常麗娟，宋 君，張富麗，劉文娟，唐春燕，王 東，尹 全

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川 成都 610066)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604

常麗娟，宋 君*，張富麗，劉文娟，唐春燕，王 東，尹 全

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川 成都 610066)

轉(zhuǎn)基因玉米MIR604是瑞士先正達(dá)公司2005年研發(fā)的抗蟲玉米，中國(guó)于2008年批準(zhǔn)MIR604進(jìn)口作為食品和飼料的加工原料。為了精確定量檢測(cè)MIR604及其加工產(chǎn)品，在MIR604的左側(cè)邊界序列和玉米基因組之間設(shè)計(jì)引物和探針，成功建立了MIR604品系特異實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。采用該方法設(shè)計(jì)的引物和探針，對(duì)6種非轉(zhuǎn)基因作物、MIR604及其他非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行檢測(cè)，除MIR604外，其余樣品均未檢測(cè)到MIR604分子片段的擴(kuò)增信號(hào)；對(duì)已知含量為1%的MIR604標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量檢測(cè)，測(cè)量值為1.07%，接近真實(shí)值1%；靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法能檢測(cè)到僅5個(gè)拷貝的MIR604分子片段。該試驗(yàn)所建立的MIR604品系特異實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法具有較高的特異性、準(zhǔn)確度及靈敏度，可用于轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的定量檢測(cè)。

轉(zhuǎn)基因玉米MIR604；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；特異性；準(zhǔn)確度；靈敏度

轉(zhuǎn)基因作物在全球快速發(fā)展，據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(ISAAA)發(fā)布的一份報(bào)告，轉(zhuǎn)基因作物的種植面積從1996年的170萬(wàn)hm2上升至2015年的1.797億hm2，種植的轉(zhuǎn)基因品種包括轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花和油菜，其中玉米是獲得商業(yè)種植批準(zhǔn)最多的轉(zhuǎn)基因作物。James等[1]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全球有超過120個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米品種在二十多個(gè)國(guó)家被批準(zhǔn)可作為食品和飼料的加工原料。轉(zhuǎn)基因玉米MIR604是轉(zhuǎn)入蘇云金芽孢桿菌Cry3A基因的抗蟲玉米，由該基因編碼的毒素蛋白由3個(gè)不連續(xù)的結(jié)構(gòu)域組成，對(duì)鞘翅目昆蟲具有特異毒性[2]。自2007年起，MIR604先后在美國(guó)、菲律賓、俄羅斯、韓國(guó)和日本等多個(gè)國(guó)家被批準(zhǔn)可進(jìn)口作為食品和飼料的加工原料。我國(guó)于2008年批準(zhǔn)MIR604進(jìn)口作為食品和飼料的加工原料。MIR604進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)后，按照我國(guó)轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)管理辦法規(guī)定，MIR604及其加工產(chǎn)品必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)。目前，我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全檢測(cè)體系中只有MIR604及其加工產(chǎn)品的定性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[3]，尚無相關(guān)的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)際上歐盟曾經(jīng)發(fā)布過基于TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[4]，但國(guó)內(nèi)尚未對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確證。為了精確定量MIR604，本試驗(yàn)建立了MIR604品系特異實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，為我國(guó)轉(zhuǎn)基因玉米安全監(jiān)管提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)所用的含量為1%和10%的MIR604標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Certified Reference Material，CRM)及其他轉(zhuǎn)基因作物粉末材料均購(gòu)自歐盟聯(lián)合研究中心測(cè)量與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究所(IRRM，Institute for Reference Materials and Measurements，Joint Research Centre (JRC)，Belgium)；實(shí)驗(yàn)所用的非轉(zhuǎn)基因作物材料由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用的植物基因組DNA純化試劑和實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑(Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR) Master Mix)，購(gòu)自TIANGEN?天根生化科技(北京)有限公司。實(shí)驗(yàn)所用的主要儀器有超微量分光光度計(jì)(Nanodrop?1000， Thermo Fisher Scientific Corporation)和實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)(Real Time PCR System 7500， Applied Biosystem Corporation， USA)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的分離與純化

按照植物基因組DNA純化試劑盒(TIANGEN?，天根生化科技(北京)有限公司)說明書分離、純化基因組DNA。

1.2.2 引物和探針設(shè)計(jì)

