楊 靖，陳文靜，張 敏，袁肖杰，楊益明，朱麗萍,3，楊 松,3

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東省應(yīng)用真菌重點實驗室，山東 青島 266109；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 青島生物沼氣環(huán)境微生物國際合作基地，山東 青島 266109)

甲基營養(yǎng)菌代謝網(wǎng)絡(luò)途徑和代謝工程改造的研究進(jìn)展

楊 靖1,2，陳文靜1,2，張 敏1,2，袁肖杰1,2，楊益明1,2，朱麗萍1,2,3，楊 松1,2,3

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東省應(yīng)用真菌重點實驗室，山東 青島 266109；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 青島生物沼氣環(huán)境微生物國際合作基地，山東 青島 266109)

一碳化合物(甲醇或甲烷)高值化轉(zhuǎn)化是當(dāng)前生物工程領(lǐng)域的重要研究熱點。甲基營養(yǎng)菌是一類以甲醇為碳源和能源生長的革蘭氏陰性菌，隨著基因組測序的開展和各類組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以扭脫甲基桿菌為代表的甲基營養(yǎng)菌的中心代謝網(wǎng)絡(luò)途徑和相關(guān)功能基因逐漸明晰。近年來，甲基營養(yǎng)菌中包括基因過表達(dá)、基因敲除整合等遺傳操作工具的完善以及各種基因調(diào)控元件的開發(fā)，為甲基營養(yǎng)菌的底盤改造和異源途徑優(yōu)化表達(dá)提供了重要基礎(chǔ)，國內(nèi)外的研究推動了甲醇轉(zhuǎn)化成多種高附加值產(chǎn)品。此外，人們渴望利用傳統(tǒng)基因工程菌作為底盤構(gòu)建合成型甲基菌，以期更高效實現(xiàn)甲醇催化轉(zhuǎn)化。本文中，筆者綜述了目前甲基營養(yǎng)菌，尤其是扭脫甲基桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)特點、代謝工程改造策略與應(yīng)用以及構(gòu)建合成型甲基細(xì)菌這3個方面的研究進(jìn)展，以期為甲基微生物催化轉(zhuǎn)化的研究提供借鑒。

甲基營養(yǎng)菌；代謝工程；代謝網(wǎng)絡(luò)途徑；合成型甲基細(xì)菌；甲醇

甲基營養(yǎng)菌(methylotrophs)是能利用甲醇或甲烷等一碳化合物作為唯一碳源和能源的革蘭氏陰性菌。甲基營養(yǎng)菌可以從植物葉片及根際、土壤、湖泊與海底沉積物等各種生境中分離得到。目前，已通過實驗室培養(yǎng)條件分離到的不同種屬甲基營養(yǎng)菌包括扭脫甲基桿菌(Methylobacteriumextorquens)、莢膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)、甲醇芽孢桿菌(Bacillusmethanolicus)、耐輻射甲基桿菌(M.radiotolerans)和氯甲基桿菌(M.chloromethanicum)等[1]。其中，扭脫甲基桿菌M.extorquensAM1在1960年從甲胺的空氣污染物中分離得到，是目前研究最多的甲基模式菌[2]。2009年，扭脫甲基桿菌全基因組測序詮釋，其基因組全長6.88 Mb，包含1個5.51 Mb染色體，1個1.26 Mb大質(zhì)粒和3個小質(zhì)粒[3-4]，繼而包括基因過表達(dá)、基因敲除和基因整合等操作工具及多層次組學(xué)方法的相繼開發(fā)[5]，為在扭脫甲基桿菌中挖掘新基因和開展代謝工程改造奠定重要前期基礎(chǔ)。

