柴新義，倪瓚鵬，于士軍，張微微，殷培峰

(滁州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 滁州239000)

黑木耳菌絲體液體發(fā)酵富硒條件優(yōu)化及其多糖抗氧化活性

柴新義，倪瓚鵬，于士軍，張微微，殷培峰

(滁州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 滁州239000)

對(duì)黑木耳菌絲體液體發(fā)酵富硒條件及菌絲體多糖抗氧化活性進(jìn)行了研究，旨在尋找新型富硒抗氧化物質(zhì)并為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考資料。以黑木耳菌絲體的富硒量為測(cè)定指標(biāo)，運(yùn)用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)黑木耳菌絲體液體發(fā)酵富硒條件進(jìn)行優(yōu)化，以DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼)自由基清除率為測(cè)定指標(biāo)，采用DPPH還原法對(duì)黑木耳液體發(fā)酵菌絲體多糖的抗氧化活性進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明，黑木耳菌絲體液體發(fā)酵的最適富硒條件為：葡萄糖20 g·L-1，酵母膏2.5 g·L-1，硒濃度7.5 μg·mL-1，pH 6.5，溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速140 r·min-1，培養(yǎng)時(shí)間5 d。該條件下黑木耳液體發(fā)酵的菌絲體富硒量可達(dá)853.16 μg·g-1，較優(yōu)化前提高了66%。黑木耳菌絲體多糖對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)76.12%。優(yōu)化后的培養(yǎng)條件較好地提升了黑木耳菌絲體液體發(fā)酵的富硒效果。

黑木耳；液體發(fā)酵；富硒量；多糖；抗氧化活性

黑木耳(Auriculariaauricula)屬擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)，木耳目(Auriculariales)，木耳科(Auriculariaceae)，單生，藥食兩用的大型真菌，具有補(bǔ)腦、補(bǔ)血、鎮(zhèn)痛止血、抗癌、提高人體免疫力等多種功效。東北、湖北、浙江等地都有分布，生長(zhǎng)于櫟、楊、槐等100多種闊葉樹(shù)的腐木上[1]。硒是人體必需的微量元素，是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的重要組成部分。貧血、肝硬化、糖尿病、大骨節(jié)病、癌癥等疾病的發(fā)生往往與人體內(nèi)硒元素的缺乏存在一定的相關(guān)性[2-6]。研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳菌絲體具有很強(qiáng)的富硒能力[7-8]。木耳多糖具有抗凝血、降血脂、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和抑制腫瘤等作用[9-10]。多糖與硒可以結(jié)合成為多糖有機(jī)硒化合物，從而更容易被人體吸收[11-13]。全球約有50個(gè)國(guó)家和地區(qū)缺硒情況較為嚴(yán)重，且硒的區(qū)域分布極為不均，而在我國(guó)70%以上地區(qū)的人群都處于不同程度的缺硒狀態(tài)，食用菌具有較強(qiáng)的富集微量元素的能力[8，10]。因此，我們要開(kāi)發(fā)富硒食用菌，通過(guò)食用菌的培養(yǎng)將硒有機(jī)化，從而研制成富硒的食品或藥品[14]。本研究通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)黑木耳菌絲體液體發(fā)酵的富硒條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的富硒黑木耳菌絲體，同時(shí)采用DPPH還原法對(duì)黑木耳菌絲體多糖的抗氧化活性進(jìn)行初步研究，從而為開(kāi)發(fā)富硒黑木耳食藥用制品提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黑木耳SWSPXY-DP21購(gòu)自湖北省武漢華中食用菌栽培研究所。

1.1.2 試劑

DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；馬鈴薯，市購(gòu)；亞硒酸鈉、硝酸、NaOH、HCl、甲苯、乙二胺四乙酸(EDTA)、3，3’-二氨基聯(lián)苯胺(C12H14N4)、乙醇、MgSO4·7H2O、葡萄糖、瓊脂粉、KH2PO4等均為分析純?cè)噭?，?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，加水至1 000 mL，自然pH。

液體菌種培養(yǎng)基：黃豆芽汁20%，葡萄糖20%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%。

搖瓶發(fā)酵液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20%，酵母膏2%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

