穆曉紅，高 健，劉銅華，秦靈靈，孫 文，吳麗麗，李偉笠，鄧博文，李筱葉

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京100700;2.對(duì)外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué)，北京100023;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029)

糖痹康對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)PERK-Nrf2信號(hào)通路的影響*

穆曉紅1，高 健2，劉銅華3，秦靈靈3，孫 文3，吳麗麗3，李偉笠3，鄧博文3，李筱葉3

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京100700;2.對(duì)外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué)，北京100023;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029)

目的:觀察糖痹康對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中PERKNrf2信號(hào)通路的影響。方法:將雄性SD大鼠采用STZ法造模，成功后隨機(jī)分為模型對(duì)照組，彌可保組，糖痹康高、中、低劑量組，另選正常SD大鼠為正常對(duì)照組。彌可保組腹腔注射彌可保0.026 8g/(kg·d);糖痹康高、中、低劑量組依次灌胃糖痹康16.700，8.350，4.175 g/(kg·d)。所有藥物均以9 g/L生理鹽水配制，給藥量為0.01 mL/g體質(zhì)量。模型對(duì)照組和正常對(duì)照組均予等量的生理鹽水灌胃，1 d 1次，連續(xù)16周。剖取大鼠坐骨神經(jīng)，Western blot檢測(cè)坐骨神經(jīng)中磷酸化的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2);Real-time PCR檢測(cè)坐骨神經(jīng)中血紅素加氧酶-1(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)mRNA 表達(dá)。結(jié)果:與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠坐骨神經(jīng)PERK、Nrf2蛋白表達(dá)顯著降低，HO-1、γ-GCS mRNA表達(dá)顯著降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，彌可保組和糖痹康高、中、低劑量組大鼠坐骨神經(jīng)PERK、Nrf2蛋白表達(dá)顯著升高，HO-1、γ-GCS mRNA表達(dá)顯著升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論:糖痹康通過上調(diào)PERK-Nrf2信號(hào)通路表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用，延緩糖尿病周圍神經(jīng)病變進(jìn)展。

糖痹康/藥效學(xué);糖尿病周圍神經(jīng)病變;磷酸化的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(p-PERK);轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2);血紅素加氧酶-1(HO-1);γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS);動(dòng)物;大鼠

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病患者常見并發(fā)癥，常導(dǎo)致感覺神經(jīng)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷，出現(xiàn)肢體麻木、疼痛、肌肉無力及萎縮等癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)病變與氧化應(yīng)激關(guān)系密切［1-3］，其中磷酸化的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)—轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)信號(hào)通路對(duì)高糖環(huán)境下活性氧的產(chǎn)生有抑制作用，能夠改善抗氧化應(yīng)激損傷［4］，在DPN的防治中發(fā)揮重要作用。血紅素加氧酶-1(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是PERK-Nrf2信號(hào)通路調(diào)節(jié)的抗氧化蛋白，同樣參與抗氧化應(yīng)激作用［5］。糖痹康由黃芪、女貞子、桂枝、赤芍、黃芩、黃連、水蛭等組成，是在《金匱要略》黃芪桂枝五物湯基礎(chǔ)上根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)加減化裁而成，已獲發(fā)明專利(專利申請(qǐng)?zhí)?200810167551.1)。前期研究［6-8］發(fā)現(xiàn):糖痹康能夠改善DPN大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度、調(diào)節(jié)大鼠血清及坐骨神經(jīng)中神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)含量和表達(dá)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。本研究建立DPN大鼠模型并以糖痹康進(jìn)行干預(yù)，研究PERK-Nrf2及其下游基因 HO-1、γ-GCS的表達(dá)，以探討糖痹康對(duì)DPN的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級(jí)雄性健康SD大鼠80只，6～7周齡，體質(zhì)量180～230 g，購自北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2006-0009。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度(23±2)℃、濕度(55±10)%，12/12 h光照、黑暗循環(huán)，自由攝食、飲水。

