林海龍

(國投生物科技投資有限公司，北京 100034)

木質(zhì)纖維素生物煉制的研究進(jìn)展

林海龍

(國投生物科技投資有限公司，北京 100034)

木質(zhì)纖維素是一種廣泛存在的可再生生物質(zhì)資源，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。如何更有效地綜合利用木質(zhì)纖維素是當(dāng)前面臨的世界性難題。本文中，筆者梳理了木質(zhì)纖維素生物化學(xué)法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)以燃料乙醇為代表的生物基產(chǎn)品，特別是轉(zhuǎn)化過程中關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)的研究現(xiàn)狀及難點(diǎn)，深入探討了木質(zhì)素的生物轉(zhuǎn)化利用趨勢，并綜述了合成生物學(xué)在這些領(lǐng)域的研究趨勢和最新成果。本文力圖描繪出木質(zhì)纖維素生物煉制研究全景，為后續(xù)研究提供潛在思路。

木質(zhì)纖維素；生物煉制；燃料乙醇；木質(zhì)素生物降解

木質(zhì)纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，包含了纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大組分。地球上每年通過光合作用產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)高達(dá)1 000億t以上，然而只有少數(shù)部分被人類所利用。美國每年可收集利用的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)高達(dá)13億t，中國也有8億t左右[1]，這些生物質(zhì)的有效利用必將減少化石資源的開采。目前，以化石資源為主要的能源利用形式導(dǎo)致了一系列的社會(huì)問題，如環(huán)境污染、能源危機(jī)等。因此，世界各國都在加大力度開發(fā)木質(zhì)纖維素這一可再生資源，以緩解能源危機(jī)、環(huán)境污染等問題，達(dá)到可持續(xù)發(fā)展的目標(biāo)。

木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化利用可分為熱化學(xué)法和生物化學(xué)法。熱化學(xué)法包括高溫分解(pyrolysis)、高溫液化(liquefaction)和氣化(gasification)等。高溫分解在300～1 000 ℃、無氧條件下進(jìn)行[2]，其產(chǎn)物主要為合成氣(CO、CO2、 CH4和H2等)、生物油(bio-oil)以及生物碳(bio-char)。另外，根據(jù)木質(zhì)纖維素?zé)崃呀夥磻?yīng)的變化，其產(chǎn)物也明顯不同。當(dāng)木質(zhì)纖維素快速高溫分解時(shí)，主要產(chǎn)物為生物油，而慢速高溫分解的主要產(chǎn)物為生物碳。木質(zhì)纖維素的高溫液化是將物料在含有較多水分的條件下，在250～370 ℃將生物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樯镉蚚3]；而氣化則是在900～1 200 ℃條件下，將生物質(zhì)裂解為CO、CO2、H2O、H2和CH4等，同時(shí)有副產(chǎn)物焦油和焦炭等的生成[4]。生物化學(xué)法的一般流程是預(yù)處理破壞植物細(xì)胞壁的緊密結(jié)構(gòu)，酶水解將木質(zhì)纖維素中的纖維素和半纖維素降解為可被微生物發(fā)酵的糖，最后通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)各種生物基產(chǎn)品，如燃料乙醇、丁醇等(圖1)[5-6]。相比而言，生物化學(xué)法反應(yīng)條件溫和，預(yù)處理溫度在60～220 ℃，酶水解溫度50 ℃左右，發(fā)酵溫度20～60 ℃。本文中，筆者主要介紹木質(zhì)纖維素的生物化學(xué)法轉(zhuǎn)化利用生產(chǎn)以燃料乙醇為代表的生物基產(chǎn)品。

圖1 木質(zhì)纖維素生物煉制生產(chǎn)燃料乙醇的工藝流程Fig.1 Schematic diagram of biorefinery for converting lignocellulosic biomass to bio-ethanol

1 燃料乙醇

燃料乙醇可用來部分代替汽油，緩解石油危機(jī)。目前，燃料乙醇主要與汽油以一定比例混合使用(通常乙醇添加比例為10%)，形成新型混合燃料(E10汽油)。燃料乙醇取代甲基叔丁基醚添加到汽油中，減少對地下水和空氣的污染，可提高汽油的辛烷值，增強(qiáng)汽油的抗爆性能。另外，乙醇的氧含量高達(dá)34.7%，因此，乙醇與汽油的混用一定程度上解決了汽油在油缸內(nèi)燃燒供氧不足的問題，從而使汽油燃燒更加充分，減少CO和其他有害氣體的生成，降低對環(huán)境的污染。目前，美國是燃料乙醇的最大生產(chǎn)國(原料主要為玉米)，年產(chǎn)量4 500萬t左右[7]；巴西是第二大燃料乙醇生產(chǎn)國(原料為甘蔗)，年產(chǎn)量2 150萬t左右[7]；中國是第三大燃料乙醇生產(chǎn)國(原料為玉米、木薯和小麥等)，年產(chǎn)量為250萬t左右[7]。

