葉海南

蛇床子素通過c-met/PI3K/AKT途徑提高順鉑對肺癌細(xì)胞的殺傷活性

葉海南

目的 探討蛇床子素是否能提高順鉑對肺癌細(xì)胞的殺傷活性并研究其機(jī)制。方法 A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞按對照組、蛇床子素組、順鉑組、蛇床子素+順鉑組及蛇床子素+順鉑+c-met質(zhì)粒組進(jìn)行分組后，MTT法檢測A549細(xì)胞活力，Western blot實驗檢測A549細(xì)胞蛋白酪氨酸激酶（cmet）表達(dá)水平，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）磷酸化水平及半胱天冬酶（caspases）活化水平的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞的凋亡。結(jié)果 順鉑+蛇床子素組A549的細(xì)胞活力抑制率[（59.8±3.5）%]顯著高于順鉑單治療組[（16.9±1.2）%，P＜0.05]和蛇床子素+順鉑+c-met質(zhì)粒組[（21.6±1.5）%，P＜0.05]。蛇床子素處理可誘導(dǎo)A549細(xì)胞c-met蛋白的下調(diào)并抑制A549細(xì)胞PI3K和AKT的磷酸化。順鉑+蛇床子素組對A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)率[（29.7±2.1）%]顯著高于順鉑組[（7.8±0.9）%，P＜0.05]和蛇床子素+順鉑+c-met質(zhì)粒組[（10.1±1.5）%，P＜0.05]。順鉑+蛇床子素組A549細(xì)胞的Caspase-9、Caspase-3活化水平顯著高于順鉑組和蛇床子素+順鉑+c-met質(zhì)粒組。結(jié)論 蛇床子素通過下調(diào)c-met表達(dá)提高肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。

A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞；蛇床子素；c-met；PI3K/AKT；順鉑

順鉑屬于廣譜抗腫瘤藥物，對多種腫瘤細(xì)胞均有很好的殺傷活性。在順鉑的臨床應(yīng)用中，肺癌細(xì)胞對順鉑最為敏感，因此順鉑現(xiàn)已作為一線藥物廣泛應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌的治療[1]。然而隨著順鉑的持續(xù)使用，肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性會逐漸降低[2]。因此通過輔助治療藥物提高肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性是提高其療效的有效方法。本研究的目的在于探討蛇床子素是否能提高順鉑對肺癌細(xì)胞的殺傷活性并研究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試 劑 順鉑、蛇床子素、噻唑藍(lán)（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）和凋亡檢測試劑盒購于美國Sigma-Aldrich。改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）購于美國Gibco。蛋白酪氨酸激酶（c-met）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）、活化半胱天冬酶-9（caspase-9）、活化半胱天冬酶-3（caspase-3）、β-肌動蛋白（β-actin）、兔抗人抗體購于美國Cell Signaling。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒購于美國 Pierce。pcDNA3.1和脂質(zhì)體 2000（Lipofectamine2000）購于美國Invitrogen。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 本研究于2014年10月—2016年11月完成于本院實驗室。人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購于美國模式菌種收集中心（ATCC）。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。細(xì)胞每2～3天傳代一次，傳代時，用胰酶消化液使細(xì)胞進(jìn)入懸浮狀態(tài)并用DMEM培養(yǎng)基洗滌兩次，將細(xì)胞懸液按1:3稀釋后傳代。

1.3 c-met重組質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 將c-met基因cDNA全長序列（Gene ID：NM_001324401）以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成c-met重組真核表達(dá)質(zhì)粒[3]。使用Lipofectamine2000按照試劑操作說明書步驟將2μg/mL c-met質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞中。

1.4 細(xì)胞活力抑制率測定 實驗分為對照組、蛇床子素組、順鉑組、蛇床子素+順鉑組及蛇床子素+順鉑+c-met質(zhì)粒組，分組培養(yǎng)方法見表1，藥物處理時間為48h（藥物處理48h即能發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)）。藥物處理完畢后加入 20μL MTT（5mg/mL）37°C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，移除孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入100μL二甲亞砜，570nm波長下測定OD值。細(xì)胞活力抑制率用以下公式計算：抑制率=（OD對照組-OD藥物處理組）/OD對照組×100%。

表1 A549細(xì)胞實驗分組方法

1.5 Western blot實驗 將A549細(xì)胞按上述進(jìn)行分組。藥物處理完畢后用蛋白提取液提取A549細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)。將等量的總蛋白質(zhì)用12%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用c-met、磷酸化PI3K、磷酸化AKT、活化 Caspase-9、活化Caspase-3和β-actin兔抗人抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