SW-CJ-1BU型超凈工作臺(tái)，蘇州新區(qū)楓橋凈化設(shè)備廠；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；HZQ-A型恒溫培養(yǎng)振動(dòng)器(搖床)，常州冠軍儀器制造有限公司；FA1104型電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；IEC Multi型高速離心機(jī)，美國(guó)熱電集團(tuán)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；UV2800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

在超凈工作臺(tái)中，用無(wú)菌接種針從母種斜面試管中挑取黃豆粒大小的菌絲塊，接種于平板培養(yǎng)基的中央，置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。

1.2.2 液體菌種的制備

將液體菌種培養(yǎng)基按照120 mL的裝液量分裝于250 mL的三角瓶中，121 ℃下滅菌20 min。冷卻至室溫后，無(wú)菌條件下，用打孔器將上述已活化的平板菌種接種于液體種子培養(yǎng)基中，每瓶接種10個(gè)，接種完成后，置于25 ℃、120 r·min-1全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)結(jié)束后，置4 ℃冰箱，備用。

1.2.3 富硒量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]中的方法，用電子天平準(zhǔn)確稱取黑木耳菌絲體(干質(zhì)量)0.1 g，置消化器中，加入6 mL濃硝酸，處理樣品至無(wú)色透明狀。用自來(lái)水冷卻，冷卻后將處理液全部移入20 mL容量瓶，用NaOH調(diào)節(jié)pH 7.0左右，定容，待測(cè)。取待測(cè)液5 mL，置入分液漏斗，加35 mL蒸餾水稀釋，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，隨后，加入EDTA-Na2溶液2 mL和3，3′-二氨基聯(lián)苯胺溶液2 mL，混勻，靜置30 min，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，再加10 mL甲苯，混勻，靜置，取甲苯層樣品，置于分光光度計(jì)420 nm處測(cè)定樣品吸光值。硒對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照文獻(xiàn)[16]中的方法進(jìn)行。

菌絲體中的硒含量(μg·g-1)=CV/WN×M。

富硒量(μg·g-1)=富硒菌絲體的硒含量(μg·g-1)-空白菌絲體的硒含量(μg·g-1)。

式中，C—從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出被測(cè)樣品中硒的標(biāo)準(zhǔn)濃度(μg·L-1)；V—甲苯萃取所得的樣品體積(mL)；N—測(cè)定時(shí)所取樣品的體積占定容樣品體積的體積分?jǐn)?shù)；W—測(cè)定時(shí)所取樣品的質(zhì)量(g)；M—菌絲體實(shí)際干質(zhì)量(g)。

1.2.4 多糖的提取及測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17]中的多糖提取方法進(jìn)行。

1.2.5 碳氮源對(duì)黑木耳菌絲體生長(zhǎng)和富硒的影響

碳源對(duì)黑木耳菌絲體生長(zhǎng)及富硒的影響：在搖瓶發(fā)酵液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別選用20%葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、玉米粉、可溶性淀粉作為唯一碳源，同時(shí)，液體培養(yǎng)基中按照5 μg·mL-1的量加入亞硒酸鈉，其他成分及含量不變，以120 mL的裝液量分裝至250 mL的三角瓶中。121 ℃，滅菌20 min。按照10%的接種量接種液體菌種，接種完成后，置于25 ℃，120 r·min-1全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)1.2.3節(jié)和1.2.4節(jié)中的方法測(cè)定黑木耳菌絲體的干質(zhì)量和富硒量。每種處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

氮源對(duì)黑木耳菌絲體生長(zhǎng)及富硒的影響：在上述篩選的最優(yōu)碳源的基礎(chǔ)上，分別選用2%蛋白胨、酵母膏、麩皮、尿素、甘氨酸作為唯一氮源，制備搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基，同時(shí)，液體培養(yǎng)基中按照5 μg·mL-1的量加入亞硒酸鈉，其他成分及含量不變，以120 mL的裝液量分裝至250 mL的三角瓶中，121 ℃，滅菌20 min。按照10%的接種量接種液體菌種，接種完成后，置于25 ℃，120 r·min-1全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)1.2.3節(jié)和1.2.4節(jié)中的方法測(cè)定黑木耳菌絲體干質(zhì)量和富硒量。每種處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 黑木耳液體發(fā)酵富硒條件的研究