相比已規(guī)?；a(chǎn)的玉米乙醇，木質(zhì)纖維素乙醇目前還處于規(guī)模化生產(chǎn)的起始階段。歐美有幾家公司已經(jīng)建立了較大規(guī)模的木質(zhì)纖維素乙醇生產(chǎn)廠進(jìn)行試運(yùn)行。這些公司包括：在美國堪薩斯建立的以玉米秸稈為原料年產(chǎn)7.5萬t乙醇的Abengoa公司、在意大利Crescentino建立的以草為原料年產(chǎn)4.0萬t乙醇的Beta Renewables公司、在美國愛荷華州建立的以玉米秸稈為原料年產(chǎn)9.0萬t乙醇的DuPont公司、在美國愛荷華州建立的以玉米秸稈為原料年產(chǎn)6.0萬t乙醇的POET/DSM公司、在巴西建立的以甘蔗渣為原料年產(chǎn)3.2萬t乙醇的Raizen公司以及年產(chǎn)6.5萬t乙醇的Granbio公司等[8]。

2 木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖

木質(zhì)纖維素原料來源廣泛、價(jià)格低廉且能被來源于微生物的水解酶類降解。木質(zhì)纖維素的這些特點(diǎn)為微生物發(fā)酵法大規(guī)模產(chǎn)糖提供了可能，進(jìn)而為系統(tǒng)生產(chǎn)種類多樣的生物基產(chǎn)品提供了豐富的原料。這些生物基化學(xué)品包括大宗化學(xué)品(如乙醇)、精細(xì)化學(xué)品(如酶制劑、手性化合物)、食品元素(如維生素、抗氧化劑)以及藥品(如天然產(chǎn)物)等[9]。從生物質(zhì)中獲取發(fā)酵糖，然后糖通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)各種產(chǎn)品的技術(shù)路線也被稱為 “糖平臺(tái)”技術(shù)?！疤瞧脚_(tái)”技術(shù)主要包括預(yù)處理和酶水解生產(chǎn)可發(fā)酵糖的過程。

2.1 預(yù)處理方法

木質(zhì)纖維素的預(yù)處理過程是將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的關(guān)鍵步驟。木質(zhì)纖維素中的半纖維素包裹著纖維素，并與木質(zhì)素交織形成復(fù)雜的木質(zhì)素碳水化合物復(fù)合體(lignin carbohydrates complex)。木質(zhì)纖維素復(fù)雜的結(jié)構(gòu)使得纖維素酶很難與直接纖維素接觸，從而導(dǎo)致纖維素生物降解效率低下。同時(shí)，纖維素的高聚合度和高結(jié)晶度等特點(diǎn)也影響了纖維素的生物降解[6]。因此，預(yù)處理是實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素高效轉(zhuǎn)化利用的至關(guān)重要一步。目前常用的預(yù)處理方法包括：物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法和生物法等[10]。

物理法預(yù)處理主要是通過物理的方式破壞生物質(zhì)的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使纖維素暴露出來，從而提高纖維素的可及性。物理法預(yù)處理包括研磨粉碎、β-射線和微波等。機(jī)械預(yù)擠壓處理方法是物理法中最常用的一種預(yù)處理方法，這種預(yù)處理方法在較高溫度下(>300 ℃)對生物質(zhì)進(jìn)行機(jī)械剪切研磨，能夠有效地破壞生物質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，擾亂纖維素的結(jié)晶區(qū)，從而提高纖維素的酶解效率[11]。這種預(yù)處理方法主要缺點(diǎn)是能耗高，因而在工業(yè)化應(yīng)用過程中的前景有限。

與物理法預(yù)處理不同，化學(xué)法預(yù)處理主要是通過化學(xué)反應(yīng)切斷木質(zhì)素碳水化合物復(fù)合體中的化學(xué)鍵，破壞或去除生物質(zhì)中的半纖維素或者木質(zhì)素，從而提高纖維素的酶促反應(yīng)可及性，以提高酶解效率[12]?；瘜W(xué)法預(yù)處理主要包括稀酸預(yù)處理、堿預(yù)處理、有機(jī)溶劑預(yù)處理和濕式氧化預(yù)處理等，其中，稀酸預(yù)處理主要是將半纖維素在預(yù)處理過程中水解為單糖，從而把半纖維素從纖維素表面剝離，使纖維素暴露出來便于生物降解[13]。這種預(yù)處理方法成本低，操作較為簡單，但預(yù)處理過程中會(huì)導(dǎo)致糖的降解以及抑制物(如酚類、糠醛和呋喃等)的生成。同時(shí)，稀酸對設(shè)備具有腐蝕性，增加了設(shè)備的運(yùn)行及維護(hù)成本[14-16]。堿預(yù)處理的應(yīng)用也較為廣泛，該方法能有效切斷木質(zhì)素與碳水化合物之間的化學(xué)鍵，從而打散木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)。同時(shí)，堿還能溶解、去除部分木質(zhì)素，從而提高木質(zhì)纖維素的酶解轉(zhuǎn)化效率。然而，該方法常常需要大量的水對預(yù)處理后的底物進(jìn)行沖洗除鹽、脫毒，導(dǎo)致下游處理成本大大提高，不利于工業(yè)化應(yīng)用[14]。

