孫雅楠，李斯，房輝，張谷月

（河北省唐山市工人醫(yī)院 1.內分泌二科，2.心內四科，河北 唐山 063000)

MicroRNA-9-3p在2型糖尿病合并不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿中的表達分析

孫雅楠1，李斯2，房輝1，張谷月1

（河北省唐山市工人醫(yī)院 1.內分泌二科，2.心內四科，河北 唐山 063000)

目的檢測microRNA-9-3p（miR-9-3p）在2型糖尿?。═2DM）患者以及T2DM合并不穩(wěn)定型心絞（T2DM+UA）痛患者血漿中的表達水平，分析miR-9-3p對于T2DM以及T2DM+UA的診斷價值。方法選取2012年1月-2013年6月唐山市工人醫(yī)院就診的單純T2DM患者50例為T2DM組，T2DM+UA患者50例為T2DM+UA組，健康體檢人員30例為對照組。抽取患者外周靜脈血，提取microRAN（miRNA），應用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR），以miR-423-5p為內參，檢測3組血漿中miR-9-3p表達水平，應用受試者工作曲線（ROC）統(tǒng)計分析其對于T2DM以及T2DM+UA的診斷價值。結果3組血漿miR-9-3p表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），T2DM組及T2DM+UA組均高于對照組，T2DM+UA組高于T2DM組；miR-9-3p對于T2DM的診斷價值AUC=0.723（95%CI：0.610，0.837，P＜0.05），miR-9-3p對于T2DM+UA的診斷價值AUC=0.972（95%CI：0.963，0.981，P＜0.05）。結論miR-9-3p在T2DM以及T2DM+UA患者血漿表達水平升高，miR-9-3p有望作為T2DM以及T2DM+UA早期診斷的分子標志物。

microRNA-9-3p；2型糖尿??；2型糖尿病合并不穩(wěn)定型心絞痛；實時熒光定量聚合酶鏈反應

小分子核糖核酸（microRAN，miRNA）是一類長度約為20～24個核苷酸長度的非編碼單鏈小RNA分子，由DNA轉錄生成，并具有較高的穩(wěn)定性。研究顯示，人類機體于高糖狀態(tài)下繼發(fā)不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina pectoris，UA）時，血漿miRNA表達水平會進一步發(fā)生變化，其中miR-1、miR-28-5p、miR-133a、miR-223表達均被顯著上調，這種變化不僅與高糖狀態(tài)的產生有關也與不穩(wěn)定型心絞痛的發(fā)生相關[1-4]。目前國內外關于2型糖尿病（type 2 diabetes meuitus，T2DM）合并不穩(wěn)定型心絞痛患者（T2DM+UA）血漿中miR-9-3p表達水平的研究鮮有報道。本實驗檢測miR-9-3p在T2DM患者以及T2DM+UA患者的血漿表達水平，旨在探討miR-9-3p水平作為T2DM心血管并發(fā)癥臨床診療中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本實驗選取2012年1月-2013年6月唐山工人醫(yī)院就診的單純T2DM患者50例為T2DM組，其中，男性22例，女性28例。納入標準：符合1999年WHO的T2DM診斷標準。排除標準：①1型糖尿病患者，包括LADA；②C肽缺乏或陰性的患者；③血壓≥180/110 mmHg；④肝功能異常：ALT≥實驗室正常值范圍上限的2.5倍；⑤腎功能不全:血清肌酐≥1.5 mg/dl；⑥2型糖尿病大血管并發(fā)癥患者及近期出現(xiàn)急性糖尿病并發(fā)癥的患者；⑦近期有手術、外傷、感染及其他應激狀態(tài)的患者；⑧有嚴重的系統(tǒng)性疾病,如心血管、消化、呼吸、神經(jīng)等以及惡性腫瘤病史；⑨目前妊娠、哺乳期的患者，以及甲狀腺疾病患者。選取同期T2DM+UA患者50例為T2DM+UA組，其中，男性26例，女性24例。納入標準：確診T2DM患者，參照2011《ACC/AHAUA/非ST段抬高心肌梗死指南》及加拿大心絞痛分級3/4級標準，且必須具有以下至少1個特征：①1個月內原有心絞痛加重或發(fā)作頻繁（發(fā)作頻率增加，時間延長，程度加重）；②病程在1個月以內新發(fā)生的心絞痛（從無心絞痛，或有心絞痛病史但在半年內未發(fā)生心絞痛）；③靜息型心絞痛：心絞痛發(fā)生在休息或安靜狀態(tài)；④發(fā)作持續(xù)時間相對較長，含硝酸酸甘油效果欠佳，病程在1個月內。并且冠狀動脈造影顯示至少1支冠狀動脈血管直徑狹窄≥50%。排除標準：①先天性心臟病、心臟瓣膜病患者、嚴重充血性心力衰竭（NYAH分類IV級）或心源性休克；②伴有腎臟疾病、肝臟疾病、免疫性疾病、惡性腫瘤、血栓性疾病、嚴重貧血和出血性疾病等；③伴有各種急慢性炎癥及創(chuàng)傷等情況；④血壓≥180/110 mmHg者。另選同期年齡性別與之相匹配的唐山工人醫(yī)院健康體檢人員30例為對照組，其中男性15例，女性15例。本研究由唐山工人醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集 所有研究對象禁食12 h，清晨空腹肘靜脈采血6 ml分別置于EDTA抗凝的采血管3 ml，普通生化管3 ml，EDTA抗凝的采血管采用4℃、3 000 r/min 離心20 min，分離血漿及血細胞分別置于1.5 ml無酶EP管內，進一步將血漿EP管于4℃、3 000 r/min離心10 min，輕輕吸取上層血漿置于1.5 ml無酶EP管內，放入-80℃低溫冰箱凍存。普通生化管靜脈血應用日立全自動7600生化儀器檢驗空腹靜脈血糖（fasting blood-glucose，F(xiàn)PG）、三酰甘油（Triglyceride，TG）、膽固醇（Cholesterol，CHO）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）；應用日本愛科萊HA8180型儀器測量糖化血紅蛋白（Hemoglobin A1C，HbA1c）含量。