玉米內(nèi)標(biāo)基因zSSⅡb采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB19495.4—2004中的引物和探針序列[5]，通過查詢MIR604的載體和旁側(cè)序列信息(http://www.shgmo.org/welcome.htm)，應(yīng)用 Primer Express 3.0 在左側(cè)邊界序列和玉米基因組連接處設(shè)計(jì)定量 PCR引物和探針，所有引物與探針均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 反應(yīng)體系及條件

將DNA稀釋到50 ng·μL-1，取4 μL DNA加入到20 μL反應(yīng)體系：TaqMan Master mix(2×)10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，探針(10 μmol·L-1)0.5 μL，補(bǔ)水至20 μL。運(yùn)行如下程序：95 ℃預(yù)變性10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，45個(gè)循環(huán)。

1.2.4 方法的特異性、準(zhǔn)確度和靈敏度

采用本方法對(duì)非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜以及15個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米59122、DAS-40278-9、3272、Mon863、Mon810、Mon88017、Bt11、Bt176、NK603、TC1507、T25、GA21、MIR162、MIR604、98140，5個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1、科豐2號(hào)、科豐6號(hào)、克螟稻5、M12，5個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、Mon87701、Mon87708、A5547-127、A2704-12，5個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花Mon1445、Mon15985、Mon531、LLcotton25、GHB614，6個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜GT73、MS1、MS8、RF1、RF2、RF3和1個(gè)轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1進(jìn)行了特異性檢測(cè)，確定本方法的特異性。

分別提取1%和10%的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604基因組DNA，將10% MIR604基因組DNA按照1∶5梯度稀釋成42.00、8.40、1.68、0.34、0.07 ng 5個(gè)梯度作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，以1%MIR604基因組DNA為檢測(cè)樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)樣品重復(fù)10次擴(kuò)增反應(yīng)，計(jì)算1%MIR604標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測(cè)量值。

將轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的基因組DNA按照1∶2梯度稀釋成0.184、0.092、0.046、0.023、0.012 ng 5個(gè)梯度，每個(gè)梯度重復(fù)8次擴(kuò)增反應(yīng)。根據(jù)玉米基因組大小，計(jì)算出每個(gè)梯度反應(yīng)體系中MIR604分子片段的拷貝數(shù)(copies)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2007和SPSS 13.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針設(shè)計(jì)

轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的T-DNA插入序列(圖1)含有2個(gè)外源基因表達(dá)盒(gene expression cassette)，一個(gè)是包含MTL啟動(dòng)子、Cry3A編碼基因和tNOS終止子的基因表達(dá)盒，另一個(gè)是包含ZmUbiInt 啟動(dòng)子、pmi編碼基因和tNOS終止子的基因表達(dá)盒。應(yīng)用 Primer Express 3.0 在左側(cè)邊界序列和玉米基因組連接處設(shè)計(jì)定量 PCR引物和探針(表1)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為124 bp。

箭頭代表引物與探針的設(shè)計(jì)位置和方向The arrows show the location and orientation of primers and probes圖1 MIR604 外源載體結(jié)構(gòu)示意圖(A)和MIR6043′端旁側(cè)序列(B)Fig.1 Schematic diagrams of the inserted T-DNA region of gene construct for genetically modified maize MIR604 (A) and the sequences flanking the 3′ of the T-DNA in genetically modified maize MIR604 (B)

表1轉(zhuǎn)基因玉米MIR604定量檢測(cè)的引物和探針

Table1The primers and probes used for the quantitative detection of genetically modified maize MIR604

基因名稱Genename引物和探針序列Sequenceofprimersandprobes擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度Lengthofamplificationproducts/bp內(nèi)源基因zSSⅡbEndogenousgenezSSⅡbzSSⅡb-F:5'-CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3'zSSⅡb-R:5'-TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG-3'zSSⅡb-P:5'-FAM-AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA-TAM-RA-3'151MIR604分子片段MolecularfragmentofMIR604Eve-F:5’-GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3’Eve-R:5’-CGACGCTTGCGCGAG-3’Eve-P:5’-FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMARA-3’124