由于物理法和化學(xué)法各有優(yōu)點(diǎn)，吸收這兩種方法優(yōu)點(diǎn)的物理化學(xué)法預(yù)處理逐漸受到廣泛關(guān)注[17]。物理化學(xué)法預(yù)處理主要是在高溫高壓的條件下，破壞木質(zhì)纖維素不同組分之間的連接，同時(shí)可去除部分木質(zhì)素或者半纖維素[18-20]。物理化學(xué)法有蒸汽爆破法、氨纖維膨脹法(AFEX)等[17]。其中，蒸汽爆破預(yù)處理方法應(yīng)用較為廣泛，該法主要是利用蒸汽作為介質(zhì)，進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)部，在壓力瞬間釋放的作用下破碎細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。另外，在高溫高壓的作用下，催化劑(H2SO4和SO2)的存在能顯著提高蒸汽爆破的預(yù)處理效果，達(dá)到較好的半纖維素去除率以及糖回收率[18]。和酸催化預(yù)處理類似，蒸汽爆破預(yù)處理過程中也會(huì)產(chǎn)生大量抑制物，這些抑制物對后續(xù)酶解發(fā)酵產(chǎn)生較為強(qiáng)烈的抑制影響。蒸汽爆破預(yù)處理的相關(guān)技術(shù)難題仍有待進(jìn)一步解決[21-22]。AFEX采用的氨氣呈弱堿性，因此具有堿預(yù)處理的一些特征，但由于是弱堿，從而避免了過多副反應(yīng)的發(fā)生，產(chǎn)生的抑制物較少[23]。另外，氨的揮發(fā)性使得氨氣回收利用較為方便，殘留在木質(zhì)纖維素中的氨還能作為后續(xù)微生物發(fā)酵的氮源[24]。

生物法預(yù)處理對木質(zhì)纖維素也具有較好的預(yù)處理效果。該預(yù)處理方法主要利用白腐菌、軟腐菌等微生物選擇性地對木質(zhì)纖維素中的木質(zhì)素進(jìn)行降解。然而，由于生物降解反應(yīng)速率過慢，該預(yù)處理方法所需時(shí)間較長(長達(dá)數(shù)周)，因此較難在工業(yè)化生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用[10,25]。目前，稀酸預(yù)處理、蒸汽爆破預(yù)處理和AFEX預(yù)處理都已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了中試規(guī)模以上的放大測試。

此外，近年來還出現(xiàn)了一些較為新穎的預(yù)處理方式，如co-solvent enhanced lignocellulosic fractionation(CELF)預(yù)處理[26-27]、sulfite pretreatment to overcome recalcitrance of lignocellulose(SPORL)預(yù)處理[28-30]、對甲苯磺酸預(yù)處理技術(shù)以及flowthrough預(yù)處理[31]等。美國加州大學(xué)河濱分校的Wyman教授課題組開發(fā)的CELF預(yù)處理技術(shù)主要利用低沸點(diǎn)的四氫呋喃作為溶劑，分離木質(zhì)纖維素的3種組分(纖維素、半纖維素和木質(zhì)素)，所得預(yù)處理底物纖維素含量高，更容易被纖維素酶催化水解、大大降低了酶用量[32]。美國農(nóng)業(yè)部Zhu課題組開發(fā)的SPORL預(yù)處理結(jié)合了稀酸預(yù)處理和磺化預(yù)處理的特點(diǎn)，以亞硫酸鹽為反應(yīng)劑，在酸性條件(pH 2～4)及較高溫度(160～180 ℃)下進(jìn)行預(yù)處理[28-30]，該預(yù)處理方式適用于處理結(jié)構(gòu)較為致密的軟木以及硬木，且可利用傳統(tǒng)制漿造紙產(chǎn)業(yè)的設(shè)備作為反應(yīng)器。最近，該課題組還利用對甲苯磺酸(pTsOH)作為水溶性助溶劑，有效分離了纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，大大提高了所得纖維素的可及性，提高了纖維素酶催化水解效率。該預(yù)處理技術(shù)所采用的pTsOH可重復(fù)利用，預(yù)處理溫度較低(<80 ℃)，時(shí)間較短(<60 min)，并且無需添加任何其他催化劑，因而具有較好的應(yīng)用前景[33-34]。

2.2 酶水解

木質(zhì)纖維素酶水解的主要目標(biāo)是將其中的纖維素和半纖維素水解為可發(fā)酵單糖。纖維素是由葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接起來的聚合物。半纖維素則是由幾種不同類型的單糖構(gòu)成的多聚體，這些單糖主要為木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖等，其中最多的是木糖。水解纖維素的酶主要包含3種核心酶：纖維二糖水解酶(CBH)、內(nèi)切葡聚糖酶(EG)和β-葡萄糖苷酶(βG)[35-36]。內(nèi)切葡聚糖酶在低結(jié)晶區(qū)纖維素鏈的中間隨機(jī)地進(jìn)行切割，產(chǎn)生還原末端和非還原末端的纖維素鏈。纖維二糖水解酶CBH I 和 CBH II通過其自身的吸附結(jié)構(gòu)域吸附在纖維素鏈上，分別從還原末端和非還原末端對纖維素鏈進(jìn)行水解，產(chǎn)生纖維二糖。β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖，產(chǎn)生葡萄糖。半纖維素的水解主要依靠內(nèi)切木聚糖酶、外切木聚糖酶、木糖苷酶和內(nèi)切甘露聚糖酶等[35]。不同的纖維素酶和半纖維素酶通過相互協(xié)同作用提高木質(zhì)纖維素的降解轉(zhuǎn)化效率。Gao等[37]研究了水解AFEX預(yù)處理玉米秸稈的最優(yōu)酶配比，發(fā)現(xiàn)CBHI+CBHII+EG的含量在最優(yōu)的酶配比中占了77.4%，說明纖維二糖水解酶和內(nèi)切葡聚糖酶在水解木質(zhì)纖維素中至關(guān)重要的作用。

