階段,分別為細(xì)胞生長(zhǎng)階段和產(chǎn)PHB階段,研究了氮源補(bǔ)料的兩種策略。細(xì)胞生長(zhǎng)階段通過(guò)氨水來(lái)控制的pH,當(dāng)細(xì)胞質(zhì)量濃度達(dá)到60 g/L,細(xì)胞進(jìn)入產(chǎn)PHB階段后,采取2種策略:①停止補(bǔ)加氨水并且不再流加任何氮源;②氨水進(jìn)入恒速補(bǔ)料模式:0.52、0.26、0.08和0.02 g/h的補(bǔ)料速率。在2種補(bǔ)氮方式中,微量元素與氨水同時(shí)流加。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在PHB生產(chǎn)階段,添加少量氮源比不添加氮源更有利于積累PHB,但添加過(guò)量的氮源會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中的PHB降解。方式①在175 h達(dá)到136 g/L的PHB產(chǎn)量,得率為0.18 g/g;在90 h時(shí),PHB占細(xì)胞干質(zhì)量的60%。方式②中,氨水流加速率為0.08 g/h時(shí),在58 h,PHB就占細(xì)胞干質(zhì)量的60%,在100 h,細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)到200 g/L,但方式②也有一些問(wèn)題,比如氨水恒速流加導(dǎo)致氨水過(guò)量對(duì)細(xì)胞造成毒害。1986年,Suzuki等[25]用第2種氮源流加方式,研究補(bǔ)料液中的碳氮比(C/N比)為750、100、125、163、213和250時(shí)對(duì)PHB產(chǎn)量的影響。首先將補(bǔ)料C/N比與單位細(xì)胞中PHB的含量進(jìn)行線性擬合,然后將單位細(xì)胞中PHB的含量與尾氣中的CO2含量進(jìn)行線性擬合,實(shí)現(xiàn)通過(guò)檢測(cè)尾氣中CO2濃度自動(dòng)控制補(bǔ)料液中的C/N比來(lái)達(dá)到更高的PHB產(chǎn)量。當(dāng)發(fā)酵121 h,在C/N比為100的條件下,PHB產(chǎn)量達(dá)到136 g/L,延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間為170 h,PHB產(chǎn)量達(dá)到149 g/L,細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)到233 g/L,細(xì)胞中PHB含量為64%,產(chǎn)物得率為0.2 g/g。研究還發(fā)現(xiàn),通過(guò)C/N比可以控制PHB在細(xì)胞中的含量,PHB的比生成速率以及微生物的代謝能夠維持在較高的水平。
表2 利用M. extorquens 生產(chǎn)PHB情況
由于純的PHB結(jié)晶度較高,剛性和脆性存在不足,通過(guò)將PHB與羥基烷酸酯或其他單體共聚生成功能型PHB來(lái)改善純PHB的機(jī)械性能。培養(yǎng)基中添加戊酸酯、正戊醇[28-29]、飽和/非飽和羧酸[27]等底物就能利用合成功能型PHB。但通過(guò)外源添加輔助底物會(huì)增加經(jīng)濟(jì)成本。因此,在2014年,Orita等[20]通過(guò)代謝網(wǎng)絡(luò)改造菌株,不需添加其他底物,僅利用甲醇就能生產(chǎn)功能型 PHB,大大節(jié)約成本,但目前菌株產(chǎn)量比較低,還需進(jìn)一步改進(jìn)。
2.2 基于絲氨酸循環(huán)及EMC循環(huán)的化學(xué)品合成
絲氨酸循環(huán)和EMC循環(huán),它們擁有部分相同代謝途徑,使得這兩個(gè)循環(huán)之間構(gòu)成了相互聯(lián)系的代謝循環(huán)網(wǎng)絡(luò),而這樣的代謝網(wǎng)絡(luò)是M.extorquensAM1菌株能夠更好地利用甲醇作為碳源進(jìn)行正常生長(zhǎng)代謝和生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的重要基礎(chǔ)。絲氨酸循環(huán)途徑是M.extorquensAM1在代謝中重要的中心代謝途徑,存在于各中心代謝途徑的交匯處,同時(shí)它在代謝中擁有同化途徑的大部分碳流。2009年,Peyraud等[31]通過(guò)13C代謝組學(xué)分析首次發(fā)現(xiàn)AM1含有EMC循環(huán),EMC循環(huán)的碳流豐富,約占細(xì)胞總碳流的1/4,該循環(huán)含有多個(gè)分支,包括飽和/不飽和的化合物,手性的C4和C5-酰基輔酶A酯等,使得AM1具有生產(chǎn)特殊化合物的潛能,能夠合成相應(yīng)的二元羧酸,如乙基丙二酸、(2S)-甲基丁二酸、甲基延胡索酸和(2R/2S)-甲基丙二酸等[31]。表3為研究者們利用M.extorquensAM1絲氨酸循環(huán)和EMC循環(huán)表達(dá)外源產(chǎn)物的研究結(jié)果總結(jié)。