目前，生物燃料、精細(xì)化學(xué)品和藥物分子等(如：烴類燃料、大宗有機(jī)酸和烯萜類衍生物)的微生物合成主要利用玉米淀粉等來源的葡萄糖作為碳源和能源，但是大規(guī)模化生產(chǎn)存在與人畜爭糧爭地的原料瓶頸問題[6]。近年來，隨著代謝工程與合成生物技術(shù)發(fā)展，非傳統(tǒng)碳源(如：甲醇、甲烷、CO2和CO)受到極大關(guān)注[6-8]。與葡萄糖相比，甲醇不但含有更多電子，為高還原度化學(xué)品合成提供更多還原力，而且可從沼氣或合成氣等多種可再生資源中獲得，市場價格低廉，便于運輸，供應(yīng)不受季節(jié)和氣候影響[6,9]，因而甲基微生物合成路線具有明顯發(fā)展優(yōu)勢，甲醇相對于傳統(tǒng)碳源可以成為微生物合成路線的一種重要的非食品替代基質(zhì)。2013年，美國能源部和歐盟分別啟動ARPA-E(advanced research projects agency for energy)和PROMYSE(products from methanol by synthetic cell factories)創(chuàng)新專項，資助4 000多萬美元，旨在推動甲醇/甲烷生物高值轉(zhuǎn)化的研究[10-11]。

本文中，筆者主要綜述了目前甲基營養(yǎng)菌，尤其是其模式菌扭脫甲基桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)特點、代謝工程改造與應(yīng)用以及構(gòu)建合成型甲基細(xì)菌這3個方面的研究內(nèi)容與進(jìn)展，以期為甲基微生物催化轉(zhuǎn)化的研究提供借鑒。

1 甲基營養(yǎng)菌的中心代謝網(wǎng)絡(luò)

甲基營養(yǎng)菌(扭脫甲基桿菌)中心代謝網(wǎng)絡(luò)如圖1所示。由圖1可知，它主要包括3個模塊，一碳化合物(甲醇、甲胺等)氧化模塊、一碳中間代謝物異化模塊和一碳中間代謝物的同化模塊。一碳化合物的氧化是利用甲醇脫氫酶氧化一碳底物，轉(zhuǎn)化為甲醛。一碳化合物的異化過程是經(jīng)過多步一碳傳遞，并最終將甲酸氧化為CO2，同時產(chǎn)生還原力。甲基營養(yǎng)菌根據(jù)同化模塊的特點又分為α-變形菌類和γ-變形菌類，其中α-變形菌類甲基營養(yǎng)菌，以扭脫甲基桿菌作為代表，通過絲氨酸循環(huán)(serine cycle)耦合乙酰丙二酰輔酶A途徑(ethylmalonyl-CoA pathway，EMCP )同化甲酸；而γ-變形菌類甲基營養(yǎng)菌以甲醇芽孢桿菌(Bacillusmethanolicus)為代表，通過核酮糖單磷酸途徑(ribulose monophosphate pathway，RuMP)直接同化甲醛。

圖1 扭脫甲基桿菌中心代謝網(wǎng)絡(luò)及高值產(chǎn)品的合成Fig.1 Central metabolic network pathway and the synthesis of high value-addedproducts of Methylobacterium extorquens

1.1 一碳化合物的氧化模塊

甲醇是甲基營養(yǎng)菌的主要一碳碳源，甲基營養(yǎng)菌細(xì)胞周質(zhì)空間的甲醇脫氫酶(MDH)負(fù)責(zé)氧化甲醇。前期普遍認(rèn)為扭脫甲基桿菌的甲醇脫氫酶是一種吡咯喹啉醌(PQQ)依賴性的酶，不需消耗還原力NAD(P)H，Ca2+結(jié)合到活性位點將甲醇催化氧化為甲醛，該甲醇脫氫酶是一個α2β2的四聚體結(jié)構(gòu)，輔酶PQQ深埋在一個疏水口袋中，作為電子受體參與酶催化過程[12]。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)甲醇脫氫酶除了包含上述MXAF型甲醇脫氫酶(MXAF-type MDH)，還包括XOXF型甲醇脫氫酶(XOXF-type MDH)[13]。