影響木質(zhì)纖維素酶水解效率的因素很多，包括底物的孔隙率、酶所能接觸到的底物面積、纖維素的結(jié)晶度和聚合度、木質(zhì)素的含量以及酶的活力等[6]。其中，木質(zhì)素主要通過疏水作用和靜電作用與纖維素酶進(jìn)行無效吸附，從而阻礙酶與底物的高效接觸、降低酶的水解效率[38]。另外，預(yù)處理產(chǎn)生的抑制物，特別是木質(zhì)素衍生出的酚類物質(zhì)，對酶活有較大的抑制[39]。酶水解的產(chǎn)物(單糖和寡糖)對木質(zhì)纖維素的酶水解也具有強(qiáng)烈的抑制作用[16]。這些因素都或多或少地限制了木質(zhì)纖維素酶水解的效率。

2.3 木質(zhì)纖維素制糖的瓶頸

2.3.1 高底物濃度酶水解的低糖轉(zhuǎn)化率

高底物濃度酶水解是實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素生物煉制工業(yè)化的必要條件。然而，纖維素和半纖維素的轉(zhuǎn)化率(糖轉(zhuǎn)化率)隨著酶水解底物濃度的提高而直線下降，導(dǎo)致高底物濃度下糖轉(zhuǎn)化率偏低[40]。造成這種現(xiàn)象的可能原因包括：1)水含量下降。木質(zhì)纖維素底物濃度提高造成了反應(yīng)體系中水含量的下降。水是纖維素和半纖維素酶水解的底物之一，同時(shí)也是酶的溶劑，在酶水解過程中非常重要。水含量的下降、物料黏度的提高在一定程度上影響了酶水解的效果。2)木質(zhì)素含量的提高。木質(zhì)纖維素底物濃度的提高導(dǎo)致了木質(zhì)素含量的提高，而木質(zhì)素是影響酶水解的一大負(fù)面因素。3)抑制物濃度的提高。木質(zhì)纖維素預(yù)處理產(chǎn)生的抑制物隨著木質(zhì)纖維素底物進(jìn)入酶水解，木質(zhì)纖維素濃度的提高必然引起抑制物濃度的提高。即使是產(chǎn)生抑制物較少的AFEX預(yù)處理方法，酶的水解效率也會(huì)明顯受到預(yù)處理抑制物的影響[41]。4)傳質(zhì)問題。高底物濃度酶水解往往伴隨一段時(shí)間的物料高黏度特性，從而引起傳質(zhì)問題[42]。5)產(chǎn)物的反饋抑制。高底物濃度酶解產(chǎn)生高產(chǎn)物濃度(高糖濃度)，從而造成對酶反應(yīng)的強(qiáng)烈反饋抑制。Kristensen等[40]研究了限制高底物濃度酶水解糖轉(zhuǎn)化率的因素，發(fā)現(xiàn)隨著底物濃度的提高，酶在底物上的吸附減少是造成糖轉(zhuǎn)化率下降的重要原因。Jin 等[43]通過同步糖化共發(fā)酵法(SSCF)將酶水解與微生物發(fā)酵在同一個(gè)反應(yīng)器中同時(shí)進(jìn)行，SSCF過程雖然降低了酶水解產(chǎn)物糖對酶反應(yīng)的抑制作用，但仍然呈現(xiàn)糖轉(zhuǎn)化率隨底物濃度的提高而下降的現(xiàn)象。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，除存在預(yù)處理抑制物的抑制效應(yīng)外，發(fā)酵產(chǎn)物乙醇的不斷積累也是造成糖轉(zhuǎn)化率顯著下降的重要因素。因此，及時(shí)將抑制物和產(chǎn)物乙醇移除后，在高底物濃度下也獲得了較高的糖轉(zhuǎn)化率。

2.3.2 高纖維素酶用量

高纖維素酶用量導(dǎo)致酶使用成本居高不下是制約木質(zhì)纖維素生物煉制產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的另一需要解決的關(guān)鍵問題。據(jù)估算，木質(zhì)纖維素乙醇的生產(chǎn)成本中，酶的成本占15.7%[44]。為此，人們在改進(jìn)預(yù)處理方法[45]、酶配方[37]以及酶回收利用[46]等方面做了大量工作。最近，Sousa等[45]在AFEX預(yù)處理基礎(chǔ)上發(fā)明了萃取氨(EA)預(yù)處理技術(shù)。該技術(shù)移除了大約45%的木質(zhì)素，并將纖維素I型轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維素III型，從而大大提高了酶解效率、降低了60%的酶用量。諾維信公司在其第三代纖維素酶Cellic Ctec 3中添加了多糖單加氧酶(GH61)，大大提高了木質(zhì)纖維素的降解效率。Jin等[46-47]利用纖維素酶在酶水解殘留固體上的吸附特性，高效快速回收纖維素酶并將酶用量減少40%。近年來，合成生物學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，也為新纖維素酶的挖掘、新纖維素降解體系的構(gòu)建、分子酶機(jī)器的構(gòu)建提供了技術(shù)支撐。

2.3.2.1 新纖維素酶的挖掘和纖維素降解體系的重構(gòu)