表3 利用M. extorquensAM1絲氨酸及EMC循環(huán)表達(dá)外源產(chǎn)物
最近幾年M.extorquensAM1的應(yīng)用研究主要集中在EMC途徑輔酶A衍生物的合成。EMC循環(huán)途徑是輔酶A代謝物的途徑,包含了從二碳到五碳的輔酶A物質(zhì),這些輔酶A物質(zhì)是萜類化合物、生物燃料、生物塑料、生物醫(yī)藥等的前體物質(zhì),具有非常大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。Sonntag等[22]研究發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌的?;o酶A硫酯酶YciA可切割Mesaconyl-CoA和(2S)-Methylsuccinyl-CoA的輔酶A,生成新的物質(zhì)中康酸酯和2-甲基琥珀酸[22]。隨著方法技術(shù)和操作工具的不斷完善,對(duì)M.extorquensAM1的改造手段也越來(lái)越豐富。Hu等研究者在M.extorquensAM1中構(gòu)建異源1-丁醇合成途徑,并利用基因過(guò)表達(dá)和基因敲除技術(shù)提高1-丁醇產(chǎn)量。Sonntag等[23]在M.extorquensAM1中構(gòu)建異源蛇麻烯合成途徑,利用基因過(guò)表達(dá)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)工程方法調(diào)節(jié)酶的表達(dá)生產(chǎn)蛇麻烯。筆者所在課題組的Zhu等[33]研究者在M.extorquensAM1中構(gòu)建異源甲羥戊酸上游合成途徑,利用基因過(guò)表達(dá)、基因篩選和RBS工程方法優(yōu)化酶的表達(dá)生產(chǎn)甲羥戊酸,并利用代謝組學(xué)方法找到途徑的限速步。由表3可知:目前嘗試?yán)肊MC循環(huán)表達(dá)外源產(chǎn)物還處于搖瓶水平,僅Schrader課題組達(dá)到了30 g/L的細(xì)胞密度,但Sonntag等[23]使用MP培養(yǎng)基中大量添加價(jià)格昂貴的哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)作為緩沖液,難以用于工業(yè)應(yīng)用。崔蘭玉等[34]通過(guò)培養(yǎng)基組分的優(yōu)化,得到了既能夠滿足M.extorquensAM1菌體穩(wěn)定生長(zhǎng),同時(shí)又降低了成本的MC培養(yǎng)基,為以后M.extorquensAM1能夠利用低成本的培養(yǎng)基進(jìn)行高附加值的產(chǎn)品的生產(chǎn)研究提供了更有利的方法。
2.3 氨基酸以及蛋白質(zhì)生產(chǎn)
AM1的絲氨酸循環(huán),占細(xì)胞大部分碳流[30],提供了從廉價(jià)甲醇來(lái)生產(chǎn)絲氨酸的可能性。Sirriote等[33]進(jìn)行了利用凍融的AM1細(xì)胞產(chǎn)絲氨酸的嘗試,凍融后的細(xì)胞膜呈多孔的結(jié)構(gòu),有利于絲氨酸分泌到胞外,控制甲醇質(zhì)量濃度在104 mg/mL,使細(xì)胞處于靜息狀態(tài),抑制絲氨酸消耗,絲氨酸終產(chǎn)量達(dá)到54.9 g/L[33]。重組(異源)蛋白包括醫(yī)藥蛋白和工業(yè)酶制劑,占據(jù)著數(shù)十億美元的市場(chǎng)份額,目前醫(yī)藥蛋白生產(chǎn)的主要宿主是大腸桿菌和畢赤酵母。許多研究者嘗試?yán)肁M1表達(dá)外源蛋白,見(jiàn)表4。
以AM1作為宿主進(jìn)行產(chǎn)4種蛋白的嘗試,也仍處于搖瓶培養(yǎng)階段。綠色熒光蛋白(GFP)產(chǎn)量最高,達(dá)到14 g/L,占細(xì)胞干質(zhì)量的16%。大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)異源蛋白的產(chǎn)量已經(jīng)超過(guò)5 g/L,超過(guò)細(xì)胞干質(zhì)量的50%[40]。雖然AM1蛋白表達(dá)量低,而且缺少蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后的修飾機(jī)制,但相對(duì)于畢赤酵母,AM1具有更高的細(xì)胞得率,培養(yǎng)初期以甲醇作為唯一碳源,控制過(guò)程也相對(duì)簡(jiǎn)單,將來(lái)調(diào)整AM1的蛋白分泌機(jī)制,提高蛋白產(chǎn)量,會(huì)是一個(gè)很有前景的研究方向。