扭脫甲基桿菌的基因組研究分析表明，MXAF類型甲醇氧化系統(tǒng)至少有25個基因參與MDH催化以及調(diào)控[14]。這些基因分為5個基因簇mxa、mxb、pqqABC/DE、pqqFG和mxc。mxa基因簇包括mxaFJGIRSACKLDEHB和位于其上游的mxaW基因，mxaF和mxaI分別編碼MDH的α亞基(6.6×104)和β亞基(9.0×103)，mxaG編碼細(xì)胞色素C的結(jié)構(gòu)蛋白[15]，mxaJ、mxaR、mxaS、mxaD、mxaE和mxaH基因的功能未知，猜測可能與MDH的裝配與穩(wěn)定性有關(guān)[16]，mxaACK和mxaL負(fù)責(zé)將Ca2+插入甲醇脫氫酶催化活性位點[17]，mxaB是甲醇氧化相關(guān)基因的調(diào)控因子，mxaW的功能還不清楚，對該基因做突變也無任何表型，但在其上游存在一個甲醇誘導(dǎo)型啟動子[18]。pqqABCDE和pqqFG構(gòu)成一個基因簇，它與PQQ的合成有關(guān)[19]。mxbD、M和mxcQ、E這4個基因與甲醇氧化系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)[20-21]。

近年對甲基營養(yǎng)菌基因組分析發(fā)現(xiàn)，存在另一類重要的催化甲醇氧化的脫氫酶XOXF-type MDHs，XOXF型的甲醇脫氫酶同樣依賴輔酶PQQ，但是以鑭系元素(如：鑭和鈰)結(jié)合到活性位點催化甲醇氧化。宏基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)表明[13]，在環(huán)境樣品中，XOXF型甲醇脫氫酶比MXAF型甲醇脫氫酶分布更廣泛；系統(tǒng)發(fā)育分析表明，XOXF型甲醇脫氫酶至少分為5個不同的系統(tǒng)發(fā)育分支，而MXAF型甲醇脫氫酶只是其中的一小部分，所以MXAF型甲醇脫氫酶可能是在XOXF型甲醇脫氫酶基礎(chǔ)上進(jìn)化而來的[22]。XOXF型甲醇脫氫酶是由2個亞基組成的二聚體結(jié)構(gòu)，通過晶體結(jié)構(gòu)分析和密度泛函理論計算[23]發(fā)現(xiàn)：以鑭系元素而不是Ca2+結(jié)合到活性位點，使得XOXF型甲醇脫氫酶具有更高的催化效率。Skovran等[24]發(fā)現(xiàn)扭脫甲基桿菌上XOXF型甲醇脫氫酶具有2個同源基因xoxF1和xoxF2，它們之間有90%的氨基酸相似性，與mxaF基因有50%相似性。在以甲醇為碳源、外加鑭離子(La3+)時發(fā)現(xiàn)，xoxF1基因的單一突變導(dǎo)致扭脫甲基桿菌的部分生長缺陷，而xoxF2的突變沒有明顯的生長缺陷，因此，xoxF1發(fā)揮更為主要的作用；同時他們還發(fā)現(xiàn)：當(dāng)以甲醇為碳源，加入Ca2+、不加La3+時，MXAF型甲醇脫氫酶將甲醇氧化成甲醛過程中，xoxF基因起到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，xoxF突變菌株無法正常生長，故maxF基因的表達(dá)依賴于xoxf基因。Vu等[25]發(fā)現(xiàn)扭脫甲基桿菌以甲醇為碳源，外加La3+培養(yǎng)，當(dāng)La3+濃度從25 nmol/L不斷增加時，xoxF基因的啟動子xox1的轉(zhuǎn)錄水平不斷提高，在250 nmol/L的La3+濃度下，xox1達(dá)到最大表達(dá)量，由此發(fā)現(xiàn)：xox1是鑭依賴型啟動子，并對mxaF的啟動子mxa的轉(zhuǎn)錄有明顯抑制作用。此外，當(dāng)以甲醇為碳源、不加La3+的情況下，xoxF2單突變體菌株生長基本不受影響，xoxF1單突變體菌株生長受到明顯抑制，xoxF1和xoxF2雙突變體菌株不能生長，三突變體菌株(敲除mxaF、xoxF1和xoxF2)也不能生長，但對三突變體培養(yǎng)體系外加鑭系元素，菌株能夠緩慢生長，這證明還可能存在另一種未知的醇脫氫酶，具有氧化甲醇的能力。Good等[26]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以甲醇為碳源、外加鑭系元素時，乙醇脫氫酶(EXAF)發(fā)揮氧化甲醇的作用，實驗數(shù)據(jù)表明，該乙醇脫氫酶是目前報道的最有效的PQQ-依賴型的乙醇脫氫酶，成為第一個非XOXF型的醇氧化系統(tǒng)中使用鑭系元素作為輔助因子的脫氫酶。