2.2 方法的特異性

采用本方法設(shè)計(jì)的引物和探針對(duì)6種非轉(zhuǎn)基因作物、MIR604及其他非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行檢測(cè)，只有MIR604檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)(圖2)，其他非轉(zhuǎn)基因作物和非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因作物均未檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)，顯示本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法具有很高的特異性。

2.3 方法的準(zhǔn)確度

將10%的MIR604標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DNA等比稀釋建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，玉米內(nèi)源基因zSSⅡb的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.45X+31.97，相關(guān)系數(shù)R2為0.998，擴(kuò)增效率為95.00%；MIR604分子片段的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.31X+33.76(圖3)，相關(guān)系數(shù)R2為0.996，擴(kuò)增效率為100.10%。采用本方法對(duì)已知濃度為1%的MIR604標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)，測(cè)試樣品平均相對(duì)含量為1.07%(表2)，測(cè)量值與真實(shí)值的相對(duì)偏差為7%，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度[6]。

S型曲線為轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的擴(kuò)增曲線；水平直線為非轉(zhuǎn)基因作物及其他非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因作物的擴(kuò)增曲線The S-liked curve presented the amplification of genetically modified maize MIR604 and the horizontal straight line indicated the amplification of non-genetically modified crops and other non-target transgenic crops圖2 轉(zhuǎn)基因玉米MIR604擴(kuò)增的特異性Fig.2 The specialty of amplification of genetically modified maize MIR604

表2檢測(cè)樣品(1%，CRM)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604結(jié)構(gòu)特異片段定量檢測(cè)結(jié)果

Table2Quantitative detection result of event-specific fragment of genetically modified maize MIR604

分子片段MolecularfragmentCt值平均值MeanofCtvalueCt值標(biāo)準(zhǔn)偏差SDCt值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD/%絕對(duì)含量平均值Meanofabsolutecontent絕對(duì)含量標(biāo)準(zhǔn)偏差SD絕對(duì)含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD/%測(cè)量值Measuredvalues/%偏差Biase/%MIR604分子片段MolecularfragmentofMIR60431.9840.0470.1473.4580.1133.2681.077內(nèi)源基因zSSⅡbEndogenousgenezSSⅡb23.3280.1200.514321.44225.0407.790

A， MIR604品系特異性定量PCR擴(kuò)增曲線；B， 玉米內(nèi)源基因zSSIIb定量PCR擴(kuò)增曲線；C， MIR604品系特異性定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；D， 玉米內(nèi)源基因zSSIIb定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

A， The amplification curve for the MIR604 event-specific assay; B， The amplification curve for thezSSIIb; C， The standard curve for the MIR604 event-specific assay; D， The standard curve for thezSSIIb gene assay.

圖3 品系特異性定量PCR方法的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The amplification and standard curves for the event-specific quantitative PCR method

2.4 方法的靈敏度

為了確認(rèn)方法的靈敏度，分別以不同拷貝數(shù)的DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增，8次重復(fù)都有擴(kuò)增信號(hào)的最低外源片段分子拷貝數(shù)為本方法的檢測(cè)下限。結(jié)果(表3)表明，本方法最低能檢測(cè)到0.012 ng的MIR604分子片段，平均Ct值為39.356。經(jīng)計(jì)算檢測(cè)下限約為5個(gè)拷貝的MIR604核酸分子片段。

表3轉(zhuǎn)基因玉米MIR604結(jié)構(gòu)特異片段靈敏度檢測(cè)結(jié)果

Table3The sensitive detection result of event-specific fragment of genetically modified maize MIR604

DNA的量AmountofDNA/ng外源片段分子拷貝數(shù)CopiesofexogenousmolecularfragmentsCt值平均值MeanofCtvalue標(biāo)準(zhǔn)偏差SD相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD/%0.1848034.9610.2100.6010.0924036.0970.3070.8500.0462037.2280.3440.9240.0231038.4220.4011.0440.012539.3560.2250.572