1.6 細(xì)胞凋亡實驗 將A549細(xì)胞按上述進(jìn)行分組。藥物處理完畢后按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入細(xì)胞中孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡，Annexin-V陽性細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對順鉑有協(xié)同抗肺癌作用 順鉑和蛇床子素單獨治療對A549細(xì)胞的殺傷活性較弱，兩者聯(lián)合后能顯著誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生死亡（見表2）。Western blot實驗結(jié)果顯示，蛇床子素處理能顯著下調(diào)A549細(xì)胞c-met蛋白的表達(dá)水平，而順鉑處理對c-met無影響（見插頁圖1）。同時，在A549中轉(zhuǎn)染c-met質(zhì)粒強(qiáng)制表達(dá)c-met蛋白后，蛇床子素對順鉑的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)受到明顯抑制（見表2）。

表2 各組細(xì)胞活力比較（%，±s）

表2 各組細(xì)胞活力比較（%，±s）

注：蛇床子素濃度均為10μmonl/L，順鉑濃度均為 2μmol/L，c-met質(zhì)粒濃度為2μg/mL；與順鉑組比較，#P＜0.05，與蛇床子素組比較，amp;P＜0.05，與順鉑+蛇床子素組比較，□P＜0.05；c-met：蛋白酪氨酸激酶

組別對照組順鉑組蛇床子素組順鉑+蛇床子素組順鉑+蛇床子素+c-met質(zhì)粒組孔數(shù)3 3 3 3 3細(xì)胞活力抑制率0 16.9±1.2 8.7±0.7 59.8±3.5#amp;21.6±1.5□

2.2 各組PI3K/AKT表達(dá)水平比較 Western blot實驗結(jié)果顯示蛇床子素能顯著抑制A549細(xì)胞PI3K和AKT的磷酸化。當(dāng)轉(zhuǎn)染c-met表達(dá)質(zhì)粒后，順鉑聯(lián)合蛇床子素對PI3K/AKT途徑的抑制作用顯著降低，表明蛇床子素通過下調(diào)c-met蛋白的表達(dá)增強(qiáng)順鉑對PI3K/AKT途徑的抑制作用（見插頁圖2）。

2.3 各組A549細(xì)胞Caspases的活化和凋亡率比較流式細(xì)胞實驗結(jié)果顯示蛇床子素能顯著提高順鉑對A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)率，而轉(zhuǎn)染c-met質(zhì)粒能顯著抑制兩者聯(lián)合對A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)（見表3，插頁圖3）。蛇床子素能顯著促進(jìn)順鉑對A549細(xì)胞caspase-9和caspase-3的活化（見插頁圖4）。

表3 各組A549細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率比較（%，±s）

表3 各組A549細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率比較（%，±s）

注：蛇床子素濃度均為 10μmonl/L，順鉑濃度均為2μmol/L，c-met質(zhì)粒濃度為2μg/ml；與順鉑組比較，#P＜0.05，與蛇床子素組比較，amp;P＜0.05，與順鉑+蛇床子素組比較，□P＜0.05；c-met：蛋白酪氨酸激酶

組別對照組順鉑組蛇床子素組順鉑+蛇床子素組順鉑+蛇床子素+c-met質(zhì)粒組孔數(shù)3 3 3 3 3凋亡誘導(dǎo)率2.2±0.4 7.8±0.9 6.1±0.8 29.7±2.1#amp;10.1±1.5□

3 討論

非小細(xì)胞肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[4]。在肺癌的治療中，以順鉑為代表的化療是不可替代的常規(guī)治療方法，但腫瘤細(xì)胞對化療逐漸產(chǎn)生的耐藥性卻大大限制了其療效[5]。

蛇床子素是從天然植物蛇床子中提取的活性物質(zhì)，近年研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素還具有良好的抗腫瘤作用，對多種惡性腫瘤均有良好的輔助治療作用[6-7]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)蛇床子素能顯著增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，使較低劑量的順鉑亦能發(fā)揮強(qiáng)大的殺傷腫瘤細(xì)胞的生物活性的作用，證明蛇床子素與順鉑存在協(xié)同抗肺癌活性。

文獻(xiàn)[8-9]報道，腫瘤細(xì)胞中PI3K/AKT通路的持續(xù)活化能通過激活下游分子促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，同時抑制凋亡的發(fā)生，然而腫瘤細(xì)胞中的PI3K和AKT往往磷酸化程度很高，因此抑制PI3K/AKT通路是提高抗腫瘤藥物療效的重要策略。研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞PI3K/AKT通路受肝細(xì)胞生長因子受體c-met的調(diào)節(jié)，高表達(dá)的c-met能激活腫瘤細(xì)胞中包括PI3K/AKT在內(nèi)的多種促進(jìn)腫瘤存活和生長的信號通路。因此c-met途徑是誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生對順鉑獲得性耐藥的重要機(jī)制，過表達(dá)的c-met能顯著激活PI3K/AKT通路減弱抗腫瘤藥物的凋亡誘導(dǎo)活性[12]。本研究結(jié)果顯示蛇床子素對肺癌細(xì)胞進(jìn)行處理后，細(xì)胞c-met的表達(dá)水平顯著降低，使c-met/PI3K/AKT通路受到抑制。當(dāng)用蛇床子素和順鉑對肺癌細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合治療時，由于腫瘤細(xì)胞的PI3K/AKT受到顯著抑制，因此順鉑能顯著誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生caspases的活化和凋亡的發(fā)生。

綜上所述，蛇床子素能顯著提高非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤活性。

［1］ Pei K，Zhu JJ，Guo JY，et al.MicroRNA-185-5p modulates chemosensitivity of human non-small cell lung cancer to cisplatin via targeting ABCC1［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2016，20（22）：4697-4704.