自然界一些特殊環(huán)境，比如動(dòng)物瘤胃、昆蟲腸道以及人跡罕至的原始森林、沼澤地區(qū)等，這些環(huán)境中的微生物能快速降解木質(zhì)纖維素。這些環(huán)境及微生物的多樣性為新纖維素酶的挖掘提供了豐富的酶源[48-49]。由于特定環(huán)境下的微生物在長期進(jìn)化中形成了高度的生存依賴關(guān)系[50]，因此，群落中主要產(chǎn)纖維素酶菌株的純培養(yǎng)相對較為困難。近年來，宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組及宏蛋白組技術(shù)的快速發(fā)展可以直接讀取原始環(huán)境中微生物群落的基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組信息，為鑒定纖維素酶基因、研究酶表達(dá)水平、調(diào)取新纖維素酶基因、表達(dá)純化異源蛋白、研究降解機(jī)理奠定基礎(chǔ)[48,51]。例如，美國能源部等多家研究機(jī)構(gòu)直接從白蟻腸道中提取總DNA和總RNA，建立了宏基因庫，通過測序發(fā)現(xiàn)其中存在著多達(dá)數(shù)百種的纖維素、半纖維素水解相關(guān)的基因[52-53]。因此，組學(xué)工具的大規(guī)模應(yīng)用顯著增強(qiáng)了人們對纖維素酶的篩選和應(yīng)用。另外，系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)的基因組、代謝組、流量組以及計(jì)算模擬技術(shù)也為微生物群落研究提供了豐富的工具[50]。

目前，從自然界中篩選高效降解纖維素的微生物群落，鑒定其群落結(jié)構(gòu)，研究混菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)，解析其高效降解轉(zhuǎn)化的機(jī)理，進(jìn)而模擬構(gòu)建類似系統(tǒng)或者通過改造進(jìn)一步強(qiáng)化其功能等[54-56]，為建立新的纖維素降解體系提供了新思路。

2.3.2.2 分子酶機(jī)器的構(gòu)建

自然界中的生物質(zhì)降解過程是多種木質(zhì)纖維素酶系協(xié)同作用完成的[57]。不同種類的酶、不同的酶組分之間在降解木質(zhì)纖維素過程中具有協(xié)同作用，即復(fù)合酶組分的降解效率會(huì)明顯高于單個(gè)酶解效率的總和。因此，控制酶系中酶的組成、比例和活力，增強(qiáng)協(xié)同作用，是提高酶解效率的有效手段[57-58]。纖維小體(cellulosome)是一種能高效降解結(jié)晶纖維素和非結(jié)晶纖維素的天然多酶復(fù)合體，活力是里氏木霉纖維素酶活力的50倍[58]。目前在多種細(xì)菌和真菌中均發(fā)現(xiàn)了纖維小體。纖維小體的主體結(jié)構(gòu)是支架蛋白(scaffoldin)，纖維素酶通過錨定域特異性地與支架蛋白上的黏附域結(jié)合。隨著測序及蛋白解析技術(shù)的發(fā)展，基因組測序和腳手架蛋白、纖維小體組分序列信息的披露使得人工設(shè)計(jì)纖維小體成為可能[57,59]。目前已經(jīng)有多種設(shè)計(jì)型的纖維小體實(shí)現(xiàn)了體外構(gòu)建。纖維小體各種配比的纖維素酶組分也可以被有效組裝到骨架蛋白上。構(gòu)建的設(shè)計(jì)型纖維小體的總纖維素酶活優(yōu)于單組分纖維素酶[59-62]。目前，設(shè)計(jì)型纖維小體的體內(nèi)組裝研究進(jìn)展相對緩慢，嵌合型纖維小體還無法高效地異源表達(dá)。隨著合成生物學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)在微生物蛋白分泌表達(dá)研究上的深入，這一問題最終將會(huì)獲得突破[58,63]。

3 木質(zhì)纖維素發(fā)酵

3.1 酶解發(fā)酵工藝

木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為燃料乙醇或其他生物基產(chǎn)品主要步驟有：預(yù)處理、酶水解、發(fā)酵以及纖維素酶和半纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)(圖1)。將酶解發(fā)酵各個(gè)步驟分開在獨(dú)立的反應(yīng)器中進(jìn)行，為分步酶解發(fā)酵工藝(SHF)；將酶水解和發(fā)酵整合在同一個(gè)反應(yīng)器進(jìn)行，為同步酶解發(fā)酵工藝或同步糖化發(fā)酵工藝(SSF)；葡萄糖和木糖共發(fā)酵情況則被稱為同步糖化共發(fā)酵(SSCF)。發(fā)酵產(chǎn)酶、酶解和發(fā)酵3個(gè)涉及生物反應(yīng)的步驟全整合在一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行，為統(tǒng)合生物加工(CBP)(圖2)[64]。SSF和SSCF將酶解產(chǎn)物糖及時(shí)消耗移除，降低了糖對酶的反饋抑制，同時(shí)也減少了染菌機(jī)會(huì)。由于微生物菌株的生長溫度與酶解的最佳溫度(50 ℃)不同，導(dǎo)致SSF/SSCF一般在30～35 ℃下進(jìn)行，酶解效率受限[65]。CBP的研究主要集中在酵母體系和梭菌體系。在酵母中表達(dá)纖維素酶，或者改造梭菌(如Clostridiumthermocellum)使其既能高效降解木質(zhì)纖維素，同時(shí)還能高效生產(chǎn)乙醇[66]。由于CBP消除了外加酶的需求，同時(shí)結(jié)合了SSCF的優(yōu)勢，其成本大大降低，被譽(yù)為生產(chǎn)木質(zhì)纖維素乙醇的終極技術(shù)。但由于CBP體系過于復(fù)雜，目前還沒有菌株能達(dá)到CBP工業(yè)化的要求。

圖2 不同酶解發(fā)酵工藝的對比Fig.2 Comparison of different processes for enzymatic hydrolysis and fermentation