1.2.2 血漿總RNA的提取 使用miRVana Paris Kit試劑盒（購自美國Ambion公司）提取血漿總RNA，按照說明書操作，置于-80℃冰箱冷凍保存。

1.2.3 cDNA的合成 應用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）（Taqman探針法）配置RT-PCR反應體系，總反應體系共 8μl，10×buffer 0.8μl、dNTP 0.2μl、inhibition 0.1μl、RNA 4.5μl、RNase-free H2O 0.4μl、RNA Primer 1.5μl、RTase 0.5μl，全過程需在冰浴上操作。反應條件為：16℃孵育60 min，42℃孵育60 min，85℃孵育 5 min，4℃ Forever。

1.2.4 qRT-PCR 配置Realtime PCR 反應體系：2×TaqMAN universal PCR Master Mix（購自美國Ambion公司）10μl、cDNA 4μl、RNase-free H2O 5μl、Taq MAN probe（購自美國Ambion公司）1μl，總反應體系共20μl；反應條件為：95℃ 10 min起始模板預變性，95℃ 15 s模板變性，60℃ 60 s退火循環(huán)40次；每個樣本均做副管，重復3次，取平均值，所得數(shù)據(jù)經(jīng)2-△△CT轉換后進行統(tǒng)計學分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0以及GraphPAD Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析及作圖。計數(shù)資料使用例（%）表示，數(shù)據(jù)3組間比較采用χ2檢驗，計量資料符合正態(tài)分布的使用均數(shù)±標準差（±s）表示，數(shù)據(jù)3組間比較采用單因素方差分析，應用ROC曲線分析計算出曲線下面積和95%可信區(qū)間。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組基本特征比較

T2DM組、T2DM+UA組和對照組平均年齡分別為（54±7）歲、（57±8）歲和（55±6）歲。3組間性別、年齡、BMI、TC、TG、LDL-C、HDL-C比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3組間FPG、HbA1c差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 3組血漿miR-9-3p的表達水平比較

血漿miR-9-3p對照組的表達水平為1，T2DM組為（8.89±5.12），T2DM+UA 組 為（25.22±2.21），3組間血漿miR-9-3p的表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。T2DM組及T2DM+UA組均高于對照組，T2DM+UA組高于T2DM組。見表2、圖1。