表4 利用M.extorquens AM1表達(dá)外源蛋白
微生物細(xì)胞工廠在生產(chǎn)生物產(chǎn)品方面已經(jīng)成為了不可取代的重要平臺(tái),已經(jīng)生產(chǎn)了多種有價(jià)值的高附加值產(chǎn)品。通過(guò)途徑工程的手段來(lái)改造微生物細(xì)胞的方法,使得微生物細(xì)胞工廠能生產(chǎn)出更多自身本不能合成的產(chǎn)品。M.extorquensAM1能以甲醇作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝,是甲醇基微生物細(xì)胞工廠的重要宿主菌。利用M.extorquensAM1為宿主菌來(lái)生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品是研究甲基菌的重要方向。扭脫甲基桿菌經(jīng)過(guò)多位研究者50多年的研究,它的生理生化特性被研究透徹。隨著生物技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)該菌認(rèn)知的積累,M.extorquensAM1的基礎(chǔ)研究工作得到快速發(fā)展,尤其是組學(xué)方面的研究取得了一系列的突破進(jìn)展。這些組學(xué)研究讓我們對(duì)M.extorquensAM1有了深入的理解,為工程化改造菌株生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品提供了重要的指導(dǎo)??偟膩?lái)說(shuō),早期M.extorquensAM1的應(yīng)用案例都是基于發(fā)酵調(diào)控策略或簡(jiǎn)單的基因過(guò)表達(dá),但在2014年之后,隨著組學(xué)研究的不斷深入和基因操作工具的不斷豐富,對(duì)M.extorquensAM1的改造涉及多層次的基因水平調(diào)控,產(chǎn)品種類開(kāi)始多樣化,作為碳一微生物細(xì)胞工廠逐漸受到廣泛關(guān)注。
然而,甲醇作為底物仍然面臨兩個(gè)重要挑戰(zhàn):一個(gè)是發(fā)酵過(guò)程中高耗氧、高產(chǎn)熱的問(wèn)題。另一個(gè)是甲醇的細(xì)胞毒性,工業(yè)生產(chǎn)中需要嚴(yán)格控制甲醇濃度,不利于發(fā)酵過(guò)程的放大。關(guān)于第一個(gè)問(wèn)題,是底物本身存在的缺陷,這一缺陷在高密度培養(yǎng)中會(huì)更加明顯,解決高耗氧過(guò)程中氧傳遞是這一過(guò)程的關(guān)鍵因素。關(guān)于第二個(gè)問(wèn)題,目前僅有AM1耐受丁醇的報(bào)道[39],且發(fā)現(xiàn)K+/質(zhì)子泵對(duì)丁醇的耐受性至關(guān)重要。關(guān)于AM1甲醇耐受性的研究非常少,其耐受甲醇機(jī)理尚不清楚,如何獲得高耐受甲醇的菌株對(duì)工業(yè)生產(chǎn)和解析甲基菌耐受甲醇的機(jī)理都非常重要。
目前,大多數(shù)微生物只能利用甲醇作為底物來(lái)生產(chǎn)少量的高附加值產(chǎn)品,遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到以甲醇為底物大規(guī)模生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的工業(yè)化規(guī)模的要求。到現(xiàn)在為止,只有英國(guó)帝國(guó)化學(xué)工業(yè)集團(tuán)(ICI)以甲醇作為碳源,利用親甲醇嗜熱假單胞菌(Methylophilusmethylotrophus)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。在工業(yè)化規(guī)模高密度培養(yǎng)過(guò)程中,傳熱和傳氧會(huì)成為限制性因素。由于甲醇的還原態(tài)低于葡萄糖,單位氧氣的產(chǎn)物得率比葡萄糖低2~3倍,氧化1 g甲醇需要消耗更多的氧氣(0.85 g)。高耗氧也意味著高產(chǎn)熱,對(duì)設(shè)備的冷卻能力要求更高,運(yùn)行成本也相對(duì)增加,特別是在高密度培養(yǎng)的工業(yè)化規(guī)模中,這種缺點(diǎn)會(huì)更加明顯。同時(shí),由于基因操作工具的匱乏,導(dǎo)致甲基營(yíng)養(yǎng)菌只能以生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白為主。