3.2 木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵存在的問題

木質(zhì)纖維素在酶水解后產(chǎn)生了主要含有葡萄糖和木糖的水解液。水解液通過微生物發(fā)酵可生產(chǎn)乙醇。由于傳統(tǒng)的釀酒酵母不能利用木糖，因此，科學(xué)家們通過基因工程改造將木糖代謝途徑導(dǎo)入酵母中，使得釀酒酵母具有發(fā)酵木糖的能力。目前所知的木糖代謝途徑主要有木糖還原酶-木糖醇脫氫酶途徑和木糖異構(gòu)酶途徑。將這兩個(gè)途徑導(dǎo)入釀酒酵母而獲得成功的代表菌種有美國普度大學(xué)的Saccharomycescerevisiae424A(LNH-ST) (導(dǎo)入了木糖還原酶-木糖醇脫氫酶途徑)[67]和荷蘭代爾夫特理工大學(xué)的SaccharomycescerevisiaeRWB 218(導(dǎo)入了木糖異構(gòu)酶途徑)[68]。但即使擁有木糖代謝能力的釀酒酵母也通常先利用葡萄糖，葡萄糖利用完后再利用木糖，即糖代謝物阻遏效應(yīng)(carbon catabolite repression)。釀酒酵母沒有專門的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，木糖轉(zhuǎn)運(yùn)入釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)需要依靠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體系。而葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對葡萄糖的親和力要大于對木糖的親和力，從而導(dǎo)致有葡萄糖存在的情況下木糖極少被轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)[69]。這也是木糖晚于葡萄糖利用的一個(gè)原因。

木質(zhì)纖維素高濃度水解液中的高濃度抑制物對后期酵母發(fā)酵極為不利，特別是對木糖發(fā)酵的抑制更為明顯[70]?；蚬こ谈脑旌蟮慕湍冈谝掖紖捬醢l(fā)酵條件下，由于還原力或能量供應(yīng)的不平衡，不能在木糖上生長[71-72]。在利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵過程中，酵母先發(fā)酵利用葡萄糖，待葡萄糖消耗完之后才能利用木糖。因此，發(fā)酵木糖時(shí)不僅受預(yù)處理抑制物的抑制，同時(shí)還受發(fā)酵前期積累乙醇的影響，使木糖發(fā)酵速率大大下降[70]。另外，由于木糖發(fā)酵時(shí)酵母停止生長，細(xì)胞活力下降，菌體死亡，木糖利用速率會(huì)隨之降低，從而導(dǎo)致整體發(fā)酵速率下降。為解決葡萄糖先于木糖發(fā)酵帶來的問題，Jin 等[73]發(fā)明了兩步法SSCF工藝：在SSCF中，先加入半纖維素酶將半纖維素水解釋放出木糖，進(jìn)而進(jìn)行木糖發(fā)酵，隨后再加入纖維素酶，水解纖維素釋放出葡萄糖并進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵。SSCF工藝技術(shù)使得木糖先于葡萄糖發(fā)酵，避免了葡萄糖發(fā)酵造成的產(chǎn)物抑制。SSCF工藝同時(shí)利用發(fā)酵開始時(shí)的營養(yǎng)豐富和微氧環(huán)境，大大提升了木糖的發(fā)酵效率。

近年來，隨著基因工程菌的不斷改進(jìn)以及預(yù)處理和發(fā)酵策略的優(yōu)化，木糖的利用率及乙醇產(chǎn)率有了很大的提高。Demeke等[74]構(gòu)建的釀酒酵母GS1.11-26在小麥秸稈和干草的水解液中發(fā)酵，乙醇的最終產(chǎn)率達(dá)到0.48 g/g(以混合糖計(jì))，是最大理論產(chǎn)率的94%。Zhu等[75]使用重組酵母SyBE005對于稀酸預(yù)處理的玉米秸稈(不去除抑制劑)進(jìn)行SSCF，最終乙醇質(zhì)量濃度達(dá)47.2 g/L，產(chǎn)率65.5%。Fujii等[76]利用重組釀酒酵母MA-R4對桉樹水解液進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵72 h得到乙醇53.5 g/L，產(chǎn)率82.8%。Qureshi等[77]利用重組釀酒酵母DQ1對干酸法預(yù)處理并生物脫毒后的玉米秸稈進(jìn)行SSCF，最終乙醇質(zhì)量濃度達(dá)71.4 g/L，產(chǎn)率80.3%。Zhu等[78]對玉米秸稈進(jìn)行氨水預(yù)處理，用重組酵母SyBE005進(jìn)行SSCF，分批補(bǔ)料發(fā)酵，最終乙醇質(zhì)量濃度為68.8 g/L，產(chǎn)率79.8%，木糖利用率89%。為了提高木糖利用率，提高木糖轉(zhuǎn)運(yùn)效率是有效手段之一。Gon?alves等[79]研究了己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因過表達(dá)的重組酵母菌株對木糖攝取的影響，獲得的重組酵母菌株DLG-K1T7在完全合成培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h，木糖利用率為85%，乙醇的最終產(chǎn)率為0.38 g/g。此外，利用兩種不同功能的菌株共培養(yǎng)也顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢。Zhang等[80]利用可降解纖維素的重組釀酒酵母BY4743和可降解木聚糖的重組巴斯德畢赤酵母GS115共培養(yǎng)，進(jìn)行葡萄糖/木糖共發(fā)酵，在不添加水解酶情況下，發(fā)酵預(yù)處理小麥秸稈80 h后乙醇質(zhì)量濃度達(dá)32.6 g/L，達(dá)到理論產(chǎn)率的82.6%。Zhu等[81]通過木糖利用釀酒酵母CGMCC NO.6634和抑制物耐受酵母CGMCC No.2757共培養(yǎng)發(fā)酵玉米秸稈干酸預(yù)處理后的水解物(不除去抑制物)，通過SSCF發(fā)酵120 h，最終乙醇質(zhì)量濃度達(dá)70.2 g/L，產(chǎn)率89.0%。