2.3 miR-9-3p對于T2DM組以及T2DM+UA組的診斷價值

以健康體檢人群為對照組，miR-9-3p對于T2DM組的診斷價值，曲線下面積=0.723，說明miR-9-3p對于T2DM組診斷有一定準確性（95%CI：0.610，0.837，P＜0.05）（見圖 2）。以健康體檢人群為對照組，miR-9-3p對于T2DM+UA組的診斷價值，AUC=0.972，說明miR-9-3p對于T2DM +UA診斷具有較高準確性（95%CI：0.963，0.981，P＜0.05）。見圖 2。

表1 研究對象基本特征

表2 3組血漿miR-9-3p表達水平比較 （±s）

表2 3組血漿miR-9-3p表達水平比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與T2DM組比較，P ＜0.05

miR-9-3p F值 P值對照組（n =30） 1 31.753 0.000組別T2DM 組（n =50） 8.89±5.121）T2DM+UA 組（n =50） 25.22±2.211）2）

圖1 3組血漿miR-9-3p表達水平比較

圖2 血漿miR-9-3p對于T2DM組以及T2DM+UA組的診斷價值

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦荰2DM患者最主要的大血管并發(fā)癥，T2DM+UA是冠心病的嚴重類型之一，近年來研究表明，T2DM患者心血管并發(fā)癥死亡率高達65%，T2DM+UA患者的冠狀動脈病變更加嚴重，表現(xiàn)為多支血管受累，冠狀動脈狹窄程度高[5]，對患者生命造成巨大的威脅。

miRNA廣泛存在于真核生物中， 是一組不編碼蛋白質的短序列RNA，miRNA具有較高的穩(wěn)定性，即使在反復凍融（4～80℃）、PH改變以及DNA和RNA裂解酶等極端條件下也不易降解，能夠穩(wěn)定的存在于細胞及循環(huán)系統(tǒng)中[6]，并且同一個體在相同狀態(tài)下血漿miRNA表達譜大致相同，在疾病狀態(tài)下，miRNA會選擇性地從組織細胞釋放到外周血中發(fā)揮作用[7]或通過血液傳遞到受體細胞發(fā)揮作用，這就使得血漿中miRNA的表達水平發(fā)生變化，且血漿中miRNA的變化要早于蛋白類標記物[8]，以上特點使血漿miRNA具有成為一種全新疾病檢測標記物的潛能。

miR-9-3p是miRNA家族成員之一，其基因定位于人15號染色體，研究證實胰島細胞中miR-9-3p能夠調節(jié)胰島素分泌[9-11]抑制炎癥因子的表達[12]，血漿中miR-9-3p的表達還參與膽固醇代謝及心肌細胞血管新生并調節(jié)心肌的生物學功能[13-15]，以上功能研究證實miR-9-3p不僅能夠調節(jié)機體血糖水平，在T2DM心血管并發(fā)癥的病理進程中也可能起著重要的作用。

近年來對于miR-9-3p調節(jié)胰島素分泌、調節(jié)血糖水平方面的研究顯示，抑制人胰島細胞中miR-9-3p表達水平，能夠抑制胰島細胞高糖刺激的胰島素分泌[16]。肥胖小鼠肝臟細胞超表達miR-9-3P能夠增加肝臟胰島素敏感性，抑制miR-9-3p表達能夠升高小鼠的隨機血糖以及空腹血糖水平[11]。這些研究結果表明胰島β細胞及肝臟細胞中miR-9-3p表達水平的變化具有調節(jié)胰島素分泌、調節(jié)胰島素敏感性的功能。本研究結果顯示T2DM組患者血漿miR-9-3p表達水平高于對照組。文獻報道顯示[17]，新發(fā)T2DM患者血漿中miR-9-3p表達水平升高，新發(fā)T2DM患者外周血單個核細胞中miR-9-3p水平上調[18]。本實驗研究結果與目前國內外研究報道保持一致，具有較高的可靠性，提示血漿中miR-9-3p水平表達升高可能是T2DM發(fā)病的原因之一，其具體機制有待于進一步研究。