最適硒濃度的篩選：根據(jù)上述碳氮源篩選試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，配制搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基，分別設(shè)置不同濃度梯度的亞硒酸鈉，其含硒量分別為0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 μg·mL-1。以120 mL的裝液量分裝至250 mL的三角瓶中，121 ℃下滅菌20 min。冷卻至室溫后，按照10%的接種量接種液體菌種，接種完成后，置于25 ℃，120 r·min-1全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)1.2.3節(jié)和1.2.4節(jié)中的方法測(cè)定黑木耳菌絲體干重質(zhì)量和富硒量。每種處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

最適起始pH的篩選：根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，配制搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基，用pH計(jì)分別調(diào)節(jié)起始pH為5.0、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5。以120 mL的裝液量分裝至250 mL的三角瓶中，121 ℃下滅菌20 min。冷卻至室溫后，按照10%的接種量接種液體菌種，接種完成后，置于25 ℃，120 r·min-1全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)1.2.3節(jié)和1.2.4節(jié)中的方法測(cè)定黑木耳菌絲體干質(zhì)量和富硒量。每種處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

最適培養(yǎng)溫度的篩選：根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，配制搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基。以120 mL的裝液量分裝至250 mL的三角瓶中。121 ℃下滅菌20 min。冷卻至室溫后，按照10%的接種量接種液體菌種，接種完成后，分別置于19、22、25、28、31 ℃的培養(yǎng)溫度下，120 r·min-1全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)1.2.3和1.2.4節(jié)中的方法測(cè)定黑木耳菌絲體干質(zhì)量和富硒量。每種處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

最適轉(zhuǎn)速的篩選：根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，配制搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基。以120 mL的裝液量分裝至250 mL的三角瓶中。121 ℃下滅菌20 min。冷卻至室溫后，按照10%的接種量接種液體菌種，接種完成后，置于上述篩選出的最適培養(yǎng)溫度下，分別置于110、120、130、140、150、160 r·min-1的轉(zhuǎn)速下于全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)1.2.3節(jié)和1.2.4節(jié)中的方法測(cè)定黑木耳菌絲體干質(zhì)量和富硒量。每種處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

最適培養(yǎng)時(shí)間的篩選：根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，配制搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基。以120 mL的裝液量分裝至250 mL的三角瓶中。121 ℃下滅菌20 min。冷卻至室溫后，按照10%的接種量接種液體菌種，接種完成后，置于上述篩選出的最適培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速下，分別培養(yǎng)3、5、7、9、11 d。培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)1.2.3節(jié)和1.2.4節(jié)中的方法測(cè)定黑木耳菌絲體干質(zhì)量和富硒量。每種處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.7 正交試驗(yàn)優(yōu)化黑木耳菌絲體液體發(fā)酵富硒條件

在上述單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)DPS 7.55版軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化黑木耳菌絲體液體發(fā)酵富硒條件。選取最優(yōu)的碳源、氮源、硒濃度、pH值、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間7個(gè)因素，每個(gè)因素選取2個(gè)水平，設(shè)計(jì)L8(27)(7因素2水平8處理)正交試驗(yàn)組合。各組合設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.8 黑木耳菌絲體多糖抗氧化活性的初步研究

參照文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行DPPH自由基清除能力的測(cè)定。EC50值是清除率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用DPS 7.55版軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，通過(guò)多重比較分析不同處理間的差異；用Microsoft Excel 2003版軟件進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1碳源對(duì)黑木耳液體發(fā)酵菌絲體生物量及富硒量的影響

圖1結(jié)果表明，葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、玉米粉、可溶性淀粉等不同碳源對(duì)黑木耳液體發(fā)酵菌絲體生物量和富硒量的影響存在明顯差異，以葡萄糖作為唯一碳源時(shí)，黑木耳菌絲體生物量和富硒量均能達(dá)到最高，分別為11.99 g·L-1和515.32 μg·g-1，且與其他處理差異極顯著(P<0.01)。因此，選擇葡萄糖作為黑木耳菌絲體液體發(fā)酵的最適碳源。