1.2 藥品、試劑與儀器

糖痹康顆粒處方組成:黃芪、女貞子、桂枝、赤芍、黃芩、黃連、水蛭等，顆粒劑由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提取、制備;彌可保(a-硫辛酸)，購自衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號(hào)141003;鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)S0130;高脂飼料(基礎(chǔ)飼料65.75%、蔗糖20%、豬油10%、蛋黃粉3%、膽固醇1%、豬膽鹽0.25%)，北京科奧協(xié)力飼料有限公司產(chǎn)品;Trizol試劑盒，購自Life Technologies公司，批號(hào)98903;I抗 Nrf2 Rabbit mAb(貨號(hào) 12721)、Phospho-PERK Rabbit mAb(貨號(hào)3179)、Ⅱ抗Anti-rabbit IgG(H+L)(貨號(hào)14708)，均為 CST公司產(chǎn)品;THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix，日本 TOYOBO 公司產(chǎn)品，貨號(hào)QPS-201;ECL發(fā)光液，購自美國BIORAD公司，批號(hào)170-5060。E9032型酶標(biāo)儀，美國Promega公司產(chǎn)品;Prism 7 500型PCR擴(kuò)增儀，美國ABI公司產(chǎn)品;BX53型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品;Mini-PROTEAN Tera System型垂直電泳儀、轉(zhuǎn)移槽，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;ChemiDocTM XRS+with Image LabTM Software凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 模型的建立、分組與給藥

將雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按體質(zhì)量隨機(jī)取10只作為正常對(duì)照組，以普通飼料喂養(yǎng);其余大鼠以高脂飼料喂養(yǎng)8周后，禁食不禁水過夜，次日腹腔注射STZ 45 μg/g造模，72 h后用血糖儀測(cè)尾尖血血糖，血糖水平持續(xù)≥16.7 mmol/L且穩(wěn)定3 d者為造模成功［7］。將造模成功的大鼠按體質(zhì)量、血糖隨機(jī)分為模型對(duì)照組，彌可保組，糖痹康高、中、低劑量組5組，每組10只。各組大鼠按體表面積法換算給藥劑量:彌可保組腹腔注射彌可保0.026 8 g/(kg·d);糖痹康高、中、低劑量組依次灌胃糖痹康16.700 0，8.350 0，4.175 0 g/(kg·d)。所有藥物均以 9 g/L生理鹽水配制，給藥量為0.01 mL/g體質(zhì)量，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組均予等量的生理鹽水灌胃，1 d 1次，連續(xù)16周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

連續(xù)給藥16周后，禁食不禁水12 h，根據(jù)大鼠體質(zhì)量，按350 μg/g的劑量腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，處死大鼠，迅速剖取大鼠兩側(cè)坐骨神經(jīng)并以液氮凍存，待用。

1.4.1 大鼠坐骨神經(jīng)中PERK、Nrf2蛋白表達(dá)

以Western blot測(cè)定。取凍存的大鼠坐骨神經(jīng)，按RIPA試劑盒步驟提取總蛋白，加上樣緩沖液，100℃ 5 min 蛋白變性;上樣 20 μg/孔，10%SDSPAGE凝膠跑電泳，100V 2 h;半干法凝膠轉(zhuǎn)膜100 A 1 h;TBS溶液室溫洗膜15 min;Blocking one/Blocking one-P封閉30 min，I抗(1∶1 000稀釋)孵育，4℃ 過夜;洗膜后II抗(1∶10 000稀釋)孵育，室溫1 h;洗膜后，ECL發(fā)光液室溫反應(yīng)1 min，凝膠成像系統(tǒng)成像，以Image J 7.0分析蛋白條帶。

1.4.2 坐骨神經(jīng)中 HO-1、γGCS mRNA 表達(dá)

以Real-time PCR測(cè)定。取凍存的大鼠坐骨神經(jīng)，Trizol提取總RNA;GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒反轉(zhuǎn)錄，退火25℃ 5min，延伸42℃ 1 h，滅活 70℃ 15 min，得到 cDNA。配制20 μL反應(yīng)體系:2 μL cDNA 稀釋液 +10 μL GoTaq反應(yīng)液 +7.2 μL Nuclease-Free Water+0.8μL 引物混合，Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System擴(kuò)增，條件:95℃ 10 min;95℃ 15 s，60℃1 min(共40次循環(huán));95℃ 15s，60℃ 15 s溶解。結(jié)果采用2-△△CT相對(duì)定量法比較各組目標(biāo)mRNA表達(dá)差異。引物見表1。

表1 引物

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠坐骨神經(jīng)PERK、Nrf2蛋白表達(dá)對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠坐骨神經(jīng)PERK、Nrf2蛋白表達(dá)顯著降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，各給藥組PERK、Nrf2蛋白表達(dá)顯著升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2、圖1。

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)PERK、Nrf2蛋白表達(dá)對(duì)比n=10±s

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)PERK、Nrf2蛋白表達(dá)對(duì)比n=10±s

注:與正常對(duì)照組對(duì)比，*P＜0.05;與模型對(duì)照組對(duì)比，#P＜0.05

分組 劑量/(g·kg－1·d －1)PERK/β-actin Nrf2/β-actin正常對(duì)照組 —0.86 ±0.13 0.80 ±0.04模型對(duì)照組 — 0.37±0.06* 0.28±0.11*彌可保組 0.026 8 0.82 ±0.17# 0.78 ±0.07#糖痹康高劑量組 16.700 0 0.94 ±0.10# 0.98 ±0.14#糖痹康中劑量組 8.350 0 0.76 ±0.07# 0.85 ±0.15#糖痹康低劑量組 4.175 0 0.70 ±0.12# 0.80 ±0.10#