1.2 一碳中間代謝物(甲醛)的異化模塊

Vorholt等[27]在2000年發(fā)現(xiàn)：扭脫甲基桿菌中存在甲醛活化酶(FAE)催化甲醛轉(zhuǎn)化為methylene-H4MPT，繼而methylene-H4MPT脫氫酶(MTDAB)把methylene-H4MPT氧化為methenyl-H4MPT，同時產(chǎn)生1分子NAD(P)H為同化作用提供還原力[28]；后經(jīng)methenyl-H4MPT環(huán)化水解酶(MCH)轉(zhuǎn)化為formyl-H4MPT，在甲酰-甲烷呋喃脫氫酶(formyl-MFR dehydrogenase， FCHABCD)作用下，水解formyl-H4MPT產(chǎn)生甲酸[29]；最后由甲酸脫氫酶(FDH)徹底氧化甲酸，釋放1分子CO2，并產(chǎn)生還原力NADH。扭脫甲基桿菌中存在編碼甲酸脫氫酶的4個基因，對其中的3個基因突變后，突變株仍能在甲醇上生長，但有甲酸積累，對第4個基因進(jìn)行突變后失去了生長能力，這說明了甲酸氧化對甲基營養(yǎng)菌在甲醇上生長的重要作用[30]。

1.3 一碳中間物(甲醛或甲酸)的同化模塊

絲氨酸循環(huán)是最早在扭脫甲基桿菌中發(fā)現(xiàn)的同化模塊，其一碳單元傳遞過程中首先消耗1分子ATP和1分子NADH生成formyl H4F，與甘氨酸在絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(GlyA)催化作用下生成絲氨酸，進(jìn)入絲氨酸循環(huán)，絲氨酸一部分轉(zhuǎn)化成乙醛酸用于甘氨酸再生，另一部分則直接轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A。在扭脫甲基桿菌中，絲氨酸循環(huán)的基因都在2個操縱子上轉(zhuǎn)錄，sga-hpr-mtdA-fch為qsc1操縱子，mtkA-mtkB-ppc-mclA為qsc2操縱子，且受QscR調(diào)控子的調(diào)控[31]。