3.3 合成生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)促進(jìn)木質(zhì)纖維素乙醇的發(fā)展

預(yù)處理過程中產(chǎn)生的抑制物(如糠醛、羥甲基糠醛和乙酸等)和高濃度的產(chǎn)物如乙醇等對微生物的發(fā)酵產(chǎn)生了負(fù)面影響[82]，從而使以木糖為代表的戊糖發(fā)酵受到抑制。因此，實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素的高效煉制需要使微生物既能同步高效發(fā)酵己糖和戊糖，又能提升對水解抑制物和發(fā)酵產(chǎn)物的耐受能力。

由于微生物在糖利用和抗逆性方面涉及基因、蛋白、調(diào)控因子和應(yīng)激行為等多個(gè)層面，很難通過簡單的基因工程或代謝工程改造實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵性能的完美提升[83]?；诖x工程的適應(yīng)性進(jìn)化工程可使微生物迅速獲得優(yōu)異表型，但是存在基因靶點(diǎn)不清楚、負(fù)突變干擾等問題[84-85]。多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為進(jìn)化工程打開了全新視角，也為反向代謝工程提供了可靠的靶點(diǎn)[82]。另外，系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)提升了人們對于微生物生理、代謝過程的綜合認(rèn)識(shí)，了解了代謝途徑之間相互作用及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。利用復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)的精確計(jì)算機(jī)模擬，可以通過改變最少的基因，來獲得最優(yōu)化生長或者在特定條件下生產(chǎn)某一產(chǎn)品的能力[86]。系統(tǒng)地整合微生物組學(xué)數(shù)據(jù)、基因表達(dá)譜、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)的全新策略，使研究者對細(xì)胞代謝的研究更加深入，從而可對菌株進(jìn)行理性設(shè)計(jì)。合成生物學(xué)提供的新工具可以將廣泛的遺傳多樣性引入到同一個(gè)微生物宿主中，再結(jié)合選育、高通量篩選技術(shù)、適應(yīng)性進(jìn)化，從而完成一系列遺傳改造，實(shí)現(xiàn)優(yōu)化生物過程工程的目標(biāo)[87-88]。因此，合成生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)為構(gòu)建利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵高效菌株提供了系統(tǒng)性的技術(shù)支撐。

4 木質(zhì)素的生物降解轉(zhuǎn)化

木質(zhì)纖維素生物煉制過程中的纖維素和半纖維素降解轉(zhuǎn)化后，殘留的木質(zhì)素常進(jìn)行燃燒產(chǎn)熱發(fā)電。近幾年來，木質(zhì)素的生物轉(zhuǎn)化利用也引起了領(lǐng)域內(nèi)的普遍關(guān)注。木質(zhì)素是一種復(fù)雜的酚類聚合物，其在自然界中的降解是一個(gè)緩慢的過程，基本都是由氧氣參與的氧化反應(yīng)[89-91]。木質(zhì)素的降解過程中，一些好氧真菌和好氧細(xì)菌起著至關(guān)重要的作用[50]?？梢越到饽举|(zhì)素的真菌屬于擔(dān)子菌(如白腐真菌的Phanerochaetechrysosporium和褐腐真菌的Postiaplacenta,Gloeophyllumtrabeum)、子囊菌以及半知菌(如軟腐真菌的Daldiniaconcentric)[89-90,50,92]。

白腐真菌可以分泌多種胞外木質(zhì)素酶(如木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶) 深度降解木質(zhì)素，白腐真菌相比褐腐真菌和軟腐真菌具有較強(qiáng)的降解木質(zhì)素能力，部分白腐真菌(如Trametesversicolor) 無選擇性地降解木質(zhì)纖維素中的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素，有些白腐真菌先選擇性地降解利用木質(zhì)素，然后再降解利用纖維素和半纖維素，還有一部分白腐真菌 (如Phellinusnigrolimitatus) 只降解利用木質(zhì)素[89,93]。在木質(zhì)素被白腐真菌降解的過程中，木質(zhì)素單體的丙酸側(cè)鏈和芳香環(huán)被氧化切斷，芳香環(huán)上的甲基也被脫去[92]。褐腐真菌主要降解木質(zhì)纖維素中的纖維素和半纖維素，對木質(zhì)素的修飾只局限于去甲基化、部分氧化及降低木質(zhì)素的聚合度。褐腐真菌對木質(zhì)素的這些修飾主要通過鐵和氧化還原中介物進(jìn)行芬頓反應(yīng)[94]。一些軟腐真菌，如Daldiniaconcentrica，可以深度降解木質(zhì)素，但降解效率低于白腐真菌[89-90]。另外，白腐真菌不能降解愈創(chuàng)木基木質(zhì)素[89]。