3 討論

以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)不同，可分為篩查法、基因特異性方法、結(jié)構(gòu)特異性方法和品系特異性方法。品系特異性方法引物設(shè)計(jì)通常在外源載體和受體植物基因組分別設(shè)計(jì)上下游引物，可以區(qū)分相同轉(zhuǎn)化載體的不同轉(zhuǎn)化事件，同時(shí)鑒定出外源載體結(jié)構(gòu)和受體植物品種，因此品系特異性方法應(yīng)用廣泛。常見的轉(zhuǎn)基因水稻品種TT51-1、科豐6號(hào)[7-8]，轉(zhuǎn)基因玉米品種NK603、MON863、98140、MIR612[9-12]，轉(zhuǎn)基因油菜品種GT73[13]等都已研發(fā)了相應(yīng)的品系特異性方法。轉(zhuǎn)基因玉米MIR604投放市場(chǎng)后，歐盟、日本和韓國(guó)先后建立了本國(guó)MIR604實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，并且歐盟在此基礎(chǔ)上建立起了MIR604熒光定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。日本和韓國(guó)科學(xué)家[14-15]建立了MIR604品系特異熒光定量檢測(cè)方法，準(zhǔn)確度方面日本科學(xué)家不同濃度的MIR604定量檢測(cè)結(jié)果偏差在20%～40%，韓國(guó)科學(xué)家檢測(cè)結(jié)果偏差在0～9%。靈敏度方面日本科學(xué)家建立方法的檢測(cè)下限為0.5%，韓國(guó)科學(xué)家建立方法的檢測(cè)下限為0.1%。目前，我國(guó)尚無MIR604的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)建立的MIR604品系特異性定量檢測(cè)方法在左側(cè)邊界序列和玉米基因組連接處設(shè)計(jì)定量 PCR引物和探針，對(duì)6類非轉(zhuǎn)基因作物和常見非目標(biāo)轉(zhuǎn)基因作物均無非特異擴(kuò)增，具有較好的特異性。采用該方法所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率在-3.6～-3.1，擴(kuò)增效率在90%～110%，相關(guān)系數(shù)大于0.99，待檢樣品的定量檢測(cè)結(jié)果為1.07%，檢測(cè)結(jié)果的偏差為7%，符合歐盟熒光定量準(zhǔn)確度相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[16]。參照我國(guó)農(nóng)業(yè)部行業(yè)現(xiàn)有定量標(biāo)準(zhǔn)[17]，將檢測(cè)下限換算為外源片段的拷貝數(shù)，本方法最低能檢測(cè)到含量為5個(gè)拷貝的MIR604分子片段，具有較好的靈敏度。因此，本試驗(yàn)所建立的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604品系特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法可以在檢測(cè)工作中推廣應(yīng)用。

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(責(zé)任編輯張 韻)

Areal-timefluorescentquantitativePCRfordetectionofgeneticallymodifiedmaizelineMIR604

CHANG Lijuan， SONG Jun*， ZHANG Fuli， LIU Wenjuan， TANG Chunyan， WANG Dong， YIN Quan

(AnalysisandTestCenter，SichuanAcademyofAgriculturalSciences，Chengdu610066，China)

Genetically modified maize MIR604 is an insect resistant maize line developed by Syngenta in 2005， which was approved as a raw material for food and feed processing in 2008 in China. In order to accurately detect MIR604 and its processing products， event-specific quantitative PCR detection method was established in this study. The PCR primers and probes were designed specially according to the left boundary sequence of MIR604 and maize genome sequence. Finally， we used the method to detect 6 kinds of non-genetically modified crops， MIR604 and other non-target transgenic crops. The results showed that the other samples apart from MIR604 were not detected. The measured value of the sample(CRM) containing 1% MIR604 was 1.07%， which was close to the real value (1%). The sensitivity experiment results indicated the method could detect only 5 copies of MIR604 molecular fragments. Thus， the event-specific quantitative PCR detection method of genetically modified maize MIR604 has high specificity， accuracy and sensitivity， which can be used for quantitative detection of genetically modified maize MIR604.

genetically modified maize MIR604; real-time fluorescent quantitative PCR; specificity; accuracy; sensitivity

常麗娟，宋君，張富麗，等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(11)： 1769-1774.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.11.01

2017-04-07

四川省質(zhì)監(jiān)局標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)體系(ZYBZ2013-39)

常麗娟(1982—)，女，四川巴中人，碩士，助理研究員，從事轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管研究。E-mail: juanjuanclj@126.com

*通信作者，宋君，E-mail: drsjn@126.com

S513

A

1004-1524(2017)11-1769-06