絲氨酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物與糖異生、三羧酸循環(huán)(TCA)共用，因此，乙醛酸的再生是保持循環(huán)正常持續(xù)所必須的，但是在扭脫甲基桿菌中缺少乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶異檸檬酸裂解酶(isocitratelyase)，直到2007年，Erb等[32]發(fā)現(xiàn)扭脫甲基桿菌能夠合成一系列以C5-二羧酸作為配體的輔酶A，提出乙酰丙二酰輔酶A途徑(EMCP)實現(xiàn)乙醛酸的再生。2009年,Peyraud等[33]用13C標(biāo)記代謝組測定了不同的輔酶A衍生物的生成順序，進(jìn)一步完整證明了EMCP途徑和再生乙醛酸的功能。在EMCP代謝途徑中，乙酰輔酶A在3個酶連續(xù)催化作用下生成巴豆酰輔酶A，在巴豆酰輔酶A羧化酶/還原酶(CCR)催化下生成乙基丙二酰輔酶A，這是EMCP途徑中的第1個羧化反應(yīng)，繼而在乙基丙二酰輔酶A異構(gòu)酶(EPI)和乙基丙二酰輔酶變位酶(ECM)催化下生成甲基琥珀酰輔酶A，再生成甲基延胡索酰輔酶A、甲基蘋果酰輔酶A，隨后裂解生成1分子丙酰輔酶A和1分子乙醛酸，乙醛酸再生進(jìn)入絲氨酸循環(huán)，丙酰輔酶A與CO2發(fā)生羧化反應(yīng)生成甲基丙酰輔酶A，這是EMCP途徑中第2個羧化反應(yīng)。最后生成琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)化成蘋果酸，進(jìn)入絲氨酸循環(huán)。EMCP途徑中的大部分酶都是與其他代謝途徑共享的，只有乙基丙二酰輔酶變位酶(ECM)和巴豆酰輔酶A羧化酶/還原酶(CCR)是該途徑所特有的[32,34]，在EMCP代謝途徑中包括兩步NADPH消耗反應(yīng)。2016年，筆者所在課題組的Cui等[35]在過表達(dá)ecm、phaA和mcmAB基因后發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)ecm基因能夠重新分配碳流量分布，降低合成PHB的代謝流，強(qiáng)化EMCP代謝通量，導(dǎo)致PHB降低4.5倍，并使中間代謝物3-羥基丙酰輔酶A提高1.6倍，使乙醛酸積累，超過絲氨酸循環(huán)的消耗能力將其釋放到胞外，從而抑制細(xì)胞生長。由此可見，EMCP途徑各個基因的協(xié)同調(diào)控才能促使甲基營養(yǎng)菌在甲醇上更好的生長。

甲基營養(yǎng)菌(如甲醇芽孢桿菌)還可以直接利用核酮糖單磷酸(RuMP)途徑同化甲醛，核酮糖單磷酸途徑由2種核心酶組成，即3-己酮糖-6-磷酸合成酶(HPS)和6-磷酸-3己糖異構(gòu)酶(PHI)。HPS催化甲醛和核酮糖-5磷酸生成己酮糖-6-磷酸。PHI使己酮糖-6-磷酸異構(gòu)化為果糖-6-磷酸[36-37]。這條途徑產(chǎn)生1分子ATP和1分子NADH，因而從能量和還原力的角度看，該路徑比絲氨酸循環(huán)途徑具有更高效率，使得核酮糖單磷酸途徑成為在異源宿主中構(gòu)建一碳代謝網(wǎng)絡(luò)的首選同化途徑。

2 代謝工程改造甲基營養(yǎng)菌合成高值產(chǎn)品

雖然在1970年，甲醇用于工業(yè)化生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白[36]，但是直到近年，隨著基因工程技術(shù)與組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在甲基營養(yǎng)菌中構(gòu)建重組底盤將甲醇轉(zhuǎn)化為各類高附加值產(chǎn)品(如：生物燃料、烯萜類化合物和有機(jī)酸)才備受關(guān)注，見表1。

在過去幾十年中，生物法生產(chǎn)的二元羧酸產(chǎn)物是一個具有顯著進(jìn)步的新興研究領(lǐng)域。2014年，Sonntag等[38]在扭脫甲基桿菌中利用EMCP途徑中間代謝物作為前體物，通過異源表達(dá)硫酯酶(thioesterases)YCIA水解甲基琥珀酰輔酶A(mesaconyl-CoA)和中康酰輔酶A(methylsuccinyl-CoA)釋放出輔酶A生成相應(yīng)的二元羧酸、中康酸和(2S)-甲基琥珀酸，繼而通過降低培養(yǎng)基中Na+濃度，實現(xiàn)中康酸和(2S)-甲基琥珀酸產(chǎn)量的提高，并且以敲除聚羥基脂肪酸酯合成酶(PHAC)的表達(dá)來阻止EMCP代謝流流向聚羥基丁酸酯(PHB)的合成，最終產(chǎn)物濃度增加5倍。此外，微調(diào)生長限制性金屬鈷濃度可以使甲基琥珀酰輔酶A和中康酰輔酶A在胞內(nèi)大量積累(增加16倍)，進(jìn)而導(dǎo)致中康酸和(2S)-甲基琥珀酸的合成增加6倍，最終產(chǎn)量達(dá)到0.65 g/L，得率為17%(以1 g甲醇為參照)[46]。