2.2氮源對(duì)黑木耳液體發(fā)酵菌絲體生物量及富硒量的影響

圖2結(jié)果表明，不同氮源對(duì)黑木耳液體發(fā)酵菌絲體生物量和富硒量的影響存在差異，以酵母膏作為唯一氮源時(shí)，試驗(yàn)獲得的黑木耳菌絲體生物量最高，可達(dá)12.56 g·L-1，而且與其他不同處理之間的差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)，然而菌絲體的富硒量在蛋白胨(514.24 μg·g-1)和酵母膏(513.46 μg·g-1)之間無(wú)差異，卻與其他處理差異極顯著(P<0.01)。因此，綜上所述，選擇酵母膏作為黑木耳菌絲體液體發(fā)酵的最適氮源。

2.3黑木耳菌絲體液體發(fā)酵富硒培養(yǎng)條件的研究

2.3.1 最適硒濃度的篩選

圖3結(jié)果表明，當(dāng)搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的硒濃度為7.5 μg·mL-1時(shí)，黑木耳的菌絲體富硒量達(dá)最高(512.40 μg·g-1)，且與其他處理之間差異極顯著(P<0.01)。因此，選擇7.5 μg·mL-1作為黑木耳菌絲體液體發(fā)酵的最適硒濃度。

沒(méi)有相同小寫(xiě)字母者表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，沒(méi)有相同大寫(xiě)字母者表示差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)，下同Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)， and capital letters indicate highly significant difference (P<0.01). The same as below圖1 碳源對(duì)黑木耳菌絲體生物量與富硒量的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on biomass and selenium accumulation of Auricularia auricula mycelia

圖2 氮源對(duì)黑木耳菌絲體生物量與富硒量的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on biomass and selenium accumulation of Auricularia auricula mycelia

圖3 硒濃度對(duì)黑木耳菌絲體生物量與富硒量的影響Fig.3 Effects of different selenium concentrations on biomass and selenium accumulation of Auricularia auricula mycelia

2.3.2 最適起始pH的篩選

圖4結(jié)果表明，不同起始pH值對(duì)黑木耳液體發(fā)酵菌絲體生物量和富硒量的影響存在明顯差異，當(dāng)起始pH為6.5時(shí)，黑木耳菌絲體生物量和富硒量均能達(dá)到最高，分別為12.58 g·L-1和521.18 μg·g-1，且與其他處理差異極顯著(P<0.01)。因此，選擇pH 6.5作為黑木耳菌絲體液體發(fā)酵的最適起始pH值。

圖4 起始pH對(duì)黑木耳菌絲體生物量與富硒量的影響Fig.4 Effects of different initial pH on biomass and selenium accumulation of Auricularia auricula mycelia

2.3.3 最適培養(yǎng)溫度的篩選

圖5結(jié)果表明，黑木耳液體發(fā)酵菌絲體的富硒量在31 ℃時(shí)達(dá)到最高值(533.36 μg·g-1)，但與28 ℃時(shí)的菌絲體富硒量(528.11 μg·g-1)之間差異不明顯。而且，培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，黑木耳液體發(fā)酵的菌絲體生物量達(dá)到最高(26.17 g·L-1)。因此，選擇28 ℃作為黑木耳液體發(fā)酵的最適溫度。

圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)黑木耳菌絲體生物量與富硒量的影響Fig.5 Effects of different incubation temperature on biomass and selenium accumulation of Auricularia auricula mycelia

2.3.4 最適轉(zhuǎn)速的篩選

圖6結(jié)果表明，不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲體生物量和富硒量的影響存在明顯差異，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為140 r·min-1時(shí)，黑木耳的菌絲體生物量達(dá)到最高(14.45 g·L-1)，而當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為150 r·min-1時(shí)，黑木耳的菌絲體富硒量達(dá)到最高(541.18 μg·g-1)，雖然在轉(zhuǎn)速150 r·min-1時(shí)得到的菌絲體生物量(14.40 g·L-1)不是最高，但與140 r·min-1轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)獲得的菌絲體生物量之間無(wú)明顯差異。因此，選擇150 r·min-1作為黑木耳液體發(fā)酵的最適搖床轉(zhuǎn)速。

2.3.5 最適培養(yǎng)時(shí)間的篩選

圖7結(jié)果表明，不同的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑木耳液體發(fā)酵菌絲體的生物量與富硒量的影響存在明顯差異，以培養(yǎng)5 d時(shí)，黑木耳液體發(fā)酵的富硒量為最高，達(dá)523.36 μg·g-1，且與其他處理之間差異極顯著(P<0.01)。因此，選擇發(fā)酵培養(yǎng)5 d作為黑木耳液體發(fā)酵的最適培養(yǎng)時(shí)間。