［2］ Xie S，Tu Z，Zhang Q，et al.CXCR4 promotes cisplatin-resistance of non-small cell lung cancer in a CYP1B1-dependent manner［J］.Oncol Rep，2017，37（2）：921-928.

［3］ Zhu C，Li Y，Gao R，et al.Gene transfer of c-met confers protection against D-galactosamine/lipopolysaccharide-induced acute liver failure［J］.Dig Dis Sci，2012，57（4）：925-934.

［4］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013［J］.CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30.

［5］ Ko JC，Zheng HY，Lin YW，et al.Salinomycin enhances cisplatin-induced cytotoxicity in human lung cancer cells via down-regulation of AKT-dependent thymidylate synthase expression［J］.Biochem Pharmacol，2016，122：90-98.

［6］ Lin YC，Lin JC，Way TD，et al.Osthole inhibits insulin-like growth factor-1-induced epithelial to mesenchymal transition via the inhibition of PI3K/Akt signaling pathway in human brain cancer cells［J］.J Agric Food Chem，2014，62（22）：5061-5071.

［7］Gao Z，Wen Q，Zou S.Osthole augments therapeutic efficiency of neural stem cells-based therapy in experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.J Pharmacol Sci，2014，124（1）：54-65

［8］ Cheng HW，Chen YF，Chen JJ，et al.Cancer cells increase endothelial cell tube formation and survival by activating the PI3K/Akt signalling pathway［J］.J Exp Clin Cancer Res，2017，36（1）：27.

［9］Xie CQ，Zhou P，Chen JW，et al.Triptolide exerts pro-apoptotic and cell cycle arrest activity on drug-resistant human lung cancer A549/Taxol cells via modulation of MAPK and PI3K/Akt signaling pathways［J］.Oncol Lett，2016，12（5）：3586-3590.

［10］Yao Y，Dou C，Liu Q，et al.MACC1 suppresses cell apoptosis in hepatocellular carcinoma by targeting the HGF/c-MET/AKT pathway［J］.Cell Physiol Biochem，2015，35（3）：983-996.

［11］ Trovato M，Torre ML，Cannavò S，et al.HGF/c-met system targeting PI3K/AKT and STAT3/phosphorylated-STAT3 pathways in pituitary adenomas：an immunohistochemical characterization in view of targeted therapies［J］.Endocrine，2013，44（3）：735-743.

［12］ Ozasa H，Oguri T，Niimi A，et al.Significance of c-MET overexpression in cytotoxic anticancer drug-resistant smallcell lung cancer cells［J］.Cancer Sci，2014，105（8）：1032-1039.

Osthole Enhances Cisplatin-induced Cell Death in Lung Cancer Through c-met/PI3K/AKT Pathway

YE Hainan.
Clinical Laboratory,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310000),China

Objective To investigate the effect of osthole on enhancing the cytotoxicity of cisplatin to lung cancer and the underlying mechanism.Methods A549 lung cancer cells were divided into control group,osthole group,cisplatin group,osthole+cisplatin group and osthole+cisplatin+c-met plasmid group.MTT assay was performed to evaluate the viability of A549 cells in each group.Western blot analysis was performed to detect the expression of c-met,phosphorylation of PI3K and AKT and activation of caspases in A549 cells in each group.Flow cytometry analysis was performed to measure the apoptotic rate of A549 cells in each group.Results Cell viability inhibitory rate of A549 cells in cisplatin+osthole group （59.8±3.5）%was significantly higher than cisplatin group[（16.9±1.25）%,P＜0.05]and cisplatin+osthole+c-met plasmid group[（21.6±1.5）%,P＜0.05].Treatment with osthole significantly inhibited the expression of c-met as well as enhancing the inhibition of PI3K and AKT phosphorylation.Cell apoptotic rate of A549 cells in cisplatin+osthole group（29.7±2.1）%was significantly higher than that in cisplatin group[（7.8±0.9）%,P＜0.05]and cisplatin+osthole+c-met plasmid group[（10.1±1.5）%,P＜0.05].Activation of caspase-9 and caspase-3 in cisplatin+osthole group was more remarkable than that in cisplatin group and cisplatin+osthole+c-met plasmid group.Conclusion Osthole enhances cisplatin-induced cell death in lung cancer through c-met/PI3K/AKT pathway.

A549 non small cell lung cancer;osthole;c-met;PI3K/AKT;cisplatin

浙江省立同德醫(yī)院檢驗科（杭州 310012）

（收稿：2017-02-20 修回：2017-05-30）