圖1 各組大鼠坐骨神經(jīng)PERK、Nrf2蛋白條帶

2.2 各組大鼠坐骨神經(jīng)HO-1、γGCS mRNA表達(dá)對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠坐骨神經(jīng)HO-1、γGCS mRNA表達(dá)顯著降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，各給藥組HO-1、γGCS mRNA表達(dá)顯著升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠坐骨神經(jīng)HO-1、γGCS mRNA表達(dá)對(duì)比n=10，±s

表3 各組大鼠坐骨神經(jīng)HO-1、γGCS mRNA表達(dá)對(duì)比n=10，±s

注:與正常對(duì)照組對(duì)比，*P＜0.05;與模型對(duì)照組對(duì)比，#P＜0.05

分組 劑量/(g·kg－1·d －1) HO-1 γGCS正常對(duì)照組 —0.96 ±0.06 0.98 ±0.02模型對(duì)照組 — 0.66±0.11* 0.72±0.15*彌可保組 0.026 8 1.01 ±0.10# 1.13 ±0.10#糖痹康高劑量組 16.700 0 1.45 ±0.17# 1.25 ±0.10#糖痹康中劑量組 8.350 0 1.17 ±0.13# 1.12 ±0.06#糖痹康低劑量組 4.175 0 1.13 ±0.08# 1.04 ±0.12#

3 討論

氧化應(yīng)激是機(jī)體氧自由基生成和(或)消除能力之間的不平衡，出現(xiàn)活性氧簇(ROS)增加與抗氧化清除減弱，最終導(dǎo)致?lián)p傷組織細(xì)胞、蛋白的過程［9］。研究表明，高糖狀態(tài)下機(jī)體多條旁路代謝途徑激活，引起細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過多ROS，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激發(fā)生［10］。因此，氧化應(yīng)激在在糖尿病發(fā)展中至關(guān)重要。據(jù)糖尿病并發(fā)癥的統(tǒng)一機(jī)制學(xué)說，DPN發(fā)病核心是高糖引起線粒體中ROS生成過多，引發(fā)組織細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致DNA損傷，引起周圍血管、神經(jīng)病變，出現(xiàn)血流變異常，神經(jīng)傳導(dǎo)速度減低以及病理改變等，最終導(dǎo)致 DPN［11］。

PERK作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上跨膜蛋白之一，正常情況下發(fā)生磷酸化而被激活，激活后的PERK能夠激活Nrf2，活化后的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與小Maf蛋白結(jié)合調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，包括 HO-1、γGCS［12－13］。PERKNrf2是重要的抗氧化應(yīng)激通路，在延緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究表明，DPN患者存在氧化應(yīng)激導(dǎo)致體內(nèi)ROS產(chǎn)生過多，各種抗氧化物質(zhì)如 HO-1、γGCS 等降低，抗氧化能力下降［14］。PERK-Nrf2信號(hào)通路激活可降低DPN患者ROS的產(chǎn)生，同時(shí)調(diào)控抗氧化基因HO-1、γGCS的轉(zhuǎn)錄，而HO-1、γGCS能夠啟動(dòng)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)，清除自由基起到保護(hù)細(xì)胞的作用［15－16］。本研究結(jié)果顯示:模型對(duì)照組大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)PERK、Nrf2蛋白表達(dá)與HO-1、γGCS mRNA表達(dá)均較正常大鼠顯著降低，而經(jīng)過糖痹康治療后，此4個(gè)指標(biāo)表達(dá)均顯著升高，表明糖痹康對(duì)PERK-Nrf2信號(hào)通路及其下游分子HO-1、γGCS的表達(dá)具有調(diào)控作用。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DPN屬于“痹癥”“痿證”等范疇，是氣陰兩虛基礎(chǔ)上導(dǎo)致久病入絡(luò)、脈絡(luò)瘀阻、氣血運(yùn)行阻滯的過程，治療上應(yīng)以益氣養(yǎng)陰、化瘀通絡(luò)為法［17］。糖痹康方中黃芪、女貞子益氣養(yǎng)陰，黃芩、黃連清熱解毒，赤芍、水蛭活血化瘀通絡(luò)，桂枝通脈。全方共奏益氣養(yǎng)陰清熱、化瘀通絡(luò)之效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:糖痹康通過調(diào)控調(diào)PERK-Nrf2信號(hào)通路及其下游分子HO-1、γGCS的表達(dá)而抵抗活躍氧化應(yīng)激，從而改善神經(jīng)細(xì)胞功能來狀態(tài)，進(jìn)而起到了神經(jīng)保護(hù)作用。

［1］安春耀，劉德山.晚期糖基化終末產(chǎn)物與糖尿病周圍神經(jīng)病變關(guān)系新進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2017，23(15):3062－3067.