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)黑木耳菌絲體生物量與富硒量的影響Fig.6 Effects of different rotating speed on biomass and selenium accumulation of Auricularia auricula mycelia

2.4正交試驗(yàn)優(yōu)化黑木耳菌絲體液體發(fā)酵富硒培養(yǎng)條件

在上述單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。選取最優(yōu)的碳源、氮源、硒濃度、pH值、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間7個(gè)因素，每個(gè)因素選取2個(gè)水平，設(shè)計(jì)L8(27)正交試驗(yàn)組合(表1)。

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑木耳菌絲體生物量與富硒量的影響Fig.7 Effects of different fermentation time on biomass and selenium accumulation of Auricularia auricula mycelia

黑木耳液體發(fā)酵富硒培養(yǎng)優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)處理見(jiàn)表2。由表2可知，影響黑木耳液體發(fā)酵富硒量大小的依次為培養(yǎng)時(shí)間>pH值>硒濃度>碳源>轉(zhuǎn)速>氮源>培養(yǎng)溫度，說(shuō)明培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑木耳菌絲體液體發(fā)酵富硒量的影響最大，其次為pH值，而培養(yǎng)溫度對(duì)其影響相對(duì)較小。最優(yōu)組合為A1B2C2D2E2F1G1，即葡萄糖20 g·L-1，酵母膏2.5 g·L-1，硒濃度7.5 μg·mL-1，pH 6.5，溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速140 r·min-1，培養(yǎng)時(shí)間5 d，該條件下黑木耳液體發(fā)酵菌絲體的富硒量可達(dá)853.16 μg·g-1，較優(yōu)化前的菌絲體富硒量提高了66%。

表1L8(27)正交試驗(yàn)因子和水平組合表

Table1Factors and level of L8(27) test

水平A碳源Carbonsources/(g·L-1)B氮源Nitrogensources/(g·L-1)C硒濃度Seleniumconcentration/(μg·mL-1)DpH值InitialpHE培養(yǎng)溫度Temperature/℃F轉(zhuǎn)速Rotatingspeed/(r·min-1)G培養(yǎng)時(shí)間Fermentationtime/d1202.06.06.02514052252.57.56.5281507

表2不同正交試驗(yàn)組合對(duì)黑木耳菌絲體液體發(fā)酵富硒量的影響

Table2Results of the orthogonal tests for Se-rich optimal culture condition ofAuriculariaauriculamycelia

組合CombinationsABCDEFG富硒量Se-accumulation/(μg·g-1)11111111623.12±0.2021112222504.37±0.0431221122519.26±0.1141222211853.16±0.2152121212487.25±0.0562122121644.32±0.2372211221528.19±0.2682212112515.24±0.06x1624.98564.77542.73539.46575.49619.69662.20x2543.75603.96625.99629.27593.24549.04506.53R81.2339.2083.2789.8217.7670.66155.67

2.5黑木耳菌絲體多糖抗氧化活性的初步研究

黑木耳菌絲體多糖對(duì)DPPH自由基清除試驗(yàn)的結(jié)果表明，其對(duì)DPPH自由基有很好的清除作用，清除率為76.12%，EC50值為0.65 mg·mL-1。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)黑木耳菌絲體液體發(fā)酵富硒條件及菌絲體多糖抗氧化活性的研究，結(jié)果表明，黑木耳菌絲體液體發(fā)酵的最適富硒條件為:葡萄糖20 g·L-1，酵母膏2.5 g·L-1，硒濃度7.5 μg·mL-1，pH 6.5，溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速140 r·min-1，培養(yǎng)時(shí)間5 d，該條件下黑木耳液體發(fā)酵菌絲體富硒量高達(dá)853.16 μg·g-1，較優(yōu)化前提高了66%。黑木耳菌絲體多糖對(duì)DPPH 自由基清除率為76.12%。以上結(jié)果，顯示了黑木耳具有良好的富硒作用，有許多研究亦表明在冬蟲(chóng)夏草、平菇、靈芝、美味牛肝菌等其他食用菌種類中也表現(xiàn)出菌絲體良好的富硒能力[19-21]。