細(xì)菌中，屬于放線菌的鏈霉菌屬具有部分降解木質(zhì)素的能力[89]，這些細(xì)菌能分泌木質(zhì)素降解酶，如胞外過氧化物酶、過氧化氫酶和苯酚氧化酶[89,95-96]，將木質(zhì)素降解為水溶性的可被酸沉淀的木質(zhì)素片段[97]，其中有Cɑ—Cβ鍵的切斷、去甲基化和Cα的氧化[89]。其他細(xì)菌的木質(zhì)素降解能力比鏈霉菌弱，只能通過胞內(nèi)酶降解低分子量的木質(zhì)素，其中以假單胞菌(Pseudomonas)降解能力最強(qiáng)[89,98]。另外，紅球菌屬(Rhodococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、鞘脂菌屬(Sphingobium)、芽孢桿菌屬(Bacillum)、無色菌屬(Achromobacter)、貪銅菌屬(Cupriavidus)和平革菌屬(Phanerochaete)也被發(fā)現(xiàn)具有降解芳香族化合物的能力[50]。

木質(zhì)素降解酶(通常為胞外酶)主要包括木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶以及漆酶[90,99]。木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶是亞鐵血紅素過氧化物酶，具有高的氧化還原電勢，而漆酶是含銅的氧化酶，氧化還原電勢較低[99]。木質(zhì)素過氧化物酶的底物特異性差，能與不同種類的木質(zhì)素化合物反應(yīng)。錳過氧化物酶主要氧化酚類底物，而不能與非酚類的木質(zhì)素化合物反應(yīng)。在沒有脂肪酸存在的情況下，錳過氧化物酶也能氧化非酚類木質(zhì)素化合物[100]。漆酶在沒有中介物的情況下只氧化酚類化合物。在中介物 (如2,2’-azinobis (3-e t h y l b e n z t h i a z o l i n e-5-sulphonate) 和1-hydroxybenzotriazole) 存在時(shí)，漆酶也能氧化難降解的非酚類化合物[89,101]。白腐真菌的次級代謝產(chǎn)物藜蘆基醇能加強(qiáng)木質(zhì)素過氧化物酶的反應(yīng)[102]。木質(zhì)素過氧化物酶作用于木質(zhì)素時(shí)，產(chǎn)生正離子自由基，從而引發(fā)各種各樣的反應(yīng)，例如Cɑ—Cβ鍵的切斷和開環(huán)反應(yīng)。錳過氧化物酶和漆酶作用于木質(zhì)素時(shí)產(chǎn)生含苯氧基的自由基，引起諸如Cɑ—Cβ鍵的切斷、去甲基化、烷基-苯基斷裂和Cɑ氧化等反應(yīng)[103]。白腐真菌能分泌木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶以及漆酶[90]。但木質(zhì)素高效降解菌P.chrysosporium卻不能分泌漆酶[91]。

木質(zhì)素降解菌或木質(zhì)素降解酶可用于生物法去除原料中的木質(zhì)素[104-105]。另外，木質(zhì)素降解微生物還可用于轉(zhuǎn)化木質(zhì)素生產(chǎn)燃料和化學(xué)品[50,98,106-107]。比如,Sainsbury 等[106]改造了RhodococcusjostiiRHA1，使其能從木質(zhì)素中制取香草醛。Lin 等[108]系統(tǒng)改造了Pseudomonasputida，使其能高效降解木質(zhì)素生產(chǎn)生物塑料PHA。

5 展望

燃料乙醇是木質(zhì)纖維素生物煉制最容易產(chǎn)業(yè)化的大宗產(chǎn)品之一。雖然目前的低油價(jià)對木質(zhì)纖維素燃料乙醇的發(fā)展造成了一定的沖擊，美國能源部在不久前依然宣布繼續(xù)資助2007年成立的四大生物能源研究中心。2017年9月，國家發(fā)改委、國家能源局、財(cái)政部等十五部門聯(lián)合印發(fā)了《關(guān)于擴(kuò)大生物燃料乙醇生產(chǎn)和推廣使用車用乙醇汽油的實(shí)施方案》，該方案為推進(jìn)纖維素乙醇在2025年實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)提供了政策支撐。這些均顯示了世界主要經(jīng)濟(jì)體對木質(zhì)纖維素生物煉制的信心。我國目前年產(chǎn)7～9億t農(nóng)作物秸稈，其中有一半以上不能被綜合利用，甚至被直接焚燒在農(nóng)田里，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。因此，木質(zhì)纖維素的生物煉制對于提高生物質(zhì)的綜合利用，以及保護(hù)環(huán)境、保障能源安全和人類社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展等具有重要意義。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Researchprogressinbiorefineryoflignocellulosicbiomass

LIN Hailong

(SDIC Biotechnology Investment Co. Ltd.,Beijing 100034,China)

Lignocellulose is an abundant and renewable biomass that is mainly composed of cellulose,hemicellulose and lignin.The utilization of lignocellulosic biomass has attracted worldwide attention.This article reviews the biochemical route of lignocellulosic biomass refinery for bioproducts production (using bio-ethanol as an example) and the remaining challenges.This article also discussed the bioconversion of lignin,which is economically critical for a biorefinery.The application of synthetic biology technologies in biorefinery field is also reviewed aiming to give insights into aspects of biorefinery research and provide suggestions for future research.

lignocellulosic biomass; fuel ethanol; biorefinery; lignin biodegradation

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.06.007

2017-08-23

林海龍(1976—)，男，福建福州人，博士，高級工程師，研究方向：燃料乙醇，E-mail：linhailong@sdic.com.cn

TQ9；X71

A

1672-3678(2017)06-0044-11