表1 源于甲醇高附加值產(chǎn)品

Hu等[39]和筆者所在課題組合作，在扭脫甲基桿菌利用EMCP途徑的中間代謝產(chǎn)物巴豆酰輔酶A為前體物異源表達(dá)來自齒垢密螺旋體(Treponemadenticola)中的反式烯酰輔酶A還原酶(trans-enoyl-CoA reductase)和丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)中的醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)，構(gòu)建了合成正丁醇的異源途徑(其中反式烯酰輔酶A可以催化巴豆酰輔酶A生成丁酰輔酶A，丁酰輔酶A在醇脫氫酶的催化下生成正丁醇)；繼而通過代謝工程調(diào)控ter和adhe2基因及上游croR基因表達(dá)、菌株適應(yīng)性進(jìn)化篩選及組學(xué)研究，在搖瓶中，正丁醇產(chǎn)量從15.2 mg/L提高到25.5 mg/L[40]。

Sonntag等[41]2015年在扭脫甲基桿菌中異源表達(dá)8個基因，利用甲醇從頭合成類倍半萜烯-α-蛇麻烯。其中，構(gòu)建來自黃粘球菌的異源甲羥戊酸(MVA)途徑包括羥甲基戊二酰輔酶A合成酶(HMGS)、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)、甲羥戊酸激酶(MVAK)、磷酸戊糖酸激酶(MVAK2)、焦磷酸戊糖醛酸脫羧酶(MVAD)和異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶(FNI)，還有來自紅球姜的α-蛇麻烯合成酶(ZSSI)結(jié)合來自釀酒酵母法呢基焦磷酸合成酶(ERG20)的表達(dá)，最后α-蛇麻烯基礎(chǔ)產(chǎn)量達(dá)到18 mg/L。通過優(yōu)化甲羥戊酸途徑中α-蛇麻稀合成酶和FPP合成酶的核糖體結(jié)合位點序列，導(dǎo)致蛇麻烯產(chǎn)量增加3倍，進(jìn)而利用類胡蘿卜素合成缺陷突變株，產(chǎn)量又提高30%。在以甲醇為碳源的流加發(fā)酵培養(yǎng)條件下，最終產(chǎn)品質(zhì)量濃度達(dá)到1.65 g/L。

2016年，清華大學(xué)邢新會課題組的Liang等[43]利用扭脫甲基桿菌EMCP途徑的中間代謝物作為前體物，通過異源表達(dá)來自德國小蠊(Blattellagermanica)的基因hmgcs1和來自克氏錐蟲(Trypanosomacruzi)的基因tchmgr，構(gòu)建了甲羥戊酸途徑。甲羥戊二酰輔酶A合成酶(HMGS)催化乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A生成羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)，繼而在羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)催化下生成甲羥戊酸，獲得基礎(chǔ)產(chǎn)量是66 mg/L。在操縱子(MVH)中引入來自于羅爾斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)的phaA，進(jìn)而調(diào)控基因phaA表達(dá)水平，甲羥戊酸的產(chǎn)量增加到0.18 g/L，調(diào)節(jié)核糖體結(jié)合位點的強(qiáng)度，進(jìn)一步修飾phaA基因表達(dá)水平，使得甲羥戊酸產(chǎn)量額外增加20%，為0.215 g/L，最終流加培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)生的甲羥戊酸為2.22 g/L[42]。此外，他們通過一個輔助生物傳感器的轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程(SATRE)控制代謝流量的再分配來增加乙酰輔酶A通量，進(jìn)一步增加了甲羥戊酸的產(chǎn)量。基于生物傳感器轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)庫的高通量篩選，成功地分離了突變株(Q49)，最終產(chǎn)品質(zhì)量濃度達(dá)到2.67 g/L。