黑木耳對(duì)碳源的利用較為廣泛，不僅能利用單糖、雙糖，而且也能利用多糖，葡萄糖是黑木耳生長(zhǎng)較好的碳源，氮源以有機(jī)氮源為主，單一無(wú)機(jī)氮源利用性較差，這與其他一些食用菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的研究結(jié)果較為一致[15，22-26]。有些研究表明，適宜的硒濃度在一定程度上可促進(jìn)黑木耳菌絲體的生長(zhǎng)，濃度過(guò)高，反而會(huì)抑制黑木耳菌絲體的生長(zhǎng)，硒是細(xì)胞內(nèi)一些酶的重要輔助因子，可能正是由于激活了菌絲體細(xì)胞的輔酶而促進(jìn)菌絲體的發(fā)育[10，17，22]，而且在適宜硒濃度范圍內(nèi)，無(wú)機(jī)硒進(jìn)入菌絲后，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，可促進(jìn)氨基酸和蛋白質(zhì)的合成，促使氨基酸結(jié)合更多的硒，由此得到含有適量硒的保健品[16，27-28]。

[1] 程瑤， 程鑫， 李昕， 等. 單片黑木耳栽培管理技術(shù)[J]. 中國(guó)林副特產(chǎn)， 2011，110(1):43-45.

CHENG Y， CHENG X， LI X， et al. SingleAuriculariaauriculacultivation management[J].ForestBy-ProductandSpecialityinChina， 2011， 110(1):43-45. (in Chinese with English abstract)

[2] 王海宏， 謝忠枕. 硒的生物學(xué)功能及其機(jī)理研究[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2003， 15 (3):6-11.

WANG H H， XIE Z Z. Research on the biological function mechanism of selenium[J].ActaZoonutrimentaSinica， 2003， 15 (3):6-11. (in Chinese with English abstract)

[3] JR F J， HAMILTON M T， GLENN T C， et al. Dietary selenomethionine administration in the american alligator (Alligatormississippiensis): Hepatic and renal Se accumulation and its effects on growth and body condition[J].ArchivesofEnvironmentalContamination&Toxicology， 2017， 72(3):439-448.

[4] SHARMA S， KAUR N， KAUR S， et al. Selenium as a nutrient in biostimulation and biofortification of cereals[J].IndianJournalofPlantPhysiology, 2016，22(1):1-15.

[5] OLAG M T， EKATERINA， ALEXEI N P， et al. Biodegradation of an organoselenium compound to elemental Selenium byLentinulaedodes(Shiitake) mushroom[J].Biologicaltraceelementresearch， 2012， 149(1):97-101.

[6] YONG J， GUAN X Y， DAI C C. The effects of selenium on polyunsaturated fatty acids ofDiasporangiumjonesianum[J].AppliedBiochemistryBiotechnology， 2014， 172(2):561-569.

[7] 王獻(xiàn)友， 陳培云， 吳廣臣，等. 黑木耳多糖提取及其藥理活性的研究進(jìn)展[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2012， 43(5):683-687.

WANG X Y， CHEN P Y， WU G C， et al. Advances on polysaccharide extraction fromAuriculariaauriculaand its pharmacological activity[J].JournalofSouthernAgriculture， 2012， 43(5):683-687. (in Chinese with English abstract)

[8] 劉建榮， 溫秀榮， 顧雅君. 黑木耳富硒發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2015， 35(6):616-622.

LIU J R， WEN X R， GU Y J. Optimization of Se-enriched fermentation conditions ofAuriculariaauricula[J].JournalofHebeiUniversity(NaturalScienceEdition)， 2015， 35(6):616-622. (in Chinese with English abstract)

[9] SHANG D， LI Y， WANG C， et al. A novel polysaccharide from Se-enrichedGanodermaluciduminduces apoptosis of human breast cancer cells[J].OncologyReports， 2011， 25(1):267-272.

[10] 黃春燕， 張柏松， 萬(wàn)魯長(zhǎng)， 等. 食用菌富硒培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 44(7):81-87.

HUANG C Y， ZHANG B S， WAN L C， et al. Research progress of selenium enriched culture of edible fungi[J].ShandongAgriculturalSciences， 2012， 44(7):81-87. (in Chinese)

[11] 朱黎霞， 周竹音， 潘麗媛. 黑木耳硒多糖抗腫瘤作用的研究[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥科技， 2011，18(5):454.