近年來miR-9-3p對高糖環(huán)境下心血管細胞功能調節(jié)方面的研究顯示，高糖環(huán)境下培養(yǎng)的心肌細胞miR-9-3P表達水平上升，并且能夠抑制心肌細胞的炎癥反應，降低心肌細胞凋亡[19]。當心肌成纖維細胞培養(yǎng)于高糖環(huán)境下，抑制細胞中miR-9-3p表達水平能夠抑制細胞纖維化[20]。本研究結果顯示T2DM+UA組血漿miR-9-3p的表達水平高于對照組，T2DM+UA組血漿miR-9-3p的表達水平高于T2DM組。本研究結果證實，在T2DM共同的基礎狀態(tài)下血漿miR-9-3p表達量的升高反映了T2DM繼發(fā)UA概率升高，提示其可能參與了冠狀動脈粥樣硬化病理改變過程。

本研究通過ROC曲線判斷miR-9-3p對于T2DM以及T2DM+UA的診斷價值，結果表明：血漿miR-9-3p水平對于T2DM診斷價值有一定準確性，血漿miR-9-3p水平的升高能夠特異性反映T2DM+UA的發(fā)生，其水平變化與T2DM心血管并發(fā)癥密切相關。

目前冠狀動脈造影檢查是一種有創(chuàng)的診斷技術，是診斷不穩(wěn)定型心絞痛的“金標準”廣泛應用于臨床，但其屬于侵入性檢查，具有創(chuàng)傷大、費用高、臨床并發(fā)癥較多的缺點常造成患者的依從率較低。目前，血漿miRNA在糖尿病、心血管疾病的診斷、鑒別診斷、治療與預后判斷領域具有潛在的應用價值，miRNA的檢測手段簡單，費用較低，對患者的創(chuàng)傷性小，無臨床并發(fā)癥，為疾病的詮釋提供了嶄新的研究思路和技術途徑。本研究結果提示，血漿miR-9-3p有望成為T2DM以及T2DM+UA診斷的潛在分子標記物，但miR-9-3p能否應用于T2DM心血管并發(fā)癥的臨床篩查，仍有待臨床擴大樣本含量進一步研究。

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（張蕾 編輯）

Clinical significance of plasma miR-9-3p in patients of type 2 diabetes with unstable angina

Ya-nan Sun1, Si Li2, Hui Fang1, Gu-yue Zhang1
(1. The Second Department of Endocrinology, 2. The Forth Department of Cardiology, Tangshan Gongren Hospital, Tangshan, Hebei 063000, China)

ObjectiveTo investigate the differential expression of miR-9-3p in plasma of type 2 diabetes mellitus (T2DM) patients and T2DM with unstable angina (UA) patients, and furnish evidence for novel diagnostic tool for T2DM with unstable angina.MethodsA total of 100 T2DM patients (50 subjects with UA and 50 patients without UA) and 30 healthy volunteers were enrolled from Tangshan Gongren Hospital between January 2012 and June 2013. Total RNA was isolated from plasma using mirVana Paris kit according to manufacture’s instruction.The plasma level of miR-9-3p was determined by qRT-PCR using miR-423-5p as internal control. The receiver operating curve (ROC) was used to evaluate its value in diagnosis of T2DM and T2DM with UA.ResultsThe plasma levels of miR-9-3p in the T2DM group and the T2DM with UA group were significantly increased compared with the control group (P＜ 0.05). Compared with the T2DM group, the plasma level of miR-9-3p in the T2DM with UA was significantly elevated (P＜ 0.05). The ROC curves indicated that miR-9-3p had an acceptable value in the diagnosis of T2DM (AUC = 0.723; 95% CI： 0.610, 0.837;P＜ 0.05) and a high value in the diagnosis of T2DM with UA (AUC = 0.972; 95% CI： 0.963, 0.981;P＜ 0.05).ConclusionsPlasma level of miR-9-3p is elevated in T2DM patients and T2DM with UA patients. Therefore, plasma miR-9-3p may be used as a potential biomarker for early diagnosis of T2DM and T2DM with UA.

microRNA-9-3p; type 2 diabetes mellitus; type 2 diabetes with unstable angina; real-time PCR

R587.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.28.017

1005-8982（2017）28-0086-05

2016-11-09

房輝，E-mail：281389103@qq.com；Tel:15031596866