2017年，Rohde等[44]利用扭脫甲基桿菌聚-3-羥基丁酸(PHB)途徑，通過異源表達(dá)表達(dá)來自塞內(nèi)加爾芽孢桿菌(Bacillusmassiliosenegalensis) JC6特異性VB12依賴性的突變酶(RCM)催化(R)-3-羥基丁酰輔酶A((R)-3-hydroxybutyryl-CoA)生成2-羥基異丁酸(2-hydroxyisobutyric acid，2-HIBA)，在流加培養(yǎng)發(fā)酵的條件下，2-HIBA產(chǎn)量可達(dá)到2.1 g/L。

2017年，筆者所在課題組的Yang等[45]在扭脫甲基桿菌中利用EMCP途徑的乙酰輔酶A為前體物，通過異源表達(dá)來自橙色綠屈撓菌(Chloroflexusaurantiacus)基因mcr(該基因編碼丙二酰輔酶A還原酶(malonyl-CoA))，轉(zhuǎn)化甲醇合成3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3-HP)，并解析3-HP在合成過程中由指數(shù)期向穩(wěn)定期過渡時快速降解的機(jī)制，為構(gòu)建穩(wěn)定而高效合成3-HP的工程菌株奠定前期基礎(chǔ)。

3 構(gòu)建合成型甲基菌

基于對甲基營養(yǎng)菌生理生化特性以及代謝途徑改造的深入研究，人們渴望利用傳統(tǒng)的基因工程菌作為底盤構(gòu)建合成型甲基菌(synthetic m e t h y l o t r o p h s)，一方面可以借助目前已經(jīng)開發(fā)的各種合成生物學(xué)改造策略，另一方面，傳統(tǒng)工程菌的生長和調(diào)控機(jī)制更加清晰，改造上具有更多優(yōu)勢。

Müller等[47]嘗試在大腸桿菌中通過異源表達(dá)NAD依賴性的甲醇脫氫酶(MDH)和核酮糖單磷酸途徑關(guān)鍵酶，構(gòu)建甲醇氧化同化途徑，構(gòu)建核酮糖單磷酸循環(huán)需要表達(dá)的基因是編碼3-己酮糖-6-磷酸合成酶的hps和編碼6-磷酸-3-己糖異構(gòu)酶的phi。通過對不同物種候選酶在大腸桿菌的體外和體內(nèi)酶活進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)來源于甲醇芽孢桿菌(Bacillusmethanolicus)的MDH、HPS和PHI在大腸桿菌中的異源表達(dá)效果最佳。在大腸桿菌表達(dá)這些酶后，其13C甲醇標(biāo)記實驗顯示了40% 甲醇被利用轉(zhuǎn)化成中心代謝物。

Witthoff等[48]嘗試在谷氨酸棒狀桿菌中通過異源表達(dá)來自甲醇芽孢桿菌中甲醇脫氫酶和核酮糖單磷酸途徑關(guān)鍵酶HPS和PHI來實現(xiàn)改造谷氨酸棒狀桿菌利用甲醇。重構(gòu)底盤的谷氨酸棒桿菌顯示在葡萄糖和甲醇混合培養(yǎng)基中，甲醇的平均消耗速率為(1.7±0.3) mmol/(L·h)。此外，13C甲醇標(biāo)記實驗同樣證實細(xì)胞內(nèi)多種代謝物，有3%～10%的量被13C標(biāo)記，而谷氨酸棒狀桿菌在ald和adhE雙突變體的背景下，減少了甲醛氧化生成CO2的通量，細(xì)胞內(nèi)代謝物13C的標(biāo)記增加8%～25%。

2017年，Whitaker等[49]在大腸桿菌中異源表達(dá)來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的MDH組合和來自甲醇芽孢桿菌(Bacillusmethanolicus)的HPS和PHI，13C甲醇標(biāo)記實驗證實糖酵解途徑(embden-meyerhof pathway,EMP)和檸檬酸循環(huán)途徑(citric acid cycle pathway，TCA)的中間代謝物均被13C標(biāo)記，并且進(jìn)一步證明在大腸桿菌中合成黃烷酮柚皮素(flavanonenaringenin)的代謝流部分來源于底物甲醇。