ZHU L X， ZHOU Z Y， PAN L Y. Study on antitumor effect of selenium polysaccharide fromAuriculariaauricula[J].ChineseMedicineScienceandTechnology， 2011， 18(5):454. (in Chinese)

[12] RECZYNSKI W， MUSZYNSK B， OPOKA W， et al. Comparative study of metals accumulation in cultured in vitro mycelium and naturally grown fruiting bodies ofBoletusbadiusandCantharelluscibarius[J].BiologicalTraceElementResearch， 2013， 153(1/3):355-362.

[13] SENKA S V， IBRAHIM O M， ZORAN P Z， et al. Antioxidant properties of selected Boletus mushrooms[J].FoodBiophysics， 2010， 5(1):49-58.

[14] 王俊， 黃明， 徐幸蓮， 等. 硒及富硒功能食品研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2003(2): 53-56.

WANG J， HUANG M， XU X L， et al. Advance in selenium and selenium-enriched functional foods[J].JiangsuAgriculturalSciences， 2003(2): 53-56. (in Chinese with English abstract)

[15] 柴新義， 王四寶， 樊美珍. 楊樹(shù)菇深層液體發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2006， 34(11):117-120.

CHAI X Y， WANG S B， FAN M Z. Studies on the optimal cultivation ofAgrocybeaegerita’s liquid fermentation[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition)， 2006， 34(11):117-120. (in Chinese with English abstract)

[16] 辛樹(shù)權(quán)， 王曉光， 趙驥民， 等. 硒元素對(duì)黑木耳深層發(fā)酵的影響[J]. 食品科學(xué)， 2009， 30(7): 202-208.

XIN S Q， WANG X G， ZHAO J M， et al. Effects of selenium on submerged fermentation ofAuriculariaauricula[J].FoodScience， 2009， 30(7): 202-208. (in Chinese with English abstract)

[17] 江潔，張文靜，季旭穎. 美味牛肝菌富硒培養(yǎng)條件優(yōu)化及其多糖抗氧化性研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2015，15(12):91-98.

JIANG J， ZHANG W J， JI X Y. Optimization of Se-rich culture conditions and antioxidant activities of polysaccharides fromBoletusedulismycelium[J].JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnology， 2015， 15(12):91-98. (in Chinese with English abstract)

[18] TINA S， CHI T H. Antioxidant activities of buckwheat extracts[J].FoodChemistry， 2005， 90(4): 743-749.

[19] 于克學(xué)， 賈樂(lè)， 王漢忠. 冬蟲(chóng)夏草深層發(fā)酵富硒初步研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)， 2003， 24(4): 3-5.

YU K X， JIA L， WANG H Z. Study on Se-accumulation inCordycepssinensisby submerged fermentation[J].FoodResearchandDevelopment， 2003， 24(4): 3-5. (in Chinese with English abstract)

[20] 劉碧蓉， 溫海祥， 蕭洪東. 富硒平菇菌種的篩選[J]. 中國(guó)食用菌， 2007， 26(3): 14-16.

LIU B R， WEN H X， XIAO H D. Screening on selenium rich strains ofPleurotusostreatus[J].EdibleFungiofChina， 2007， 26(3): 14-16. (in Chinese with English abstract)

[21] 趙鐳， 胡小松. 富硒靈芝的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食用菌， 2002， 22(3): 35-36.

ZHAO L， HU X S. Researches on the Se-accumulatingGanodermalucidum[J].EdibleFungiofChina， 2002， 22(3): 35-36. (in Chinese with English abstract)

[22] 江潔， 麥海美， 解彬， 等. 羊肚菌菌絲體富硒條件優(yōu)化及其硒多糖抗氧化活性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2016， 42(9): 120-125.

JIANG J， MAI H M， XIE B， et al. Optimization of Se-rich culture conditions and antioxidant activities of polysaccharides fromMorchellaesculentamycelium[J].FoodandFermentationindustries， 2016， 42(9): 120-125. (in Chinese with English abstract)

[23] 張恒銀， 孫艷麗， 徐良， 等. 黑木耳液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的初步篩選[J]. 食用菌， 2006，28(5): 13-14.