相對(duì)糖基底物與人爭(zhēng)糧的問(wèn)題,甲醇作為工業(yè)產(chǎn)品,不受價(jià)格調(diào)控、不受進(jìn)口限制、來(lái)源廣泛等優(yōu)點(diǎn),使得其作為一種有前景的可替代碳源成為可能。甲醇基生物合成是以甲醇作為碳源,利用甲醇營(yíng)養(yǎng)型微生物代謝合成多種化合物的過(guò)程。而利用扭脫甲基桿菌AM1作為宿主菌來(lái)生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品是一種很有前景的生產(chǎn)方式。隨著對(duì)扭脫甲基桿菌AM1研究的深入,各種基因操作方法建立起來(lái),AM1已經(jīng)成為研究甲基營(yíng)養(yǎng)菌的模式菌株。希望隨著各種基因操作方法建立,更多的微生物能夠參與到以甲醇為底物的工業(yè)化生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品中來(lái),促進(jìn)甲醇基生物工業(yè)的快速發(fā)展。
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(責(zé)任編輯 管珺)
Progressinbioprocessingofvalue-addedmethanolproduct
WANG Shanshan1,CUI Lanyu2,XUE Zhenglian1,ZHANG Chong2,XING Xinhui2
(1. College of Biologicol and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China; 2. Key Laboratory of Industrial Biocatalysis of Ministry of Education,Institute of Biochemical Engineering, Department of Chemical Engineering,Tsinghua University,Beijing 100084,China;3. Center for Synthetic & System Biology,Tsinghua University,Beijing 100084,China)
Methanol as an important feedstock for one-carbon industry,can be produced from methane,syngas and carbon dioxide.Because of good availability of raw materials,low risk of contamination during the fermentation process,and compatibility with synthetic media,bio-fermentation with methanol as carbon source can significantly reduce production cost and simplify product down-streamprocessing,henceMethylobacteriumextorquensAM1 has been widely applied in biochemical engineering.For example,fermentation with methanol as carbon source,M.extorquensAM1 has been demonstrated as a successful approach to achieve the industrialization of single-cell protein production.With the development of molecular biology methods,microbial cell factory with methanol as the feedstock is expected to expand its value-added product spectrum.In this article,we reviewed the recent advances in bioprocessing of methanol-based value-added product byM.extorquensAM1 to enlighten the methanol-based bioindustry.
methanol; biochemical industry; high value-added products;MethylobacteriumextorquensAM1
10.3969/j.issn.1672-3678.2017.06.004
2017-09-17
國(guó)家自然科學(xué)基金(21376137)
王山山(1991—),男,安徽滁州人,研究方向:工業(yè)微生物育種;張 翀(聯(lián)系人)副教授,E-mail:chongzhang@mail.thu.edu.cn;薛正蓮(聯(lián)系人)教授,xuezhen0851@sina.com
Q93
A
1672-3678(2017)06-0026-08