［2］饒瀟瀟，姚廣濤，文小平.中藥干預(yù)糖尿病周圍神經(jīng)病變作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2017，24(4):130－133.

［3］秦保鋒，朱旭瑩，翁偉力，章麗瓊，張紅智，郭詠梅.黃芪桂枝五物湯對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變患者血清谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，31(2):36 －39.

［4］YANG X，YAO W，LIU H，et al.Tangluoning，a traditional Chinese medicine，attenuates in vivo and in vitro diabetic peripheral neuropathy through modulation of PERK/Nrf2 pathway［J］.Sci Rep，2017，7(1):1014.

［5］姚偉潔，楊鑫偉，李情琴，等.糖絡(luò)寧對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠Nrf2/ARE通路的影響［J］.北京中醫(yī)藥，2016，35(3):218 －221，289.

［6］易文明，孫文，郭翔宇，等.糖痹康對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2015，8(7):798 －802.

［7］張巖，穆曉紅，孫文，等.糖痹康對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)Keap1/Nrf2信號(hào)的作用機(jī)制［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2016，31(5):1822 －1827.

［8］呂翠巖，張勝容，徐暾海，等.中藥復(fù)方糖痹康改善氧化應(yīng)激的分子機(jī)制探討［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2016，34(3):529－531.

［9］ZHAI CM，JIA BY，WANG ZB，et al.Nrf2-NF-κB pathway axes，epigenetic regulation and traditional Chinese medicine(natural medicine)to treat type 2 diabetes［J］.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2016 ，41(23):4314 －4319.

［10］COUDRIETGM， DELMASTRO-GREENWOODMM，PREVITE DM，et al.Treatment with a Catalytic Superoxide Dismutase(SOD)Mimetic Improves Liver Steatosis，Insulin Sensitivity，and Inflammation in Obesity-Induced Type 2 Diabetes［J］.Antioxidants(Basel)，2017 ，6(4):E85

［11］JI ZH，LIU ZJ，LIU ZT，et al.Diphenyleneiodonium Mitigates Bupivacaine-Induced Sciatic Nerve Damage in a Diabetic Neuropathy Rat Model by Attenuating Oxidative Stress［J］.Anesth Analg，2017 ，125(2):653 －661.

［12］YANG X，YAO W，LIU H，et al.Tangluoning，a traditional Chinese medicine，attenuates in vivo and in vitro diabetic peripheral neuropathy through modulation of PERK/Nrf2 pathway［J］.Sci Rep，2017，7(1):1014.

［13］SZTANEK F，MOLNRN MOLNR ，BALOGH Z.The role of oxidative stress in the development of diabetic neuropathy［J］.Orv Hetil，2016 ，157(49):1939 －1946.

［14］MCDONNELL C，LENEZ S，POL O.The induction of the transcription factor Nrf2 enhances the antinociceptive effects of delta-opioid receptors in diabetic mice［J］.PLoS One，2017，12(7):e0180998.

［15］THIPKAEW C，WATTANATHORN J，MUCHIMAPURA S.Electrospun Nanofibers Loaded with Quercetin Promote the Recovery of Focal Entrapment Neuropathy in a Rat Model of Streptozotocin-Induced Diabetes［J］.Biomed Res Int，2017，2017:2017493.

［16］SHI Y，LIANG XC，ZHANG H，et al.Combination of quercetin，cinnamaldehyde and hirudin protects rat dorsal root ganglion neurons against high glucose-induced injury through Nrf-2/HO-1 activation and NF-κB inhibition［J］.Chin J Integr Med，2017 ，23(9):663－671.

［17］方朝暉，吳以嶺，趙進(jìn)東.糖尿病周圍神經(jīng)病變中醫(yī)臨床診療指南(2016年版)［J］.中醫(yī)雜志，2017，58(7):625－630.

R573.1

B

10.3969/j.issn.1001 －6910.2017.11.32

1001－6910(2017)11－0070－04

劉銅華，北京中醫(yī)藥大學(xué)，教授，thliu@vip.163.com

國家自然基金項(xiàng)目(81202970);教育部新世紀(jì)人才項(xiàng)目(NCET－12－0805)

2017－10－19;

2017－11－16(編輯 陶 珠)