ZHANG H Y， SUN Y L， XU L， et al. Preliminary screening of submerged fermentation medium ofAuriculariaauricula[J].EdibleFungi， 2006， 28(5): 13-14. (in Chinese)

[24] 王謙， 賈震. 不同條件對(duì)黑木耳液體深層發(fā)酵的影響[J]. 河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2011， 31(1): 74-78.

WANG Q， JIA Z. Effects of different conditions on the black fungus in submerged fermentation[J].JournalofHeibeiUniversity(NaturalScienceEdition)， 2011， 31(1): 74-78. (in Chinese with English abstract)

[25] 肖彩霞， 王玉紅， 章克昌. 黑木耳深層發(fā)酵工藝條件的研究[J]. 生物技術(shù)， 2004， 15(5): 71-72.

XIAO C X， WANG Y H， ZHANG K C. Studies on submerged fermentation ofAuriculariaauricula[J].Biotechnology， 2004， 15(5): 71-72. (in Chinese with English abstract)

[26] 柴新義， 于士軍， 張微微， 等. 食藥用大型真菌抗氧化活性菌株的篩選及其培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械， 2016， 32(1):125-129.

CHAI X Y， YU S J， ZHANG W W， et al. Screening the strain with antioxidation activity from wild macrofungi and optimization of its fermentation conditions[J].FoodandMachinery， 2016， 32(1):125-129. (in Chinese with English abstract)

[27] 尚德靜， 王關(guān)林. 四種食用菌富硒能力的比較研究[J]. 食用菌學(xué)報(bào)， 1999， 6(3): 17-20.

SHANG D J， WANG G L. Comparison of selenium accumulation ability in the mycelia of four edible fungi[J].ActaEdulisFungi， 1999， 6(3): 17-20. (in Chinese with English abstract)

[28] 胡文軍， 傅庭治， 曹幼琴. 硒在金針菇菌體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化[J]. 中國(guó)食用菌， 1997， 16(3): 30-33.

HU W J， FU T Z， CAO Y Q. Biotransformation of selenium in mycelium ofFlammulinavelutipesNJ 9601[J].EdibleFungiofChina， 1997， 16(3): 30-33. (in Chinese with English abstract)

(責(zé)任編輯張 韻)

OptimizationofSe-richliquidfermentationconditionsandantioxidantactivityofpolysaccharidefromAuriculariaauriculamycelia

CHAI Xinyi， NI Zanpeng， YU Shijun， ZHANG Weiwei， YIN Peifeng

(SchoolofBiologyandFoodEngineering，ChuzhouUniversity，Chuzhou239000，China)

The specific objectives of the study were to determine the optimal culture conditions of Se-accumulation and antioxidant activity of polysaccharide fromAuriculariaauriculamycelia in order to provide some references for liquid fermentation ofAuriculariaauriculaand industrialization of its polysaccharide production. The single factor and orthogonal experiment was used to get the optimal culture conditions ofAuriculariaauriculaby Se-accumulation of mycelia. The free radical scavenging activity of DPPH (1，1-phenyl-2-hydrazide) was used as the index to study the antioxidant activity of polysaccharide fromAuriculariaauriculamycelia. The results showed that the optimal culture conditions were as follows: glucose 20 g·L-1， yeast extract 2.5 g·L-1， selenium concentration 7.5 μg·mL-1， pH 6.5，temperature 28 ℃， rotational speed 140 r·min-1， and cultivation 5 d. Se-accumulation under the optimal culture conditions was 853.16 μg·g-1，which was 66% higher than that of the original conditions. The antioxidant activity of polysaccharide fromAuriculariaauriculamycelia in scavenging DPPH radical was 76.12%. Se-accumulation ofAuriculariaauriculawas obviously improved with the optimal culture conditions.

Auriculariaauricula; liquid fermentation; selenium accumulation; polysaccharide; antioxidant activity

柴新義，倪瓚鵬，于士軍，等. 黑木耳菌絲體液體發(fā)酵富硒條件優(yōu)化及其多糖抗氧化活性[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(11)： 1903-1911.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.11.18

2017-05-10

安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)資助項(xiàng)目(KJ2015A239)

柴新義(1978—)，男，安徽蕭縣人，博士，副教授，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與生物技術(shù)。E-mail: xinyianhui@163.com

S646.6;Q939.97

A

1004-1524(2017)11-1903-09