4 結(jié)論與展望

甲基營養(yǎng)菌具有十分獨特的一碳代謝途徑和相關(guān)基因及酶系，這不但可拓展微生物代謝途徑研究及發(fā)現(xiàn)新功能基因，而且同時為甲基營養(yǎng)菌基因工具開發(fā)和代謝工程改造、為將甲醇生物催化轉(zhuǎn)生成高附加值產(chǎn)品提供重要理論與實踐價值。目前，在扭脫甲基桿菌中構(gòu)建異源途徑，已成功實現(xiàn)將甲醇轉(zhuǎn)生成中康酸、(2S)-甲基琥珀酸、正丁醇、α-蛇麻烯、甲羥戊酸、2-羥基異丁酸(2-HIBA)和3-羥基丙酸(3-HP)等多種高附加值產(chǎn)品，這些開創(chuàng)性研究為甲醇工業(yè)高值化的生物轉(zhuǎn)化提供新策略。隨著全球頁巖氣開采和沼氣技術(shù)發(fā)展，甲醇基構(gòu)建的底盤菌也可發(fā)展為甲烷基為中心的綠色催化轉(zhuǎn)化細(xì)胞工廠。

目前，合成型甲基細(xì)菌還未能實現(xiàn)以甲醇作為唯一的碳源和能源進(jìn)行生長、代謝與產(chǎn)品合成，究其原因可能是甲基營養(yǎng)菌和傳統(tǒng)工程菌無論在代謝酶系、轉(zhuǎn)錄因子還是信號分子上都存在較大差異；此外，在傳統(tǒng)工程菌中異源表達(dá)NAD依賴性的MDH具有可逆催化甲醛還原的特性[50]，這會競爭一碳代謝流向下游同化途徑。目前的研究證明，傳統(tǒng)工程菌作為底盤改造成甲醇利用菌還存在一定的技術(shù)瓶頸，有待突破。未來，如何尋找更高效NAD依賴性的MDH，如何從基因組水平調(diào)控合成型甲基細(xì)菌的代謝網(wǎng)絡(luò)以強(qiáng)化一碳氧化和同化過程，是獲得高效利用一碳的合成型甲基細(xì)菌的新策略。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Advancesinmetabolicnetworkpathwaysandmetabolicengineeringofmethylotrophicbacteria

YANG Jing1,2,CHEN Wenjing1,2,ZHANG Min1,2,YUAN Xiaojie1,2,YANG Yiming1,2,ZHU Liping1,2,3,YANG Song1,2,3

(1.School of Life Sciences,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China; 2.Shandong Province Key Laboratory of Applied Mycology,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China; 3.Qingdao International Center on Microbes Utilizing Biogas,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

Efficient conversion of a carbon compound (methanol or methane) is of important research interest in the field of bioengineering.Methylotrophs are gram negative organisms using C1 compounds such as methane and methanol as the sole carbon and energy source.With the development of genome sequencing and various omics technologies,the central metabolic network pathway and related functional genes of methylotrophs,represented byMethylobacteriumextorquens,are clearly shown.More recently,the improvement of genetic manipulation tools such as gene overexpression and gene knockout,and various gene regulatory elements,provide important basis for methylotrophic chassis modification and optimization of heterologous expression.Researches promoted the conversion of methanol into a variety of value-added products.In addition,people are eager to use the traditional genetic engineering bacteria as a chassis to build synthetic methylotrophs,in order to achieve more efficient methanol catalytic conversion.In this paper,the characteristics of metabolic network,metabolic engineering strategyand the construction of synthetic methylotrophs are summarized.

methylotrophs;metabolic engineering;metabolic network pathways;synthetic m e t h y l o t r o phs;methanol

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.06.002

2017-08-08

國家自然科學(xué)基金聯(lián)合基金重點培育項目(U1462109)；山東省重點研發(fā)計劃(2016GSF121010)；山東省自然科學(xué)基金面上項目(ZR2013CM024)

楊 靖(1991—)，女，山東棗莊人，研究方向：甲基微生物代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控與代謝工程改造；楊 松(聯(lián)系人)，教授，E-mail:yangsong1209@163.com

Q78;Q819

A

1672-3678(2017)06-0009-08